一种高选择性的汞离子荧光探针研制毕业设计.doc

一种高选择性的汞离子荧光探针研制毕业设计 录第一章 绪论11.1 前言11.2 汞离子荧光分子探针研究进展21.2.1 罗丹明类汞离子荧光分子探针21.2.2 香豆素类汞离子荧光分子探针51.2.3 萘酰亚胺类汞离子荧光分子探针71.2.4 卟啉类汞离子荧光分子探针91.2.5 氟硼二吡咯(BODIPY)类汞离子荧光分子探针111.2.6 8-羟基喹啉类汞离子荧光分子探针131.2.7 其它汞离子荧光分子探针141.3 本课题研究目的、意义及主要内容151.3.1 研究目的及意义151.3.2 研究内容17第二章 实验部分182.1 仪器与试剂182.2 化合物的合成182.3 测量过程19第三章 结果与讨论213.1 探针分子的设计与合成213.2 光谱性质213.3 pH影响243.4 选择性243.5 响应时间263.6 小结26附录一 探针分子MS、1H NMR和13C NMR表征35附录二 文献综述38附录三 外文翻译46附录四 外文原文61ii一种高选择性的汞离子探针研制1第一章 绪论1.1 前言过渡金属及重金属广泛地存在于自然界中, 其中的一些元素(如铜、锌等)在生命过程中具有非常重要的功能，而另外一些元素(如铅、汞、镉等)则在很低浓度时就对生物体具有极强的毒性1-8。对这些物质的检测尤其是活细胞内重金属离子成像检测对生命、环境和医学科学等具有重要的意义。目前已经建立的测定金属离子的方法，主要有原子吸收（ASS)9/发射光谱法(AES)10，分光光度法11-14，高效液相色谱法(HPLC)15，电感祸合等离子体质谱法(ICPMS)16，化学发光法17，电化学法(极谱法和伏安法)18-19，荧光分析法20-27等。原子吸收分光光度法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、应用范围广等优点，目前已经成为各个部门、教学科研单位普遍使用的一种分析测试方法。其缺点是测定难熔元素的灵敏度不高；而且，测定每种元素都需要一个特定元素的空心阴极灯，这对同时测定试样中多种元素颇为不便。此外，该方法不能反映所测元素的价态。分光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法，此方法具有灵敏度高、操作简单、仪器价格便宜等优点。但是，由于过渡金属离子结构和离子半径差别不大，在光度分析中常彼此干扰，导致测定方法的选择性不理想。ICPMS法和HPLC法所需仪器昂贵，样品预处理复杂，操作也比较繁琐。化学发光法选择性较差，不适于低浓度的生物样品的测定。电化学方法测定金属离子主要有极谱法和伏安法，具有灵敏、快速和简单的优点，应用较为广泛。与上述检测方法相比，荧光检测法不仅方法简便，而且在灵敏度、选择性、响应时间、现场测定(如荧光成像技术)及生物应用等方面均有其突出优点。近年来，荧光分析法在金属元素的分析中的应用越来越广泛，从天然水，饮用水到废水污水，从土壤大气到动植物，从人体的头发骨骼血液到内脏等各个器官涉及到的样品等几乎是无所不有。荧光分析法具有很高的灵敏度，还具有选择性好、重现性好、取样量少、简洁快速的优点。荧光检测的方法主要有荧光生成、荧光碎灭、催化荧光等。随着一些新科学技术的引入还产生了诸如同步荧光、导数荧光、三位荧光等新技术，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展。荧光分析法的灵敏度准确度和选择性不断提高。而且，最近荧光成像技术得到了快速的发展，主要是在生物分析领域中广泛应用。近年来，关于金属离子荧光探针的研究发展迅速，多种荧光探针已被设计合成用于测定金属离子。其中过渡金属和重金属离子荧光探针更是成为科技工作者研究的热点。基于光诱导电子转移(PET)、光诱导分子内电荷转移(PCT)、分子内共振能量转移(FRET)等机理所设计的Mg2+、Zn2+、Cu2+ 等荧光探针是研究最广泛的几种，其中一些探针己经可以跨膜在细胞内对较低浓度的金属离子进行荧光成像检测。锡，汞等金属离子荧光探针也有相关报道，但这些探针分子大都存在不同缺陷，只有少数实现细胞内荧光成像，极大限制了在生命体中对这些痕量金属离子的实时原位检测。1.2 汞离子荧光分子探针研究进展汞在自然界主要以元素汞、无机汞和有机汞三种形式存在。有机汞的毒性大于金属汞和无机汞化合物，因而更容易发生中毒。汞及其污染物可以通过火山喷发、采矿、固体废弃物焚化等各种各样的自然的以及人为的过程而广泛分布，从而污染大量的水、空气和土壤，并且通过环境中细菌的作用，汞元素和汞离子都可以被转化成甲基汞,即使是在很低的浓度也可以进一步通过食物链富积于人体中。各种形态的汞及其化合物都具有高度的化学反应活性，它能与体内蛋白质、酶和核酸等生物分子中的羧基和磷酸基等官能团发生强烈缔合，进而扰乱细胞分裂和神经子传递等生命过程，对人的健康有极大的损害。同时它对大脑、骨骼、肾脏以及中枢神经，免疫以及内分泌等系统都有不同程度的毒害作用。1953年发生在日本的“水俣病”便是典型的例子。环境中的汞污染主要来源于工业使用的汞，如化学工业中用汞作催化剂,各种汞制仪表等。大气中的汞来自汞矿开采冶炼、煤和石油燃料燃烧等。由于汞对人类生存环境的持续破坏及其对人类健康的不良影响，发展一种低成本、高选择性、响应快速、应用范围广的检测汞的新方法具有十分重要的意义。近年来，利用荧光分子探针技术检测汞离子成为科学家们研究的热点之一。根据 Hg2+ 对探针分子荧光光谱的影响，Hg2+ 荧光分子探针的类型主要有“on-off”型,“off-on”型,比率型荧光探针三种28。目前，可以用作汞离子荧光分子探针的物质种类繁多29-31。按发色团分类，常见的有罗丹明类、香豆素类、萘酰亚胺类、卟啉类、氟硼二吡咯(BODIPY)类和8-羟基喹啉类等，这些化合物对汞离子均表现出较好的荧光响应，并且具有较高的灵敏度和选择性。1.2.1 罗丹明类汞离子荧光分子探针罗丹明和荧光素是典型的呫吨类荧光染料，它们具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高、荧光发射波长位于可见区等特点，被广泛应用于荧光染料和荧光分子探针的设计32-34。呫吨类化合物是典型的“off-on”型荧光探针，分子含闭合螺环，其摩尔吸光系数和荧光量子产率非常低，几乎没有荧光；当加入某种响应离子后，其螺环发生断裂，从而产生荧光。根据“off-on”机理设计合成的呫吨类汞离子荧光探针报道很多35-38，但多数探针的灵敏度和选择性不够高。2006年，Zheng等39 考虑到硫原子对 Hg2+ 强的配位作用，将罗丹明酰肼中羰基上的氧原子换成了硫原子设计出探针1，只换一个原子而成功地改变其识别性能，即罗丹明B 酰肼选择性地识别Cu2+，而罗丹明B酰肼上的O原子换成S原子后可选择性地识别Hg2+ 。研究结果表明在水溶液中，该化合物能选择性地检测Hg2+ ，检测限度达到10-7 M，且化合物与Hg2+ 配位的比例为2:1。2008年，Zhan等40报道了将罗丹明B内酯结构中的氧原子换成硫原子得到化合物2。研究结果表明在pH =4的缓冲溶液中(乙腈:水=1:99)，该化合物能选择性地检测Hg2+ ，检测限为2.110-9 M，化合物与Hg2+ 配位的比例也为2:1。 2008年，Suresh等41以罗丹明 6G 为母体引入苯甲酸合成了可用于Hg2 和Cu2 的区分和检测的探针分子3。分别向探针的甲醇水溶液(VV1:1)中滴加Hg2 和Cu2 后，在534和528 nm处各自形成了一个新的强吸收峰，并伴随着溶液颜色由无色变为粉红色，其它的金属离子没有这种现象。探针溶液在加入Hg2 后 554 nm处的荧光辐射增强90倍，而Cu2+没有这种现象，这是由于具有 d9电子层的 Cu2 淬灭荧光所致。研究证明羧基氧参与络合与 Hg2 形成2:1结构的络合物，与Cu2 则形成1:1结构的络合物。Tang等42利用Hg2+ 诱导脱去有机硒的反应，设计了基于荧光素衍生物的“off-on”型探针4。该探针本身是一种没有荧光的化合物，向其水溶液中加入Hg2+ 后，有机硒基团脱去，荧光素内酯环打开，从而产生荧光，该探针对Hg2+ 具有较高的灵敏度和选择性，其检测下限可达1.0 nM，低于美国环保局(USEPA)规定的饮用水标准上限(2 ppb，10 nM)。该探针分子并被成功应用于 RAW 264.7 细胞中Hg2+ 成像，对研究Hg2+ 在活体组织中的生物活性具有重大意义。 Kim等43报道了两个罗丹明腙衍生物探针5和6，两者对Hg2+ 显示出选择性荧光和比色，内酰胺的开环反应导致显著的荧光增强和色度变化。探针溶液（CH3CN/H2O，v:v=1:99）加入Hg2+ 后，在最大发射波长处荧光强度约分别增强10倍和50倍。通过检测探针5/6对Hg2+的荧光变化，作图可以看出荧光强度的变化与汞离子浓度的对数在1 nM1 mM范围内呈线性关系，且检测限分别为1 nM和4.2 nM。在探针与Hg2+ 的混合物中加入过量KI呈现出荧光减弱，这表明该探针与Hg2+ 的相互作用是可逆的。而且，工作曲线法证实了探针5与Hg2+ 配位比例为2:1，探针6与Hg2+ 配位比例为1:1。此外，两种探针均能使暴露于汞离子纳摩尔浓度下线虫体内Hg2+ 的积累可视化。 2009年，Huang等44应用软硬酸碱理论(SHAB)，将罗丹明酰肼改为硫代酰肼提高配体的酸性，得到 Hg2 探针7。探针开环生成硫负离子参与络合，对Hg2 显示出杰出的选择性并可以在比较宽泛的酸碱范围 (pH 5.512.0) 内响应。探针溶液(DMF/H2O, vv11)加入Hg2 后565 nm处的吸收明显增强，585 nm处出现了强荧光辐射同时溶液由无色变为浅红色。在探针7的基础上将苯环改为吡啶环衍生得到Hg2 探针8，可用于纯水中Hg2的可逆性检测。吡啶环的引入进一步增强了对 Hg2 的亲和能力。两者荧光性质基本相似，在优化条件下100 nmol/L的探针溶液的荧光强度与 Hg2浓度在02 mg/L范围内呈线性关系。探针8与Hg2 形成21模式的络合物。 Zhao等45报道一个基于罗丹明荧光团和8-羟基喹啉基的可逆的、选择性的、灵敏的荧光探针9。在82倍当量乙腈-水溶液（95:5，V/V；pH 7.2）加入7倍当量的Hg2+ ，探针9在586 nm处荧光强度增强大于1200倍，同时在560 nm处出现了一个新的吸收峰，且工作曲线法证实了两者是1:1的结合模式，对Hg2+的缔合常数估计为2.18106 M-1。荧光滴定1 mM 该探针，其对Hg2+的检测限为1.14 ppb，信噪比（S/N）为3。实验结果表明，只有Hg2+可以导致该探针光谱发生显著变化，这表明该探针对Hg2+ 具有较高的选择性。碘离子的加入引起探针9对Hg2+ 的颜色和荧光减弱，因而表明该探针与Hg2+ 相互作用是可逆的。HeLa 细胞在该探针中培养后加入Hg2+ ，在荧光显微镜下可以观察到显著的荧光增强。通过间隔基把一个罗丹明染料分子与一个BODIPY染料分子相连，Zhang等46首次巧妙地设计合成了基于FRET机理的细胞内罗丹明Hg2+ 比率荧光探针10。由于 BODIPY 的发射光谱和罗丹明B的吸收光谱可以有效重叠，并且其对环境因素不敏感，故选择 BODIPY 作能量供体，罗丹明B 为能量受体。作者认为引入刚性和共轭程度大的苯基-乙炔基-苯基作为间隔基，荧光能量可以通过化学键由供体向受体进行有效转移(Frster能量转移效率为99% )。探针10 具有灵敏度高(ppb 级)、选择性好、pH 范围宽(410) 等优点。该 FRET荧光“关-开”传感体系具有两个突出优点: (1) 供体激发波长和受体发射波长之差达100 nm，这将有效消除激发散射光对荧光检测产生的任何不利影响；(2) 两个强荧光发射带相距较大使得检测更准确。利用共聚焦荧光显微成像技术此探针可以比率检测MCF-7 细胞中ppb级的Hg2+ 。该工作将对此类基于FRET机理Hg2+ 荧光探针的理论和实际应用具有重要意义。 1.2.2 香豆素类汞离子荧光分子探针香豆素类化合物是自然界中广泛存在的一类重要天然杂环化合物。香豆素类化合物的母体结构为苯并吡喃，近年来香豆素类化合物已成为国内外许多药学工作者的研究重点。研究表明,香豆素类化合物具有多方面独特的生理学和生物学活性，例如：抗高血压、抗凝血、抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗癌等一系列的生物和药用活性。近年来发现香豆素类化合物还具有抗氧化、抗衰老以及抵抗当今危害人类健康的顽症AIDS和肿瘤方面有较好的药物活性，因此倍受国内外学者的关注47。香豆素化合物除具有独特生物活性外，还具有优异的光学特性。香豆素类化合物的母核苯并吡喃是没有荧光的无色物质，但取代后的香豆素衍生物，特别是7位上引入给电子基团,3或4位上引入吸电子基团后，形成推拉电子体系,便得到强荧光物质，同时最大吸收波长和发射波长会发生红移。香豆素作为一类重要的杂环化合物，广泛应用于医药和荧光材料等领域,近年来受到人们的大量关注。利用 Hg2+诱导香豆素衍生物发生化学反应可用来检测Hg2+ 48。2010年，Shiraishi 等49利用Hg2+诱导脱硫反应合成了一种“on-off”型 Hg2+荧光探针11，该探针属于ICT机理，有较广的酸碱适用范围(pH =212)，在其乙腈/水溶液(1：1，VV)中加入Hg2+ ，在445 nm(激发波长342 nm)处的荧光发射发生淬灭。研究结果显示，探针分子的激发态产生分子内电荷转移，从而产生强的荧光，加入Hg2+ 后，Hg2+ 诱导硫脲基团发生了脱硫反应，形成咪唑环结构，导致氨基与香豆素母体的角度发生扭曲，减弱了分子内电荷转移，导致其荧光淬灭。 而其它金属离子均无此催化作用，对Hg2+ 的响应表现出高度选择性。Choi等50合成了一种新的基于硫代香豆素的探针12，该探针在523 nm处表现出很强的吸收带。加入Hg2+ 后溶液颜色从粉红色变为黄绿色，并且在最大吸收峰处伴有有蓝移，从523 nm移至467 nm。吸收光谱中可以观察到在467 nm处的吸收增加，在523 nm的吸收降低，在487 nm处有一个等吸收点。加入100倍当量Hg2+ 前后I467/I523 比率变化了840倍，另一方面，其它金属离子表现出相对恒定的I467/I523 值，为0.30和0.39之间。Hg2+ 滴定探针12实验检测下限为1.710-6 M。探针12在50% HEPES-乙腈缓冲溶液中表现出相对较弱的荧光，荧光集中在511 nm处，加入1倍当量的Hg2+ 后荧光增强了25.8倍，荧光颜色由深绿变为亮绿。测试显示只有嗜硫金属离子Ag+ 在557 nm处显示轻微的荧光增强，其它的金属离子几乎没有变化。金属离子选择性实验表明，探针12无论吸收波长还是发射波长均不受 Na+、K+、 Mg2+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+ 和Pb2+ 的影响，甚至具有代表性的亲硫离子Ag+和Cd2+ 都不会影响。另外对存在潜在的干扰性金属离子的情况也做了研究。在存在100倍当量的其它生理性或重要的环境背景金属离子时，12-Hg2+体系（含有探针12和10倍当量的Hg2+）的荧光受到小于10%影响。 Ma等51研究了一个罗丹明和香豆素荧光团共轭而成的Hg2+ 探针13。在含有50%乙醇(助溶剂)Tris-HCl缓冲液（pH 7.24）中，该探针对Hg2+具有较高的灵敏度和选择性，并且过量Hg2+ 会诱导发射强度增加约24倍，同时在565 nm处出现一个新的吸收峰。探针溶液的发射荧光强度与Hg2+ 浓度在810-8110-5 M范围内呈线性关系。通过工作曲线法可知，该探针与Hg2+ 以1：1的模式络合，络合常数约为1.18106 M-1 。探针溶液中加入EDTA会导致荧光和比色的减弱，这表明该探针与Hg2+ 结合是可逆的。此外，探针13成功地应用于自来水以及河水中Hg2+ 的检测。1.2.3 萘酰亚胺类汞离子荧光分子探针萘酰亚胺作为荧光发色团，具有 Stokes 位移大，荧光量子产率高，光稳定性强，摩尔吸光系数高等优点52-53。Yang等54合成了8-羟基喹啉同萘酰亚胺相连的“off-on”型汞离子荧光探针14，该探针对Hg2+ 具有荧光响应，属于 PET 机理。在浓度为10 mM 的溶液中，对Hg2+ 的检测线性范围为010 mM，当加入10 mM Hg2+ 时，荧光强度可增加4倍，检测下限为 63 nM。Liu等55首先报道出Hg2+促进分子内环状胍基化修饰的荧光探针。在这项工作中，他们合成并研究了一种新的萘酰亚胺衍生物（探针15）。探针15本身是在290 nm处激发，在最大发射波长530 nm处发射暗绿色的光。在探针溶液中加入Hg2+ ，硫脲环在最大发射波长475 nm处形成深蓝色的荧光，并且在最大波长处发生蓝移，这被认为是将硫脲基团引入荧光弱得多的电子贡献基团咪唑啉基团的结果，而这导致在1,8-萘酰亚胺荧光团电子离域内荧光显著减弱。溶液研究揭示了金属离子检测中这种Hg2+ 促进环状胍基化修饰的探针和高选择性的Hg2+ 是以1:1的模式结合的。在Hg2+ 加入5h后荧光颜色发生改变，而Ag+ 则需要20h。金属离子选择性实验表明该探针的荧光不会因其它金属离子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+ 和Pd2+的存在而影响。在探针溶液中加入Hg2+ 会导致在475 nm处发射增强，同时在530 nm处减弱。因此，通过比较加入Hg2+ 前后在475 nm和530 nm处发射强度比，探针15可以实现单激发双发射比率检测Hg2+ 。但是Hg2+ 的检测下限仍然未报道。Leng等56合成了一种与金纳米杂化材料（金纳米粒子）结合的探针16。在DMSO-H2O溶液（1:1,v/v）中，该探针荧光最大发射波长为542 nm，加入Hg2+后会导致其荧光发射显著降低并且出现近12 nm的蓝移。从苯胺亚基到萘酰亚胺发色团的光诱导电子转移(PET)过程形成比较接近的新物质（探针17），该探针是一种高选择性Hg2+ 探针。尽管Ag+与Hg2+ 的反应类似，但其反应活性较低，需要一个更长的时间才能来达到了相当水平的发射强度。而且，同样条件下其它金属离子的存在不会干扰Hg2+ 诱导荧光增强反应，显然该探针对Hg2+ 比Ag+ 具有更高的活性。因此，探针16可以作为一个潜在的Hg2+ 荧光探针。Wang等57-58报道了基于聚酰胺受体的检测水溶液中一组Hg2+ 化学传感器18、19。该传感器均含有萘酰亚胺基团，通过邻苯二胺基PET淬灭荧光团，在pH 7.5（10 nM磷酸盐缓冲溶液）条件下在可见光范围内表现出弱荧光。化合物18量子产率为0.032（em=545 nm），化合物19量子产率为0.007（em=537 nm），加入Hg2+ 后，荧光分别增强5.8和34.7倍，汞离子配合物的量子产率分别为0.19和0.24。滴定法以及工作曲线法表明两种探针与Hg2+ 以1:1形成配合物。两种探针对Hg2+ 具有相似的亲和力(Kd=50 nM，探针18；79 nM，探针19)。荧光增强对Hg2+（加入TPEN则可逆）具有选择性，而对由二价的第一行过渡金属和各种碱金属和碱土金属Al3+、Ag+、Pb+ 和Cd2+ 则没有荧光增强。2011年，Kumar 等59将萘酰亚胺和罗丹明通过苯环连接起来，合成了结构新颖的“off-on”型荧光分子探针20。该探针是首例基于通键能量转移(TBET)机理而设计的以萘酰亚胺-罗丹明为母体的Hg2+ 荧光分子探针，探针在472 nm(激发波长:360 nm)处仅有很弱的荧光(荧光量子产率:0.06)，归因于从罗丹明螺环N原子到萘酰亚胺的光诱导电子转移(PET)，向其THF/H2O 溶液 (9.50.5，vv) 中加入 Hg2+ 后，在578 nm(激发波长: 360 nm)处出现较强荧光发射峰(荧光量子产率:0.54)，归因于探针的 TBET 机理，即Hg2+ 的加入使罗丹明螺环打开后形成酰胺，与 Hg2+ 形成 11配合物，探针分子的萘酰亚胺供体和罗丹明受体之间没有分子内的能量转移，而是整个分子通过化学键实现能量的快速转移，但是这种能量转移并非100% ，会在萘酰亚胺基团产生一些损失。该探针与Hg2+ 结合后的荧光强度比开环的罗丹明B与Hg2+ 形成的配合物的荧光强度高 407 倍。该探针对Hg2+ 有较好的择性，且对Hg2+ 的检测具有可逆性，并能用于前列腺癌细胞(PC3)的成像研究，对从分子层面理解生物过程具有重要意义。1.2.4 卟啉类汞离子荧光分子探针卟啉化合物作为荧光团具有非常好的光学性质,如高的摩尔消光系数,高的荧光量子产率、大的Stokes位移、相对长的激发( 400nm)和发射( 600nm)波长而且对光比较稳定等,是一种理想的荧光物质60。卟啉(Porphyrin)是卟吩(Porphine)外环带有取代基的同系物和衍生物的总称。卟吩是由四个毗咯环和四个次甲基桥联起来的18电子的大环共扼结构，这种结构决定了卟啉既可以利用中心的四个吡咯环上的氮原子络合金属又可以通过叶琳中位和位连接离子载体。因此叶琳类化合物既可以作为荧光信号报告基团,也可以作为识别基团。用不同取代基修饰卟啉，可以导致其配位能力不同，从而改变探针的选择性和灵敏度。2009年，Yang等61以卟啉为母体合成了一系列“on-off”型探针2123。加入Hg2+ 后，3种化合物均可与 Hg2+ 形成 11配合物，其荧光强度发生不同程度衰减。其中22的荧光强度衰减程度最大，这是因为供电子的二甲胺基团使卟啉环的电子云密度增强，与Hg2+ 结合能力增强所致，其荧光响应线性范围为4.010-84.010-6 M，检测下限达8.010-9 M。该探针具有较好的可逆性和选择性，并被成功用于水样检测。2009年，Han等62利用酯化反应将8-羟基喹啉连接到卟啉上，合成了对Hg2+有较好响应的荧光分子探针24，该探针属于比率型荧光探针。Hg2+ 的加入，使得卟啉基团在 646 nm 处的特征荧光发生淬灭，在603 nm 处产生新的荧光。研究表明，Hg2+ 同喹啉基团形成了11配合物。该探针对 Hg2+ 的线性响应范围在310-7210-5 M，检测限可达210-8 M，可在pH =59范围内检测Hg2+ 。随后，Li等63又合成了含萘酰亚胺的卟啉衍生物荧光探针25，该探针也属于比率型荧光探针。在 Na+，K+，Mg2+，Zn2+，Cu2+，Pb2+ 等金属离子共存时，仅选择性识别 Hg2+ ，检测范围为1.010-75.010-5 M，检测限达2.010-8 M，对Hg2+ 的响应时间小于2 min。更重要的是，该探针与Hg2+ 的响应分别在525 nm 和650 nm 处的两个荧光发射峰，波长间隔达125 nm，其原因是探针的两个发光基团可以各自同Hg2+ 形成配合物。利用这一特点，在细胞成像研究中可以有效避免基于波谱移动的比率型探针的荧光光谱重叠问题。卟啉薄膜在玻璃表面沉积已被用作“开-关”型Hg2+ 荧光检测64。薄膜的形成通过卟啉26沉积在六甲基二硅氧烷处理过的玻璃片上，在652 nm处表现出选择性的光吸收带，在720 nm处为发射带 (ex=420 nm)。玻璃片进入10 mM Hg2+溶液中后，卟啉的发射荧光强度降低了10倍，吸收光谱红移也了发生，这表明Hg2+ 与卟啉配合了。重金属离子络合剂TPEN有效地将Hg2+从卟啉去除并使卟啉薄膜恢复原有荧光强度，通过连续浸渍Hg2+ 或TPEN溶液，薄膜至少可以回收六次。薄膜在pH值为5-9范围内是稳定的，加入低于100 mM浓度的其他金属离子，如Cu2+、Cd2+ 和Pb2+ 对其荧光发射的影响可以忽略不计。基于扩展六吡咯环卟啉的近红外发光“开-关”型探针27提供了在甲醇中检测Hg2+ 的方法65。探针27的发射光谱有两个局部极大值，分别在959和1085 nm（ex=514 nm）。此外，在探针溶液中加入Hg2+ ，溶液由红色变为蓝色，最大吸收从543 nm处转移到568 nm处,近红外光谱发射强度减少40倍。十七种金属离子中，仅Hg2+显着促进荧光猝灭，该化合物对Hg2+ 具有显著地选择性。金属结合滴定表明汞与探针27以2:1的模式结合，且探针27对Hg2+ 的检测极限较低为100 nm。 1.2.5 氟硼二吡咯(BODIPY)类汞离子荧光分子探针BODIPY 染料作为一种类次甲基、非离子性的新型荧光标记材料，Zhalg等于1968年首次用 2，4-二甲基吡咯和苯甲醛通过两步“一锅煮”的合成方法制备66。它由硼桥键和甲川桥键把两个吡咯环固定在一个平面上，使分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下，能产生强烈的荧光。与目前用于标记或衍生的荧光物质如荧光素类、罗丹明类、菁染料等相比，BODIPY类荧光染料分子具有高摩尔消光系数和高荧光量子产率、良好的光化学稳定性、激发波长在可见光区、结构易于进行化学修饰、发射波长可调变到近红外、不易受环境和溶液pH值的影响、峰形窄而尖锐、荧光寿命长等优点67。Moon等68通过含 8-羟基喹啉的芳醛与 2,4-二甲基吡咯的缩合反应，制备出一种新型的 BODIPY类衍生物探针28。在水/二氧六环(3/1,V/V)的混合溶剂体系中，探针28产生强的荧光发射，当加入Hg2+ 时，荧光淬灭。尽管 Cu2+ 、Pb2+ 的加入也会引起一定的荧光淬灭现象，但是在加入5倍当量的Hg2+ 时，该探针溶液的荧光发射强度降低了98%，而在加入10倍当量的Cu2+ 或Pb2+ 时，其荧光强度也仅降低不到44%或9%。该探针具有极高的选择性，除对 Hg2+ 以外的其它重金属阳离子Co2+、Ni2+、Zn2+、Cd2+ 等均没有响应。有意义的是，加入Hg2+ 时，化合物的紫外-可见吸收光谱发生了明显的红移(且吸收强度也降低)，溶液的颜色由浅琥珀色变为红色，从而实现了肉眼识别。Hg2+ 与 8-羟基喹啉受体的选择性结合被认为是荧光有效淬灭的结果，它既是人们熟知的配位Hg2+ 淬灭行为，也是基于BDOIPY-酚类化合物中酚-酚盐依赖的荧光减弱型 ON-OFF淬灭。 Yuan等69设计了一个基于PET和CT(分子内电荷转移)双重机理的Hg2+ 荧光探针29，该探针在其meso-位(中位)及3-位具有一个含氮、硫的冠醚受体单元，分别以PET机理和 ICT 机理与 Hg2+ 结合。因为在BODIPY染料母体结构的3-位引入了苯乙烯基结构，使之该探针分子的最大发射波长红移至近红外区达到668 nm。在不加Hg2+ 前，因为PET和ICT的双重作用而导致荧光被淬灭，荧光强度较弱，而加入 Hg2+ 发生络合后，荧光增强超过7倍，且最大发射波长蓝移到578 nm，对 Hg2+ 显示出良好的选择性和高度的敏感性。Jiang等70制备出了一种新型的 BODIPY 染料衍生物探针30，在探针30的乙腈溶液中加入20倍当量的Hg2+ ，其荧光强度增加3倍，而加入40倍当量的其它金属离子如 Ag+、Cr3+、Fe3+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Pb2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Mg2+ 等时，其荧光基本无影响，显示出对 Hg2+ 的高选择性。研究还发现 Hg2+ 的加入也使其紫外-可见吸收光谱发生了明显的红移最大吸收波长由499 nm红移至514 nm，且在502 nm 出现了一个等吸收点，溶液颜色也由浅琥珀色变为桃红色，实现了肉眼识别。作者还利用时变密度泛函理论(TD-DFT)计算发现是Hg2+ 的配位作用影响了中位受体单元的电子特性，改变了非辐射衰变效率，从而增加了荧光强度和吸收光谱红移。 2012年，Zhao等71在增加BODIPY共轭程度的同时，引入了汞离子识别基团，合成了基于PET机理的Hg2+ 荧光分子探针31。该探针属于“off-on”型，直接通过S0S2激发，可高选择性地检测Hg2+ ，荧光强度明显增强，荧光响应线性范围在05.010-6 M，检测下限为13 nM，其它金属离子无干扰。该探针也可用于HeLa细胞成像检测研究。1.2.6 8-羟基喹啉类汞离子荧光分子探针在激发条件下，8-羟基喹啉(8-HQ)的羟基氢和喹啉氮之间发生分子内质子转移(ESITP)72-73，使其荧光淬灭；与 Hg2+ 结合后，分子内质子转移被抑制，其荧光发生增强。因此，基于8-HQ衍生物的汞离子荧光探针一般为“off-on”型74-75。而有些8-HQ衍生物分子本身荧光较强，与Hg2+ 结合后，其荧光发生淬灭，可设计成“on-off”型汞离子荧光探针，但这类探针的报道较少76-77。探针32是在混合溶剂中Hg2+ 的灵敏离子感应器例子之78。由于质子化的羟基基团激发态质子转移反应，在质子溶剂中两个8-羟基喹啉基团发生荧光淬灭(em =540 nm, =0.00005)。在pH值为7条件下，向57倍当量1:1的甲醇/水中加入一倍当量的Hg2+ ，探针32呈现12倍荧光增强，量子产率增加20倍达到0.001；加入一些其它离子也会出现荧光增强，如Cd2+ (3倍)、Zn2+ (3.4倍)，但是对比实验证实，该探针对Hg2+ 的亲和力比Zn2+和Cd2+ 更大(ex=423nm, em=476 nm)。此外，存在过量100倍的碱金属和碱土金属的条件下，该探针对Hg2+ 响应不受影响的。金属结合滴定实验表明Hg2+ 与探针32形成1:1的复合物。Song等75合成和研究了基于8-羟基喹啉（8-HQ）支架的Hg2+的选择性探针33。硫代酰胺一般是容易被氧化的，在这个体系中，硫代酰胺基可以作为基于8-羟基喹啉荧光淬灭的一个强大分子实体79。在30%乙腈水溶液中，硫代探针33在475 nm处表现出非常微弱的荧光，加入各种金属离子，如 Na+ 、K+ 、Mg2+ 、Ca2+ 、Ni2+ 、Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 和Hg2+ 后，结果发现只有Hg2+ 诱导的荧光强度的增强，而且仅需一倍当量Hg2+ ，探针33在479 nm处的荧光强度就增加了167倍，最大发射波长从468 nm转移到479nm。其它有代表性的金属离子的检测显示一个相对恒定的微弱响应，荧光增强倍数小于2.0，但Cd2+例外，荧光增强了3.8倍。Hg2+ 的30%乙腈水溶液滴定探针33揭示了检测限为5.410-7 M。该体系也用实际样品对Hg2+ 进行了分析测试，通过金属离子存在的背景下测量Hg2+ 诱导探针33荧光变化程度评估了其它金属离子可能存在的干扰。在测试过程中发现金属离子 Cd2+和Ag+ 存在干扰，分别降低荧光强度10%和13%，这可能会限制探针33分析含有的高浓度上述两种离子样品的实用性。但是，在具有重要生理作用的金属离子背景下，可以观察到良好的荧光，这证明用于实际样品分析的适宜性。2010年，Tao等80用8-HQ和均苯三甲酸合成了一种酯化的“on-off”型汞离子荧光探针34，对汞离子有较好的选择性，可以与 Hg2+ 形成13的配合物，对探针分子具有荧光淬灭效应，其原因可能是探针分子中的N和O具有给电子效应，Hg2+ 是电子受体，可与激发态的探针分子进行电荷转移，是激发态分子能量转移，故而荧光强度下降。 该探针对Hg2+ 检测的线性范围在030 mM，检测限0.838 mM。该荧光探针的优点是具有对称结构，具有3个相同环境的Hg2+ 结合点，可以产生信号放大效应，并且具有螯合结构，可以提高探针的选择性。1.2.7 其它汞离子荧光分子探针除上述介绍的几种类型外，Hg2+ 荧光分子探针还有很多种81-83。2012年，Wu等84设计了以Nile Blue为母体的 Hg2+ 荧光探针35，该探针属于“on-off”型。探针分子在水溶液中呈蓝色，最大吸收峰在640 nm，加入Hg2+ 后，其在 640 nm 处的吸收逐渐减弱，在 556 nm 出现新的吸收峰，并逐渐增强，溶液颜色变为浅紫色，可作为 Hg2+ 的裸眼识别探针。 以 630 nm为激发波长，pH =7的探针溶液在660 nm 处有较强的特征荧光发射，加入Hg2+ 后，荧光发生淬灭，检出限为0.005 mM，线性范围为0.040.24 mM，对其它离子没有明显荧光响应，对 Hg2+ 表现出良好的选择性。2012年，Quang等85报道了一种席夫碱汞离子荧光探针36，该探针以二甲基氨基苯为发色团，以氨基硫脲作为金属识别基团，当向浓度为1.010-5 M 的该探针的 EtOH/H2O(19，VV)溶液中加入01 倍浓度的 Hg2+ 时，探针的ICT效应得到增强，其荧光逐渐增强，加入过量的 Hg2+ 时，探针可与Hg2+ 形成 21配合物，使得探针分子的荧光逐渐淬灭，其它金属离子(Pb2+ 、Cd2+ 、Cr3+ 、Zn2+ 、Fe2+ 、Co2+ 、Ni2+ 、Ca2+ 、Mg2+ 、K+ 、Na+ )对该探针没有明显的荧光响应，探针对 Hg2+ 具有高度的选择性，且响应时间短(30s)。 2012年，Pandey等86报道了三个喹唑啉化合物37，38和39，均属于“on-off”型Hg2+ 荧光探针，激发光波长在350 nm 时，三个探针的发射波长分别在423 nm，423 nm 和426 nm。加入Hg2+ 后，三个探针的荧光均出现淬灭现象，淬灭程度分别为83%，77%和86%，研究表明，37和38均可与Hg2+ 形成 11配合物，39与Hg2+ 形成1:2配合物，值得指出的是尽管37和38的6-位取代杂原子可以形成螯合结构，但三个探针分子都是通过喹唑啉环与Hg2+ 结合，具有较高选择性和灵敏度。1.3 本课题研究目的、意义及主要内容1.3.1 研究目的及意义过渡金属离子和重金属离子在生物体内发挥着重要的作用，其中某些金属离子对环境有着非常大的毒性。因此，设计合成高选择性高灵敏度识别过渡金属和重金属离子的荧光探针已引起人们的广泛关注。在这些离子中，汞离子被认为是地球上毒性最大的重金属离子。无机汞离子可以轻易的通过细胞膜，从而严重破坏神经系统和内分泌系统。细菌将无机汞转化为甲基汞后，其毒性比无机汞更大。由于甲基汞的亲脂性、容易吸收、难以排泄，甲基汞容易穿过血脑屏障，在大脑中累积，导致大脑和其它器官严重的不可逆神经损伤。鉴于汞离子的巨大毒性，美国环境保护局规定饮用水中汞离子含量的上限是2 ppb（10 nM）。 图1.1 罗丹明衍生物的螺内酰胺环“关-开”过程示意图各种传统方法如分光光度法，原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法，电感耦合等离子体原子发射光谱法和伏安法等已经实现了对Hg2+的痕量（低至ppb级）检测。但这些方法大多数需要复杂的多步样品前处理，同时需要精密的仪器。汞离子荧光分子探针由于其高选择性、高灵敏度、只需要简单仪器和操作简便等优点而受到化学工作者的广泛关注。罗丹明因其具有相对长的激发发射波长、较高的量子产率、良好的水溶性以及对光的高稳定性等良好的光物理性质，而被广泛应用于荧光标记试剂和染料激光光源。此外，罗丹明衍生物的内酰胺关环形式没有荧光，酰胺环打开时则引起强的荧光发射（图1.1）。所以罗丹明结构是一种构建“开-关”型荧光化学传感器的理想分子。基于这一特征，近年来基于罗丹明内酰胺结构的荧光探针已被广泛用于检测许多金属离子。图1.2 罗丹明6G、罗丹明B和罗丹明101结构但目前为止，利用罗丹明内酰亚胺开关环前后光学性质显著差异来设计荧光探针的报道多集中在以罗丹明B和罗丹明6G（图1.2）作为母体进行结构修饰，而以罗丹明101作为母体分子进行结构修饰来设计荧光探针的报道仅有四例87-90，且是以Cu2+和Zn2+为检测对象，而以Hg2+为检测对象的罗丹明101类荧光探针还未见报道。相比于罗丹明6G和罗丹明B，罗丹明101氨基上的取代基为多个刚性的正丙烯基，这阻止了该染料由于非辐射过程导致的荧光失活，从而使其及其衍生物的紫外-可见光吸收和荧光发射波长更长，摩尔吸光系数和荧光量子产率更高，从而更适用于生物体内的荧光成像检测。因此，有必要开发以罗丹明101为母体分子并利用其内酰亚胺开关环前后光学性质显著差异来检测Hg2+的荧光探针。1.3.2 研究内容1、荧光探针分子的设计与合成；2、荧光探针分子的质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱等表征；3、荧光探针分子分析性能测试。 第二章 实验部分2.1 仪器与试剂所有的荧光测定在Thermo Scientific Lumina 荧光分光光度计上进行；紫外光谱测定在Shimadzu UV-2400紫外-可见分光光度计上进行；核磁共振谱在Varian INOVA-400核磁共振仪上获得；溶液pH值用德国Sartorius公司 PB-10型精密 pH计测定。劳氏试剂(Lawessons reagent)购自Alfa Aesar公司。无水1,2-二氯乙烷按照标准方法处理得到。除特别指明的以外，其它试剂都为市售分析纯试剂，不经纯化直接使用。柱色谱硅胶（100-200目）购自青岛海洋化工厂。在整个实验过程中使用二次蒸馏水。2.2 化合物的合成化合物的合成路线见图2.1。图2.1 化合物的合成路线及劳氏试剂结构式8-羟基久洛尼定（化合物3）的合成：在100 mL的圆底烧瓶中，将4.37 g（40 mmol）间氨基苯酚和37.80 g（240 mmol）1-溴-3-氯丙烷溶解于30 mL N, N-二甲酰胺（DMF）中，再加入8.48 g（80 mmol）碳酸钠。N2保护下，80 oC搅拌反应16 h，停止反应。反应液冷却后倒入150 mL水中，用200mL乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤。将上述有机相真空浓缩得到的中间体溶于30 mL DMF中，加入8.48 g（80 mmol）碳酸钠，N2保护下，50 oC搅拌下继续反应12 h，停止反应。反应液冷却后倒入100 mL水中，用200mL乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩有机相得8-羟基久洛尼定粗产物。将粗产物溶于少量CH2Cl2，以体积比为9:1的沸点为6090 oC石油醚与乙酸乙酯为淋洗剂，经硅胶柱层析得到白色固体3.91 g，产率51.9%。经检验光谱学和物理性质与文献数据相吻合。罗丹明101（化合物2）的合成：在100 mL的圆底烧瓶中，将0.95 g（5 mmol）8-羟基久洛尼定溶解于40 mL正丁酸中，再加入2滴2 mol/L 硫酸溶液作催化剂，然后加入0.37 g （2.5 mmol）邻苯二甲酸酐。搅拌加热回流反应12 h; 冷却至室温，真空旋除有机溶剂。以二氯甲烷/无水甲醇 （18:1, 体积比）为淋洗剂经硅胶柱层析得到深紫色固体0.47 g，产率38.2%。经检验光谱学和物理性质与文献数据相吻合。罗丹明101内硫酯（化合物1）的合成：方法一: 在50 mL的圆底烧瓶中，将0.49 g（1.0 mmol）罗丹明101溶解于15 mL1,2-二氯乙烷中，逐滴加入3 mL三氯氧磷。回流反应4 小时后，冷却至室温。将真空旋除溶剂得到的粗产物溶于3 6mL四氢呋喃（THF）中，备用。在50 mL的圆底烧瓶中，将0.76 g （10 mmol）硫脲溶于15 mL THF和3 mL水组成的混合溶液，再加入4 mL无水三乙胺，然后逐滴加入上述备用溶液，室温下搅拌过夜。真空旋除溶剂，再加入20 mL水，有沉淀析出。抽滤，滤饼反复用水洗涤三次，真空干燥。以硅胶柱层析（二氯甲烷）分离，得到白色固体罗丹明101内硫酯0.021 g，产率4.2 %。方法二: 在50 mL的圆底烧瓶中，将0.246 g（0.5 mmol）罗丹明101和0.202 g（0.5 mmol）劳氏试剂溶解于15 mL无水甲苯中。N2保护下回流反应4 小时后，冷却至室温。以硅胶柱层析（二氯甲烷）分离，得到紫红色固体罗丹明101内硫酯0.024 g，产率9.5 %。方法三: 在25 mL的圆底烧瓶中，将0.143 g（0.25 mmol）罗丹明101溶解于5 mL1, 2-二氯乙烷中，逐滴加入0.5 mL三氯氧磷（不少于5分钟）。回流反应4 小时后，冷却至室温。加入3 mL饱和Na2S溶液，室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯多次萃取，无水硫酸镁干燥，过滤。有机相真空浓缩后以硅胶柱层析（二氯甲烷为淋洗剂）分离，得到淡黄色固体罗丹明101内硫酯0.053 g，产率41.9 %。1H NMR (CDCl3, 250 MHz) (ppm): 1.79-1.80 (m, 4H), 1.87-1.93 (m, 4H), 2.47-2.60 (m, 4H), 2.88-2.92 (m, 4H), 3.10-3.16 (m, 8H), 6.27 (s, 2H), 7.25 (d, 2H, J=8.0 Hz), 7.46-7.58 (m, 2H), 7.88 (d, 1H, J=7.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (ppm): 21.20, 21.51, 22.01, 27.20, 29.71, 49.46, 49.91, 64.03, 107.55, 108.82, 117.47, 122.52, 125.61, 127.51, 128.05, 134.12, 135.87, 143.34, 147.52, 157.92, 198.16. ESI-MS: M+H+=507.38, calculated for C32H31N2O2S：M+H+=507.21.2.3 测量过程将适量的化合物1溶于N,N-二甲基甲酰胺（N, N-Diemthylformamide, DMF）中得到10-3 mol/L 化合物1的储备液。将储备液用DMF稀释至2.0 10-5 mol/L，此为工作溶液。上述溶液均在4 下避光保存。汞离子的标准溶液是用pH 7.20 Tris