系统生物学小抄.doc

系统生物学的定义：系统生物学是系统性地研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成以及在特定条件下这些组分间的相互关系，并通过计算生物学建立一个数学模型来定量描述和预测生物功能、表型和行为的学科。系统生物学的工作流程对选定的某一生物系统的所有组分进行研究，构建系统模型。系统地改变被研究对象的内部组成成分或外部生长条件，观测系统所发生的相应变化，整合全部信息把通过实验得到的数据与根据模型预测的情况进行比较，并对初始模型进行修订。是根据修正后的模型，设定新的改变系统状态的实验，重复第二步和第三步，不断地通过实验数据对模型进行修订和精练。系统生物学研究的4个问题：系统结构的阐述；系统行为的分析；控制系统的方法；如何设计系统遗传图谱又称连锁图谱或遗传连锁图谱：指基因组内基因和专一的多态性DNA标记相对位置的图谱。遗传作图的DNA（分子）标记：第一代：限制性片段长度多态性；第二代：简单序列长度多态性；第三代：单核苷酸多态性标记物理作图：定义：以一段已知核苷酸序列的DNA片段（限制性酶切位点、序列标签位点等）为标记,以Mb或Kb作为图距绘制的基因组图。 基本要素：路标、单位、顺序、可复制的DNA片段为什么要进行物理作图？遗传学图谱分辨率有限；遗传学图谱精确度有限物理作图的基本原理：物理图谱的本质是路标和克隆测序；单一克隆或重叠克隆都不是图谱，重叠克隆的延续可以制成图谱，克隆末端的数量决定了可排DNA片段的数量文库的概念：含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体 宿主：能容纳外源DNA片段的生物体，常用的有大肠杆菌、酵母等载体：能携带外源DNA进入宿主细胞的工具，常用的载体有质粒载体、噬菌体载体、细菌人工染色体等作为载体的基本要求：能在宿主细胞中进行独立的复制； 具有多克隆位点，可插入外源 DNA片段；有合适的筛选标记，如抗药性；大小合适，易于分离纯化；拷贝数多序列图谱： 以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。既包括课转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的综合。转录图谱： 把mRNA先分离、定位，再转录成cDNA，这就构成一张人类基因的转录图，cDNA片段又称表达序列标签(EST)，因此转录图也称为表达序列图。人类基因组计划的测序：绘制人类基因组的高分辨率遗传图谱；绘制人类级某些模式生物基因组的各种物理图谱；确定人类及某些模式生物的DNA全序列；收集、储存、传播和分析所得资料；发展用于此研究的一系列新技术。测序策略：全基因组散弹法；逐步克隆法 全基因组散弹法(鸟枪法)：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体（如M13噬菌体）；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。 优点：不需要高密度的图谱；速度快、简单、成本低缺点：拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域,主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组逐步克隆法：是在鸟枪法基础上发展起来的两种方法的比较：全基因组霰弹法 ： 基因组DNA-霰弹法克隆-测序并进行全基因组序列组装-完整的基因组序列；逐步克隆法：基因组DNA-BAC文库-根据物理图谱正确定位的BAC 或contig-用于霰弹法测序的候选克隆-用于霰弹法测序的亚克隆-测序并组装第一代DNA测序技术：Sanger法 双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)链末端终止法为测序基础，以四色荧光标记的ddNTP为终止剂，采用毛细管电泳技术取代聚丙烯酰胺平板电泳，使4个测序反应物在一根毛细管内电泳。毛细管末端配有激光照射装置，诱发出不同的发射波长的荧光，经光栅打到CCD摄像机上同步成像，经电脑转换将光信号转换为DNA序列。第二代DNA测序技术：边合成边测序罗氏454测序平台：焦磷酸测序：通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测测序的反应体系：反应酶：DNA聚合酶三磷酸腺苷硫酸化酶，荧光素酶，双磷酸酶；反应底物：磷酰硫酸，荧光素焦磷酸/单克隆测序原理步骤：单链DNA模板被合成互补链，4种dNTP按碱基互补配对原则次序结合到模板上，每当一个dNTP成功结合到模板时会释放焦磷酸(ppi)，其释放量与结合进入DNA的dNTP数量一致。ppi被硫酰酶催化形成ATP，ATP促进荧光素酶氧化荧光素，这些酶促反应能实时发射出荧光被CCD相机记录下来。 454测序流程1. 文库准备2. 连接接头:在单链DNA的3端和5 端分别连上不同的接头3. 形成微反应器4. 扩增5. 测序6. 数据分析提取基因组DNA并切割成80-120bp片段并变性成单链后加一个专门接头使DNA片段与琼脂糖凝胶小球结合。此小球与一种进行PCR反应的混合乳胶小滴结合。DNA扩增在乳胶小滴中进行，扩增使小球充满某一段DNA的107拷贝。乳胶小滴破裂，DNA链变性，携带单链DNA克隆的小球沉淀进入光学纤维片的井中，在井中完成单克隆测序并用CCD相机记录计算机分析并得出结果454测序技术的特点:速度快;读长长;通量高;准确度高Illumina测序的基本原理：可逆终止法，边合成边测序电子克隆的概念:利用两端有重叠序列的EST可以组成全长的CDNA序列。电子克隆原理：选定的EST序列进入DNA序列库中进行对位排列，寻找片段端部能互补配对的一致性序列，从而使EST的末端得以延伸。获得第一轮配对延伸的片段后再继续第二轮对位排列，如此反复进行有望将多个EST组装起来直到找到起始密码子和终止子。功能基因组学：利用结构基因组学所获得的各种信息，建立与发展各种技术和实验模型来测定基因及基因非编码序列的生物学功能。目的：基因功能的发现，基因表达分析及突变检测。比较基因组学：研究不同物种基因组的异同，目的：寻找物种间共有的，即在进化上保守的基因或DNA序列，这些基因具有重要的生物学功能，也可以寻找人类可能具有的新基因，以及预测新基因功能。转录组：狭义：从一个细胞的基因组中被转录出来的全部mRN广义：一个细胞、组织或生物体的全部RNA的集合体，其他也包括非编码的RNA。转录物的复杂性主要来自mRNA转录组学：对转录水平上发生的事件及其相互关系和意义进行整体研究的一门科学基因表达谱芯片-高通量mRNA表达分析技术：将cDNA或寡核苷酸片段固化在芯片上；将待测样品（处理组）与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交；通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。芯片制备：寡核苷酸芯片的优缺点：优点：可以通过原位合成法制备；探针长度小，减少二级结构形成；减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因；无需扩增，防止扩增失败影响实验；杂交温度均一，提高杂交效率 缺点：当寡核苷酸序列较短时， 单一的序列不足以代表整个基因，需要用多段序列cDNA芯片的优缺点：cDNA芯片的优点序列长度长，可直接检测待检mRNA；结合敏感性强；信号强度大；cDNA芯片的缺点：探针退火温度差异大 ；存在非特异性交叉杂交C(t)值：C代表循环，T代表阈值；荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数实时定量PCR的定量原理：浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量；模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数就越少，即Ct值越小。染色质免疫沉淀技术步骤：在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段；然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段；通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息染色质免疫共沉淀-芯片技术（ChIP-on-chip）： 检测蛋白质-DNA相互作用原理：某蛋白因子如果能与某片段DNA结合，当它们结合后就可用此蛋白质因子的抗体将结合物拉出来，于是洗提DNA，克隆和标记DNA制成探针与基因组的覆瓦式微阵列杂交，便能辨别其在基因组中的结合位点非编码RNA从长度上来划分可以分为三类：小于50nt， 包括miRNA，siRNA，piRNA； 50nt到500nt，包括rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, SLRNA, SRPRNA等等；大于500nt, 包括长的mRNA-like的非编码RNA，长的不带oply尾巴的非编码RNA等等。端粒酶RNA：端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA聚合酶。端粒酶的作用是催化端粒延伸,保证染色体复制完整。核糖核酸酶p：是一种5端内切核酸酶，负责切除tRNA前体5端的附加顺序形成成熟的tRNA5端。反义RNA抑制基因表达。RNA干扰、miRNA蛋白质组定义：一个基因组、一个细胞或一种生物体所表达的全部蛋白质蛋白质组学定义： 以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)步骤：制胶；IPG在SDS平衡液中还原和烷基化；一向胶转移至二向胶上；电泳；蛋白质检测。等电聚焦电泳：根据不同蛋白质的等电点不同，将蛋白质加到含有不同pH值的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白质样品在此凝胶中移动到与其等电点相同的pH梯度处后净电荷为零，在凝胶中不再移动，也就是相同等电点的蛋白质聚焦在相同pH梯度处，从而把不同等电点的蛋白质分开双向凝胶电泳：利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。第一向：等电聚焦电泳 IEF；第二向：SDS-PAGE质谱基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分子量。(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF-MS、电喷雾离子化质谱ESI-MS)蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列：是在固体表面上固定千万种纯化的蛋白质、多肽作为捕捉分子，如抗体、受体或酶和其他小分子蛋白质，用带标记（或不带标记）的抗原、配体、酶底物或其他蛋白质与阵列的捕捉分子进行结合检测，以测定相应蛋白质的性质、特征及蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法。肽质量指纹谱鉴定技术：蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上切下，经过原位酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的精确质量，即获得了肽质量指纹图谱酵母双杂交系统：是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个转录因子模块结构的遗传学方法。基本原理：典型的真核Gal4转录因子都含有二个结构域: DNA结合结构域；转录激活结构域；二个结构域功能上相互独立又互相依赖，只有结合才具完整活性。酵母双杂交系统的组成：与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白；与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白流程：研究蛋白质X和Y之间的相互作用，将X与BD共表达形成融合蛋白，将Y与AD共表达形成融合蛋白，若蛋白质X和Y可发生相互作用，则报告基因表达酵母双杂交系统的改进 SRS原理：Sos蛋白是人类的Ras通路中鸟苷酸交换因子，定位于细胞质中。能使非活化型Ras-GDP转化为活化型Ras-GTP，从而激活Ras通路，使细胞生长；Cde25是酵母中Sos蛋白的同功能蛋白，定位于内膜，它的突变型为温度敏感型，即突变型的酵母细胞在36度下不能生长；Sos蛋白在酵母中与Cde25作用相同反向双杂交系统：使用URA3作为报告基因，URA3正常情况下参与尿素的合成，如果培养基中掺有5-氟乳清酸(5-FOA)，URA3则将其转化成对细胞有毒的物质。因此能够表达URA3的酵母在掺有5-FOA的培养基中不能生长。当两种蛋白质能够相互作用而激活URA3表达时，酵母被杀死，只有两种蛋白质不具有相互作用时酵母才能存活糖组：是生物细胞或个体中全部聚糖的总称糖组学：是研究糖组结构与功能的科学，主要是对聚糖 与蛋白质间相互作用和功能进行全面研究（糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。） 参与蛋白质糖基化的酶：糖基转移酶：合成寡糖并将它转移到蛋白质上进行连接；糖苷酶：修正及降解聚糖（糖基化变化常是糖基转移酶活性的反应）糖蛋白：是由酶将一个或多个聚糖加合在最初的多肽链上，修饰范围从蛋白质上连接单糖，到密集、复杂、有侧链结构的聚糖，以及具有复杂的氨基葡聚糖侧链的蛋白质多糖。（分布：细胞膜、溶酶体、细胞外液）蛋白质糖基化的分类N-糖基化: 糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处；O-糖基化: 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr等侧链的羟基处；GPI-Anchor糖基化: 蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。双向凝胶电泳分离糖蛋白的2个改进第一向等电聚焦电泳的改进：重泡涨： IPG胶条在单纯水化液中泡涨杯状进样法：采用杯加样方式，于胶条的酸性端或碱性端引入待分离的蛋白 染色方法的改进 针对糖蛋白原则：对特殊的多糖部分进行染色PAS染色：通常使用过碘酸-Schiff试剂(PAS)染色凝集素检测：更灵敏的方法是将凝胶印迹后用凝集素检测糖蛋白代谢组的定义：一个细胞中参与一般代谢反应和维持生长与正常功能所需要的全部天然小分子（仅限于非多聚化合物）代谢组学概念：定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学代谢组学的研究方法毛细管电泳（CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术。优点：高效、快速、微量和自动化（粒子的迁移速度除与电场强度和介质的特性有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离）有效淌度：在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为有效淌度。电渗现象与电渗流： 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流。电渗流的方向：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极。气相色谱：利用样品混合物中各组分理、化性质的不同以及在两相间分配系数的差异, 当两相相对移动时，各组分在两相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。两相中，固定不动的一相称固定相；移动的一相称流动相高效液相色谱（4种）液-固吸附色谱：溶质、溶剂在固体表面的竞争吸附就是溶质、溶剂和吸附剂三者之间相互作用的综合结果。 液-液色谱又称分配色谱:与气相色谱相同，试样组分分子在流动相和固定相中扩散速度不同，即溶解度不同，产生不同的分配系数离子交换色谱: 组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。样品中被交换离子与交换剂上的固有离子的亲和力大，则其置换交换剂吸附流动相溶剂离子，移动速度慢，保留时间长，后流出色谱柱；亲和力小，则在色谱柱中移动速度快，保留时间短，先流出色谱柱。(分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离).排斥色谱（凝胶色谱）:体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱，称排除；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，称为完全渗透，然后又从孔隙中出来随流动相流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。(分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离)傅里叶变换红外光谱产生的条件：辐射应具有能满足物质产生振动跃迁所需的能量；偶极矩发生改变。优点信噪比高：所用的光学元件少，没有光栅或棱镜分光器，降低了光的损耗，而通过干涉进一步增加了光信号，因此到达检测器的辐射强度大，信噪比高；重现性好：傅里叶变换红外光谱仪采用的傅里叶变换对光的信号进行处理，避免了电机驱动光栅分光时带来的误差，所以重现性比较好；扫描速度快：傅里叶变换红外光谱仪是按照全波段进行数据采集的，得到的光谱是对多次数据采集求平均后的结果，而且完成一次完整的数据采集只需要一至数秒，而色散型仪器则需要在任一瞬间只测试很窄的频率范围，一次完整的数据采集需要十分钟至二十分钟。核磁共振：是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程（并不是是所有原子核都能产生这种现象，原子核能产生核磁共振现象是因为具有核自旋。）原理原子核的自旋：核磁共振主要是由原子核的自旋运动引起的。不同的原子核，自旋运动的情况不同，它们可以用核的自旋量子数I来表示。具有磁矩的原子核，是核磁共振的研究对象产生核磁共振的首要条件是核自旋时要有磁矩产生，I0用“整合”与“干扰”研究代谢网络的四步：提出半乳糖利用模型：确定基因组中所有基因和组成代谢途径的基因、蛋白质和其它小分子。运用遗传学和生化分析的研究结果，建立调节代谢途径的分子相互作用的初始模型。在上述模型基础上，对GAL途径进行20种初步干扰。是否能将观察到的mRNA和蛋白质的变化归于细胞中基础的相互作用调节。最后，所观察到的GAL基因的应答与预测相比结果如何。提出新的假设，解释模型没有预测到的现象表型组：一个有机体所有特征、特性的总和表型组学：从整体上研究表型的科学环境组（针对患者）：影响患者的全部外界环境的总和细胞芯片：细胞芯片是一种高通量的技术,它能在芯片上实现对细胞的原位检测,以多参数高通量的形式直接获得与细胞相关的大量功能信息.同时,利用显微技术和纳米技术能精确地控制细胞内的生化环境,便于详细研究以揭示细胞内一系列过程和原理的本质.组织芯片： 一般是将数十至上百个甚至更多小的组织整齐有序地排列在一张载玻片上而制成缩微组织芯片系统：一组相互作用，相互联系或相互依赖的组分所形成的一个复杂统