中山大学博士论文-一个肌萎缩侧索硬化症大家系的连锁分析研究.pdf

中山大学 博士学位论文 一个肌萎缩侧索硬化症大家系的连锁分析研究 姓名 席静 申请学位级别 博士 专业 神经病学 指导教师 张成 Robert Brown 20041001 一个肌萎缩侧索硬化症大家系的连锁分析研究 中文誓要 一个肌萎缩侧索硬化症大家系的连锁分析研究 专业 神经病学 博士生 席静 搏士导师 张成教授P r o f R o b e r tB r G w n 中山大学附属第一医院神经科广州 5 1 0 0 8 0 M a s s a c h u s e a sG e n e r a lH o s p i t a l D a yN e u r o m u s c u l a rL a b o r a t o r y R o o m3 1 2 5 B 1 吨1 1 4 1 6 s t r u t C h a d e s t o v n M A0 2 1 2 9 中文摘要 1 肌萎缩侧索硬化症的临床特征 肌萎缩侧索硬化症 a m y o t r o p h i cl a t e r a ls c l e r o s i s A L S 是一种成年起病的慢 性退行性病变 以反层 脑干及脊髓的运动神经元逐滔死亡为特征 A L S 患者的 上 下运动神经元同时受累 一般不影响感觉系统 智能和认知一般不受侵犯 运动皮层的运动神经元变性引起临床可见的上运动神经元损害体征 如H o f f m a n n 征 B a b i n s k i 征 阵挛 脑干 脊髓的下运动神经元损耋可 i 起肌萎缩 纤颤 患 者表现为进行性的肌肉无力 萎缩 肌肉跳动和腱反枣亢违 病理反射阳性 本 病以男性多见 男 女比例约为l5 2 1 西方报道平三匀发病年龄5 5 5 8 岁 通常 在首发症状出现后3 5 年死于呼吸肌麻痹 年龄谭鏊后羔界范霭内的发病率是 05 3 1 0 万人 患病率是4 6 1 0 万人 2 A L S 定位研交现状及存在的问题 尽管进行了大量的研究 A L S 的病因至今不明 虽然大多数的病例是散发的 S A L S 大约1 0 的A L S 病例是家族性的 F A L S 在约2 0 的F A L S 病例中 已证实铜锌超氧化物歧亿酶 S O D 基因突变是明确的病目 其余8 0 的F A L S 病例的病因有待于发现 由于F A L S 及S A L S 在临床 病理上惊人的相似性 F A L S 研究成为了A L S 研究的焦点 近年来 全世界的研究者对选定的排除了S O D l 突交的F A L S 家系 进行了全基因组扫描 连锁分析以试图发现新的致病基因 他们多采用3 0 0 4 0 0 二尘坐量塑型墨堡垡堡荃墨至望墨堂坌堑堕墨 皇羔至 个微卫星多态标记 标记同平均距离约1 0 1 4 c M 的基因组扫描方法 目前为止 对于单纯的家族性肌萎缩侧索硬化癌 已发现至少8 个致病位点 其中3 个基因被 定位 A L S l 呈常染色体显性遗传 成人起病 基因定位于2 tt 2 2 2 是由于S O D l 基因突变所致 该基因产物与细胞抗氧化功能有关 A L S 2 呈常染色体隐性起病 在儿童或青少年起瘸 基因定晓于2 q 3 3 3 5 是由于M s i n 蛋自基因突变所致 该基 匿编码一个具有三个乌嘌呤的睃昔酸交搜因子 a l s i n 功能尚不清楚 可能与调节 胞膜的组织 分子胞内运动有关 A L S 3 呈常染色体显性遗哮 成人起病 基因 定垃予1 8 q 2 l A L S 4 呈常染邑体显性遗传 儿童或青少年起病 基因定位于9 q 3 4 是由于S e n a t 出x i n 基因突变所致 该基因产物可能与R N A 损伤修复有关 A L S 5 呈 眷染色体隐 生起瘸 儿童或首少年起病 基因定位于1 5 q 1 5l q 2 1l A L S 6 呈常 染色体显性 成人起病 基因定泣于1 6 q 2 l A L S 7 呈常染色体显性 成人起病 基因定泣与2 0 p 1 3 最近 一个研究小组将一个呈常染色体显性 成人起瘸的家系 定谴于2 0 q 1 3 对于家族整护萎缩铡索硬化症合并痴呆 以及肌萎缩铡素硬化症台 并痴果 帕金森综合症 目前已有两个位点被定位 家族性肌萎缩劂素硬化症合并 颧颓叶痴呆定垃于9 q 2 1 2 2 肌萎缩侧索硬化症合并痴呆 帕金森综合症定位于 1 7 0 2 1 自A L S l 发现l O 多年来 全世界数l O 个实验室 对数百的排除了S O D I 基因突变的F A L S 家系进行基因缀扫描 连锁分析 嬗我们从前面的息结可知道 绝大多数的F A L S 家系目前尚未定位 其中有一个主要原因 缺乏能达到连锁分 析所需要的统计力量的太的F A L S 家系 而且 由于肌萎缩铡索硬化症是一种中 老年起病的神经变性疾病 很多情况是 即使当发现该家系时 该冢系大部分患 病成员己死亡 无法获得上一代的具体信息 更无法获得血标本 致使宝贵的科 研资源丢失 不仅是患者的损失 也是全世界科研工作的巨大损失 3 本研究的目的和研究方案 我国有大量关于移发性及家族性肌萎缩测索硬化症的临床报道 很多文章描 述非常详细 优秀 但至今为止 尚未见对任一个F A L S 家系i l 差行基因组扫描 连锁分婚躬报道 在中国帆萎缩铡索诤化症的家系中 尚无 个位点秽定位 本 研究中 我仃对一个己排除J S O D 基因笑变的6 代 2 3 7L E I 中同广东的大的 F r 也S 家系遵行了基因组钽籀研究以试图发现潜芷的病因 本研究采f j4 1 0 个微卫 是多态际记对该家系成是进行扫描 分折 获辱了一个可能的位点 多态标记 一个肌萎缩侧索硬化症大蒙系的连锁分析研究t l 文麓要 D 1 7 0 在重组值0 0 町 纺予我们最大的两点L O D 值 2 2 当将疾病位点置于 多态标记D 1 S 2 3 7 0 和D S 1 6 1 2 时t 最大的三点L O D 值是 1 4 草倍体 于据在l p 3 6 确定了 个可能的2 67 5 c M 的候选区霞 介1 二多态标记D I S l 6 u 8 和D 2 7 2 8 之问 材科和方法 实验材料 家族性肌萎缩侧索硬化症 F A L S 家系 该F A L S 家系来于广东省南海县 它包括6 代计2 3 7 人 见图1 从患病家 系成员的临床表现来看 本组病例绝大多数于5 0 岁前出觋胍肉萎缩 无力 发病 后进展快 肌肉萎缩 无力持续6 个月到2 年 个别达到3 年 然后几乎所有的 患病成员均死于由呼吸肌无力及萎缩所致的呼吸衰竭 但本组病例有一个特点 大多数病例在出现肌肉萎缩之前先表现为时间长短不定的肌肉纤敷期 持续时间 从几个月到长达2 0 年 然后进展到肌肉的无力和萎缩 并逐渐出现胍电图异常 如果以出现肌肉纤颤为发病年龄 则大约为3 0 4 0 岁之间 如果以出现肌肉萎缩 无力为发病年龄 则平均发病年龄为4 7 平均死亡年龄约4 9 士5 男女均见发 病 比例约为l l 几乎每一个患者均有一个患病的父母 符合誊染色体显性遗 传的特点 在临床表现上 该组瘾例以航束颤动 肌肉萎缩 腱反射亢进及魂期球麻痹 为特点 符合A L S 的临床表现 E M G 显示典型运动神经元损害特点 未见传导速 度改变及传导阻滞等 达到A L S 的诊断标准 共1 3 人诊断为患考 色括明确死于 该病的7 个该家系成员和另外6 个表现了肌肉萎缩 无力及E M G 显示确切运动神 经元损害的6 人 由于连锁分析需要根据完整家系资料的资料进行分析的本质决 定 我们尽可能从所有签署知情同意书的该家系成员中援集到血标本并纳入家系 分析 但在具体的工作中 为了使分析工作更简洁 明了 我们将家系中的所有 的患病成员纳入 如集某患病家系成员己死亡 则纳入他 或她 的配偶 子女 同胞等以帮助重建其单倍型 如果某一该家系成员及他 或她 的以下两代均无 成员患病 则将其剔出分析 从而构成我们的核心分析家系 共5 9 人 2 方法 2 1 收集家系资料及血标本采集 一个肌萎缩侧索硬化莲大家系的连锁分析研究 中文篝要 我们与该家系研究的联系人员 也是发现并推荐该家系的医疗人员进行联系 在得到该家系的家庭成员同意后 由两个医生 两个助手组成的医疗小组与该家 系成员接触 得到知情同意书后 采集血标本 记录病史 查体并有一个初步的 诊断意向 诊断标准 明确死子陵瘸 或具 明确的至少一个区域 延葭 颈髓 胸麓 腰骨匿髓 具有上 下运动 申经损害的体症 肌宅图显示提示神经原性损享 并有高波幅 宽时限的运动电 泣 运动和感觉传导速度正常 但远端运动传导的潜伏期可延长 没有传导阻潜 无感觉簿碍体征 扩约胍功能障碍 规觉蟑碍 明显梭物摊经功能薄碍 帕金套 病洋锥体外系体征 b J z h e i m e r 癍 排除其它可引起该表瑗的神经科情掘 如颈陛 病等 2 2 基因组扫描 根据尽可能获得最多的遗传信息并重建死亡患者的蕈倍体型的原则 我们从 所获得的4 7 份血标本中选出2 4 份进行基因纽扫描 基因组扫描是通过使用多态 标记引物对选定的2 4 跨血标本进行P C R 扩增 分离产物 分析所得的图象 将数 据存入数据库 汁算两点L O D 值 必要时计算多点L O D 值 对感兴趣韵区域道 一步增加多态际记密集扫描并进一步分昕 重建单倍体型 2 2 1 选择进行基因组扫描的多态标记 从C o o p e r a t i v eH u m a nL i n k a g eC e n t e rH u m a nS c r e e n i n gS e tW e b e rv e r s i o n8a n d 8 A 建立在欧洲资睾耳的基础上 首先选出约3 5 0 个多态标记 它f 1 覆盖2 2 条常 染色体 各多态标记之间的平均距离为1 0 1 4 c M 3 5 0 个多态标记中 有1 4 个多态标记 岜们的多态性在遗传多态标记图里是 足够的 样本资料来自欧洲 可是在我们的家系里其多态性不够 从而不能给我们 提供足够的信息 另有1 5 个多态标记 尽管我们反复尝试 但P C R 扩增效果非第 差 我们均在多态标记图里在该多杰标记附近援虱相应的其它多冬标记替代它们 加上我们罔来密集丑描候选区域的3 1 个多态标记 我n 晤f 该家系敏扫描4 1 6 个多 态酶记 增加的5 j 令多态标记选自h f a r s h f i d 研究中心筋多志标 三雷 h y l i r c s e a r c h m a r h f i e d c l i n i c o r 掣g e n t j 4I t 个多悉标记审 1 6 是二核苷 一个肌萎缩侧索硬化症大家系的连锁分析研究中文蕾要 酸重复多态标记 1 4 是三核昔酸重复多态标j i 7 0 是四核苷酸重复多态标记 2 2 2P C R 扩增反应 霰们的所有顺岛引物包 括同5 扩1 申的 9 个碱基 与荧光标记的M 1 3 寡竣苷 酸互孙 从而使得在P C R 扫 增时能在产物中 入荧光物质 M 1 3 引物添加碱基对顺序 F o r w a r d5 C A C G A C G T T G T A A A A C G A C 一3 R e v e r s e5 G G A T A A C A A T T T C A C A C A G G 3 2 2 3P C R 扩增条件 D N A 2ul 7 5 p g m 1 弓f 物0 1uI 2 0 1 2M R G 2 5lpi 或R G1 5 R G 2 0 R G 3 0 d N T P2u l 1 0 0 l a M 1 T a q0 1u i 5 0 0 0 U m 7 0 0 或8 0 0 荧光标记0 2 口 i 双蒸水46 l 总容量为l O l 反应条件 初始交性为9 5 5 分钟 接着3 0 个循环 每个循环包括 5 8 01 分钾 5 1 6 l 取决于不同的多态标记 以5 3 最常用 1 分钟2 秒 7 2 1 分 钟 最后在7 2 延伸6 分钟 2 2 4P C R 产物分离 P C R 后 我们将P C R 产物与2p i 的加样反应物混合 9 5 加热1 分3 0 秒镑 交性 知撵入4 8 孑L 梳 在6 的多聚丙烯酰胶凝胶上走样 经过2 3 小时 蜊A 片段就分离开来 使用3 7 7 D N A 测序仪走样 G e n eS c a n 软件进行采样 2 2 5 图象分析 使用半自动的R F L P 软件进行图象分析 它能自动测叠P C R 产物分离得到的 等位基因产物具体的碱基对大小 荠将其按大小顺序分配数值 2 3 连锁分析 2 3 1L O D 值计算 软件包L I N K A G E F A S T L I N T K v e r s i o n4 0 N a t i o n a lC e n t e rf o rB i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t l o n 的M L I N K 被用来计算疾病与多态标记之间的两点及多点L O D 筐 3 1 假定该家系为常染色体显性遗传方式 标准的A L S 外显率 各多态标记等位基因 频率估计为相等 A L S 疾病频率为O 0 0 1 2 3 2 单倍体重建 使用C y r i l l i c v e r s i o n2 1 C b e r w e l lS c i e n t i f i c P a l o C a l i f 软件来显示家系图 V 一个肌萎缩侧索硬 七茬大蒙系的连锁分析研冗串文奠要 包括单倍体型 当L O D 值大于O8 时 我们对此进行进 步的分析 使用S L L N K 及M o n t eC a r l o 模拟 2 0 0 0 0 次 计算获得该L O D 值的对应的P 值 单蟹体型用 人工重建 并与S I M M A L K v 28 2 W e e k s 1 9 9 5 软件重建的单辔体型进行比较 2 4 突变检测 感兴趣区域的候选墓国的选择是建立在我们现有的对A L S 运动神经元选择性 死亡的理解及认为基因产物撮可能舒声在嘧及运动静经元的基础上 D N A 扩焉夏 滋序往用的寡接管酸引物是浸用 P a l m e r 3W h i t e h e a dI n s t i t u t ef b fB i o m e d i c a l R e s e a r c h 设计的 引物的特异性是狠据B L A S T 搜索己知的人类D N A 顶孛证实 荧光染色测序是使用标准的方案 通过自动测序仪 B e c k m a nC o u l t e r I n c 2 0 0 2 收集测序结果 并使用S e q u e n c e r 1 9 9 1 1 9 9 9 G e n e C e d eC o r p o r a t i o n 舒轿 结果 l 家族性舰萎缩侧索硬化症 A L S 家系临床及血标本收集情况 该F A L S 家系来于广东省南海县 它包括6 代 第 代2 人 第二代I O 人 第三代3 2 人 第四代 9 人 第五代1 0 3 人 第六带n 人 共计2 3 7 人 见图1 其中 前三代均己死亡 无资科 己载 第三代死于该疠患者韵涛漉均有兰少五个 以上宜系亲属回忆 证实 第四代约为5 0 7 0 岁闻 第五代约为2 0 4 0 岁间 第 六代约为几岁 在2 3 7 人中 有5 9 人纳入核心家系研究 共1 3 人诊断为患者 包括明确死 于该病的有7 个成员一第3 代5 人 第四代2 人 均未获得盘标本 但第4 代2 人得到医生及E M G 检查确诊和表现了肌肉萎缩 无力及肌电圈显示确切运动神经 元损害的有6 人 该6 人中 1 人已死于研究之前 获得肌电图记录 但无血标本 另5 人当时有轻微肌肉萎缩 无力 厦硬症状 其中 男2 人 女3 人 平均年 龄4 0 7 肌电图显示明确异常确诊 见图2 从签署知情同意书的所有家系 成员中 我们共收集到4 7 份血标卒 我们从中选出2 4 人避行微卫星多态拆记基 因咀扫描研究 2 基因组扫描 L o D 值计算 基因翅扫描等到了1 5 个天于n 8 的两点L O D 值 多态标记D S 1 6 i 2 任0 o 一个肌萎缩侧羲硬化症大家系的连锁分析研究 l p 文奠妻 给予我们景大的两点L O D 使1 8 4 j 表1 当使用更多的多态标记对该两区域进 行密集扫描W D 1 S 2 8 7 0 给予两点L O D 值 2 2t 见表2 多点L O D 僮计算显示 痪病位点位于D 1 2 8 7 0 和D 1 S 1 6 1 2 之问 得到了最大的三点L O D 值41 4 见图 8 这是非常有意义的 3 连锁分析 单倍体型重建 1 号染色体上的该候选区域的重组分折显示有一个染色体片段可能与疾病相 连锁 患者 在该心家系图中的4 0 及2 6 号成员 的重组介定了一个长达2 6 7 5 c M 的片段 其着丝粒端重组发生在多态标记D 1 S 2 6 6 7 和D I S 2 7 2 8 之间 端粒端重组 发生在D I S l 6 0 8 和D 1 S 2 1 4 5 之阔i 见图9 1 0 所有明确的在标准下认为患病 的个体均携带有该革倍体型 部分未患病个体亦带有该单倍体型 这很可能反应 了不完全或年龄依赖的外显率 在该区域广泛的基因塑测定并未发现纯合性增加 或存在大的缺失的证据 4 基因突变的检测 l p 3 6 该候造区域 具体说来是l p 3 63 2 1 p 3 62 1 之间 共包含了大约1 2 9 个基 因 见图1 2 1 3 N C B IH o m os a p i e n sm a pv i e w e r 建立在我们目前对A L s 患者 运动神经元选择笠死亡的理解及假定候选基因产物很可能分布在脑或运动神经元 的基础上 我们菩先选择了三个可能的候选基因K I F I B K C N A B 2 和D J l 进行测 序 目前 在所检测的井显子中 我们未觅到突交 显示部分测序结果 见图1 3 结论 1 完成了砖一个排除S O D I 基因突变的6 代 共计2 3 7 人的常染色体显性遗 传 成年起病的丈的F A L S 家系的4 1 0 个微卫星多态标记基因组扫描 2 基因组拦接多态标记D 1 S 2 8 7 0 在0 0 给予我们最大的两点L O D 值2 2 2 当使用更多的多态标记对该两区域进行密集扫摧 多点L O D 值计算及单倍体分析 时 在疾病位点位于D i 2 8 7 0 和D I S l 6 1 2 之间甜 得到了最大的三点L O D 值4 1 4 单倍体分析介定了一个位于l p 3 6 介于多态标记D I S l 6 0 8 和D 1 2 7 2 8 之间的一 个可能的新的F A L S 候选区域 3 该候选区域包括1 2 9 个基因 已完成三个候选基因的测序 6 9 个外显子 在所测的外显子 尚未发现突变 一V I I 一个乳萎缚唰蓉爰也震大家系的琶锬分橱研竞 审文 妻 创新点 1 国内首次对一个F A L S 家系进行馓卫星多态标记基困组扫描及连锁分析 2 将一个大家系的基因定位于I p 3 6 为克隆该基因打下良好的基础 关键词 薮萎缩僵 索硬化症家族慧氍萎缩测索硬化症徽卫量多态标记 薰譬7 岔适锁分所 V I I I 一个肌萎缩侧索硬化症大家系的连锁分析研究 英文麓要 L i n k a g ea n a l y s i so f al a r g ef a m B i a la m y o t r o p b i c l a t e r a ls c i e i o s i sp e d i g r e e M a j o r N e u r o l o g y p h Dc w z d i d a t e J i n gX i S u p e r v i s o r P r 醇C h e n gZ h a n gP 醇R o b e r tB r o w n D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y t h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fS u nY a t S e n U n i v e r s i t y G u a n g z h o u 5 1 0 0 8 0 M a s s a c h u s e t t sG e n e r a lH o s p i t a lE a s t D a yN e u r o m u s c u l a rL a b R o o m31 2 5 B l 呜11 4 1 6 t hs w e e t C h 捌e s t o w n M 气0 2 1 2 9 A b s 仃a c t B a c k g r o u n d A m y o t r o p h i c a t e r a ls c l e r o s i s A L S i s a na d u l t o n s e t d e g e n e r a t i v ed i s o r d e r c h a r a c t e r i z e db yt h ed e a t ho fm o t o rn e u r o n si nt h ec o d e x b r a i ns t e m a n ds p i n a lc o r d T h e p a t i e n t sp r e s e n tw i t hp r o g r e s s i v em u s c l ew e a k n e s sa n da t r o p i y a n dd e a t hO C C U R S f r o mr e s p i r a t o r yp a r a l y s i su s u a l l yw i t h i n3 5y e a r so fs y m p t o mo n s e t T h ea g e a d j u s t e d w o r l d w i d ei n c i d e n c ei s0 5 3p e r1 0 0 0 0 0w i t h o u to b v i o u sr a c e r e l a t e dd i f f e r e n c e sa n d t h ep r e v a l e n c ei s5 1 0p e r1 0 0 0 0 0 T h eu n d e f l y i n gc a u s eo fA J Sr e m a i n su n k n o w n d e s p i t eaw e a l t h yo fh y p o t h e s e s a b o u ti t sm e c h a n i s ma n dc a n d i d a t eg e n e sA l t h o u g hi tc o m p r i s e so n l y 10 o fc a s e s f a m i l i a lA L Si sc o m m o n l ys t u d i e d t ht h ea i mo fm a p p i n gt h eg e n e f s t h a tc a u s eo F p r e d i s p o s et oA L SM u t a t i o n si nt h eC u l Z ns u p e r o x i d ed i s m u t a s e S O D l lg e n ec a u s e 2 0 o fF A L S T h eg e n e s r e s p o n s i b l ef o rt h er e m a i n i n g8 0 o fF A L Sr e m a i nt ob e f o u n d I d e n t i f i c a t i o no fF A L Sg e n em a yl e a dt Oag r e a t e ru n d e r s t a n d i n go ft h e m e c h a n i s m so fc e l ld e a t hi na l lf o r m so fA L Sa n dp o s s i b l yp r o v i d el i g h ti n t ot h e u n d e r s t a n d i n go fo t h e rn e u r o d e g e n e r a f i v ed i s e a s e T h i sw i l lf a c i l i t a t ee f f e c t i v et h e r a p i e s U pu n t i ln o w t h e r ea r ea l t o g e t h e r8l o c ia n d 3g e n e sh a v e b e e nf o u df o rp u r et y p eo f A L S 止e r ea r e2l o c if o rA L S D e m e n t i aa n dA L S P a r k i n s o n i s m b u tt h e r ei sn os i n g l e l o c u sh a sb e e nl o c a t e di nC h i n e s eA L S p a t i e n t s U s i n g al a r g eC h i n e s ef a m i l i a lA L S F A L S lp e d i g r e ew i t h o u tS O D lm u t a t i o na n d i t ha u t o s o m a l d o m i n a n ta d u l to n s e tA L Sm o d e w eh a v ei d e u t i f i e dap o s s i b l en e w I X 二竺墨薹鎏鲤垂堡 量壅奎墨墨塑墨望坌蔓量塞 茎塞篁里 l o c u sb y p e r f o r m i n gag e n o m e w i d es c a nw i t h41 0m i c r o s a t e t l i t e sm a r k e r s T h e m PCR筛选mSOD1基因阳性鼠作为实验观察对象 观察其行为学变化 绘制生长曲线 记录神经传导速度及肌电情况 苏木精 伊红染色法观察股二头肌标本病理学变化 尼氏染色法进行中枢神经系统的神经元计数 实验过程中对动物的处置 符合动物伦理学标准 结果 繁殖并扩增了肌萎缩侧索硬化症模型的种群 PCR法成功筛选出了mSOD1基因的阳性鼠 mSOD1阳性鼠在生长过程中逐渐出现四肢 运动障碍 体质量急剧降低且很快死亡 发病鼠神经传导速度减慢 肌电显示出自发的纤颤电位 肌纤维发生萎缩 中枢神经系统的神经元丢失明显且有部 分神经元发生空泡样变 结论 mSOD1转基因阳性的肌萎缩侧索硬化症模型大鼠可表现出与人类疾病的相似症状 生物学各项指标变化明显 是理想的肌萎缩 侧索硬化症研究模型 5 期刊论文 黄慧 张成 席静 姚晓黎 邱国光 熊符 HUANG Hui ZHANG Cheng XI Jing YAO Xiao Li QIU Guo Guang XIONG Fu 家族性肌萎缩侧索硬化症转基因鼠的繁殖和鉴定 南方医科大学学报2006 26 3 目的建立家族性肌萎缩侧索硬化症 FALS 转基因模型鼠的繁育方法 并对其子代鼠进行基因鉴定 方法 1 以6只B6SJL SOD1G93A 半合子雄鼠与6只 B6SJLF1 J 雌鼠 1 1 交配 2 由鼠尾血提取基因组DNA PCR扩增hmSOD1基因的片段 电泳后观察结果 3 对PCR产物进行纯化测序 并通过BLAST验证 结 果6对种鼠交配产鼠仔53只 存活率为98 52 53 G93AhmSOD1阳性鼠约占44 2 23 52 PCR扩增产物分别为内对照 IL 2 324bp Tg hmSOD1 236 bp 测 序证实PCR产物的基因序列和hmSOD1基因片段中的序列一致 并存在G93A突变 结论B6SJL Tg SOD1 G93A 1Gur J雄鼠与B6SJLF1 J雌鼠配种能成功繁育出 Tg hmSOD1 阳性的ALS半合子子代鼠 本实验的PCR法能准确鉴定hmSOD1基因阳性鼠 并证实该转入的基因按近似孟德尔方式遗传 为ALS实验研究奠定了基 础 6 期刊论文 黄慧 张成 家族性ALS的SOD1基因突变及发病机制研究进展 国外医学 神经病学神经外科学分册 2004 31 6 肌萎缩侧索硬化症 ALS 是运动神经元病的最常见类型 部分家族性肌萎缩侧索硬化症 familial ALS FALS 与超氧化物歧化酶 SOD1 基因突变相关 本文介绍人的正常SOD1和突变SOD1基因及其表达蛋白的特点 并简述人突变SOD1的转基因模型 也对FALS中突变SOD1的致病机制进行了总结和探讨 为 ALS的研究和治疗策略提供新的思路 7 期刊论文 王进 罗杰峰 梁秀龄 家族性肌萎缩侧索硬化症患者及家系成员血中铜 锌超氧化物歧化酶活性及丙二 醛水平变化与临床分型的关系 中国临床康复2004 8 7 背景 不同的铜 锌超氧化物歧化酶 Copper Zinc superoxide dismutase Cu ZnSOD 基因突变会使家族性肌萎缩侧索硬化 family amyotropbic lateral sclerosis FALS 产生不同的临床特征 丙二醛是过氧化脂降解的中间产物 可间接反映 Cu ZnSOD的活性 但 Cu ZnSOD活性及丙二醛水平改变与 FALS临床分型之间的关系尚不明确 若能探明前两者与后者的关系 将有助于 FALS的临床分型及亚临床诊断 目的 探讨家族性肌萎缩侧索硬化症患者及 家系成员 Cu ZnSOD活性和丙二醛水平变化及 FALS的临床分型 设计 随机病例对照研究 地点和对象 1998 09 1999 06共检测 7个家系的 32名成员 其中 3例先证者经中山医科大学第一附属院神经内科确诊 1995年 4例经广西医科大学附属第一医院神经内科确诊 1997 1999年 将 32名成员分 为 4组 汉族血统中有临床表现或有肌电图异常者归为第 1组 共 10例 各项检查均正常者的为第 2组 共 17例 壮族血统家系中有临床表现或肌电图异 常者归为第 3组 共 3例 无临床表现 各项检查均正常者归为第 4组 共 2例 72例对照组 第 5组 均来自 1999 01 1999 12到我院健康体检自愿者 其中男 38例 女 34例 年龄 15 59岁 平均 38 2岁 方法 采用生物化学方法测定红细胞内 Cu ZnSOD活性及丙二醛水平 主要观察指标 外周血 SOD活性及丙二醛水平 结果 第 1组 Cu ZnSOD活性为 316 68 46 15 kat g 丙二醛水平为 8 08 1 60 mol L 1 100溶血液 其中 有 4例 Cu ZnSOD活性低于正常值 3例丙二醛水平高于正常值 后者与前中的 3例为相同患者 无临床症状 第 2组 Cu ZnSOD活性为 351 74 28 42 kat g 丙二醛水平为 6 55 0 87 mol L 1 100溶血液 其中有 2例 Cu ZnSOD活性低于正常对照组 6例 Cu ZnSOD活性低于正常值者及 3例丙二 醛水平高于正常值者均集中见于 2个家系 并且与同组其他成