胶质瘤多药耐药细胞株大鼠动物模型的建立及其生物学性质.doc

胶质瘤多药耐药细胞株大鼠动物模型的建立及其生物学性质中国医学科学院ACTAACADEMIAEMEDICINAESINICAE?论着?胶质瘤多药耐药细胞株大鼠动物模型的建立及其生物学性质张健张庆林王成伟于骀飞郭华孔建新陶荣杰刘福生(山东大学第二医院神经外科,济南250o33)摘要目的建立神经胶质瘤多药耐药细胞株C6/adr及其原始细胞株c6种植在s-D大鼠脑内的动物模型,对照研究其生物学性质.方法体外培养神经胶质瘤多药耐药细胞株C6/adr及其原始细胞株C6,在磁共振连续动态监测下,进行大鼠脑内接种,于接种当天,第3天以及接种后每周进行磁共振随访检查,并对同期大鼠进行组织活检,观察接种后肿瘤大小变化,荷瘤大鼠的生存期.结果体外培养的神经胶质瘤多药耐药细胞株接种大鼠4周以后出现明显的颅内压增高症状,磁共振阳性结果远早于症状的出现,能更准确地动态显示肿瘤在脑内的生长情况,接种后同期病理结果证实了磁共振影像学表现.C6和C6/adr细胞大鼠动物模型的生长特性相似,两者接种后同期的肿瘤大小,生存期无显着差异(P>0.05).结论应用磁共振对大鼠动物模型进行动态监测,结合同期的病理切片,能够全面了解活体肿瘤的生长情况,并可确立大鼠脑内肿瘤生长的早,中,晚分期,为体内实验的进一步深人研究提供重要的工具和必要的基础.关键词胶质瘤多药耐药动物模型磁共振中图号R739.41RatModelfortheMultidrugResistantGliomaCellLineZhangJianZhangQing-linWangCheng-weiYuTai-feiGuoHuaKongJian-?xinTaoRong-?jieLiuFu-?sheng(DepartmentofNeurosurgery,theSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)ObjectiveToevaluatetheanimalmodelofthemuhidrugresistantgliomacelllineC6/adrforfurthernvivostudies.MethodsTheratgliomacellsC6andmuhidrugresistancecellsC6/adrwereculturednvitroandimplantedintothebrainofS.Drats.Afterimplantation.alltheseanimalswereexaminedcontinuallywithmagneticresonanceimaging(MRI)andhistologicalexamination.,rhegrowthprocedureofintracranialimplantedgliomaandthesurvivalspanoftheanimalmodelwereevaluated.ThestatisticalanalysiswasmadebetweentheSurvivaldataofthetwocelllines.ResultsThesymptomsofintracranialhypertensiondidnotoccuruntil4weeksafterinoculation.TheMRIfindingsoftheimplantedgliomaintheratbrainweremuchearlierthantheabnormalbehaviorobserved.PathologicalresultsafterinoculationdemonstratedtheMRIfindings.Thetwocelllineshadsimiliargrowthcharacteristicsandnosignificantdifferencesinsurvivaltimes.ConclusionTheseresultssuggestthatbymeansofMRIandhistologythegrowthprocedureoftheimplantedgliomainvivobesuccessfullyobserved.A1lthesedatawillprovedtobeausefulbasisforstudyofgliomainivo.Keywordsglioma;muhidrugresistance;animalmodel;magneticresonanceimagingActaAcadMedSin,2004,26(11:4346神经胶质瘤多药耐药细胞株动物模型的建立,是研究逆转肿瘤细胞多药耐药性的体内实验的重要国家自然科学基金(30070272)资助SupportedbytheNationalNaturalSciencesFoundationofChina(30070272):#CorrepondingauthorTelFaxE-mail:Vo1.26No.143中国医学科学院工具,其生物学性质的研究是体内实验的必要基础.大鼠胶质瘤耐阿霉素细胞株C6/adr为大鼠胶质瘤细胞株C6在体外经过阿霉素多次筛选传代所建立的多药耐药细胞株11,2】,为了研究体内逆转胶质瘤多药耐药性的可行性,进一步探讨逆转耐药性对大鼠脑内多药耐药性神经胶质瘤的动物模型的肿瘤生长,生存期影响及意义,本研究应用大鼠胶质瘤细胞对大鼠进行脑内种植,在磁共振动态监测下结合病理检查对其生长规律进行初步研究.材料和方法材料大鼠胶质瘤细胞株(C6)及耐阿霉素细胞株(C6/adr)系本研究室自行培养;RPMI1640培养基系GIBCO公司产品;小牛血清系杭州四季青生物制品公司产品;胰蛋白酶为华美生物制品公司产品;二氧化碳培养箱为美国Nuaire公司产品;美国生产的型号为MaeoniPreview的低磁场强度(0.23T),开放式常导磁共振系统,以小视野线圈作为发射和接收装置.实验动物及分组选择40只成年810周龄S-D雄性大鼠,体重200300g,购自山东大学实验动物中心;将大鼠随机分为C6,C6/adr两组,每组20只.动物模型的建立细胞培养:应用1640培养基加10%新生小牛血清,常规37,5%体积浓度的二氧化碳孵箱内培养大鼠胶质瘤细胞株C6及耐阿霉素细胞株C6/adr;通过换液,消化,传代,将细胞状态调整到指数生长期;收获指数生长期的细胞,消化,离心后,将细胞悬浮于无血清1640培养液中,终浓度为1X10个/l,0.5h内接种人大鼠脑内.接种方法:两组大鼠均于腹腔注射3%戊巴比妥全身麻醉,剂量为50mg/kg体重;将麻醉后的大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上,选取右额顶中线旁开2nan,双外耳道连线前6mm为穿刺点,局部备皮,消毒;首先应用套有塑料套管的7号针头,于穿刺点经皮垂直,左右旋转,钻透头皮和颅骨;然后换用带有塑料套管的4.5号针头,循原穿刺道穿刺入脑内皮质下,针头接微量注射器,缓慢注入(2min)备好的细胞悬液10l,留针3rain,缓慢旋转退针,压迫穿刺点数分钟观察接种后症状麻醉清醒前应注意保持呼吸道通畅,清醒后观察其神经活动变化,包括精神状态,肢体活动,进食,饮水活动等.44February,2004磁共振随访应用前述磁共振设备对接种后的大鼠进行检查,分别于接种当天,第3天以及接种后每周对麻醉后的大鼠进行头部磁共振扫描.病理检查将接种后同期的大鼠猝死后取完整脑组织进行大体观察,并行组织学切片HE染色检查,与磁共振影像结果相互对照,分析成瘤过程及肿瘤体积与生长时间的关系.统计学处理采用SAS统计软件包,比较两组大鼠动物模型接种后同期的肿瘤大小及生存期,进行t检验结果接种后症状接种后当天,大鼠因麻醉关系处于昏睡状态,8h后清醒,表现为惊恐不安,进食减少;第2天即恢复正常,此后无明显异常症状;直到第4周以后,大鼠开始出现颅内压增高表现,如精神萎靡,饮水进食活动减少,反应迟钝等;颅内高压症状持续至第5周,因严重颅内压增高衰竭,死亡;两组荷瘤大鼠总的平均生存期约为32d.磁共振表现磁共振阳性结果远远早于症状的出现.接种后第1周可清楚显示肿瘤生长的异常信号(图1);此后磁共振随访检查可动态显示肿瘤逐渐生长的过程,第4周后磁共振可见肿瘤生长巨大,脑组织明显受压,并出现脑积水等继发表现(图2),此时肿瘤生长速度减慢,但症状明显加重,接种后56周内死亡.图l接种后第1周可清楚显示肿瘤生长的异常信号FiglMRIrevealingabnormalsignalofglioma1weekafterinoculationMRI:magneticresonanceimaging病理结果接种后同期病理检查证实接种肿瘤在大鼠脑内生长,大体标本可见右额顶叶脑组织肿胶质瘤多药耐药细胞株大鼠动物模型的建立及其生物学性质胀,肿瘤颜色暗红,与正常脑组织有边界(图3),有时可伴有继发坏死;病理切片示肿瘤细胞分裂增生活跃,与正常脑组织分界不清,呈浸润性生长(图4)图2第4周后磁共振可见肿瘤生长巨大,脑组织明显受压,并出现脑水肿继发表现Fig2MRIrevealingmassinessofgliomawithbrainopp-ressionandbrainedema4weeksafterinoculation图4病理切片示肿瘤细胞分裂增生活跃,浸润性生长,与正常脑组织分界不清Fig4PathologyofgliomarevealingthatthetumorcellsgrowingwithremarkablehyperplasiaandthereisnoclearboundarybetweentumorcellsandnormaltisSUesx200两组荷瘤大鼠对比两种肿瘤细胞C6/adr和C6接种的动物模型在接种过程中无死亡,除因病理检查分别处死5只大鼠外,每组分别有15只大鼠存活,其中C6/adr和C6组2周以内死亡分别为1,0只;34周内死亡分别为3,5只;5周以上大部死亡;C6/adr组有2只大鼠存活超过6周,行磁共振检查发现接种部位囊肿形成(图5),猝死后取脑行组织学检查亦证实为单纯囊肿,未发现肿瘤细胞.将上述资料对比发现,两组大鼠脑内肿瘤生长的过程相似,接种后同期的肿瘤大小,生存期的统计学分析示二者无显着性差异(P>0.05).l固l图5存活超过6周C6/adr接种大鼠,行磁共振检查发现接种部位囊肿形成Fig5MRIofaratgrowingmorethan6weekswithacystinthesiteofC6/adrcellsinoculation讨论神经胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,多呈浸润性生长,与正常脑组织分界不清,手术切除后易复发,治疗多采用手术,放疗,化疗等综合治疗,但效果不理想.针对化疗而言,肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性是制约其疗效的主要因素,建立神经胶质瘤多药耐药细胞株动物模型并研究其生物学性质为逆转胶质瘤细胞多药耐药性的体内研究提供了重要的实验工具和必要的实验基础【3】.文献报道脑内种植神经胶质瘤细胞动物模型的建立方法大体可分为两种,徒手法和立体定向法14,5】.前者操作简便,但定位准确性差,易导致肿瘤细胞转移;后者定位准确,操作稳定性好.笔者借鉴了上述方法的优点,应用立体定向固定,但并不切开头皮,也不用骨钻开骨窗,直接应用自行设计的套管针头,分两步穿刺,首先应用粗针头(7号)经皮钻透颅骨,塑料套管将针尖长度严格限制为2mm,不会损伤硬膜下脑组织;然后换用细的塑料套管针(4.5号),针尖露出7mm,循原穿刺道刺人皮质下基底核,塑料套管既保证了穿刺深度,又可固定针体,穿刺的稳定性比较满意.该方法不仅节省了时间,同时减少了创伤,使操作本身不会影响动物正常的生理活动.本研究中接种死亡率为0,而常规接种方法的死亡率达到3%5%t】.开放性磁共振实时监测下更能保证穿刺定位的准确性.在动物模型建立过程中,肿瘤播散转移是经常遇到的问题,笔者在预实验时遇到1例大鼠接种后右额叶肿瘤生长的同时出现面颊皮下转移性肿瘤,考虑与接种液体量较大有关(301);本研究中接种细胞悬液严格限制为101,未再出现肿瘤转移.Vo1.26No.145中国医学科学院穿刺过程中,除了应注意严格无菌操作,以防止颅内感染外;同时应注意严格无瘤操作,防止肿瘤细胞向接种部位之外播散,具体措施包括:(1)在保证接种细胞量为110的前提下,严格控制接种液量为10Ixl;(2)穿刺过程应缓慢,左右旋转进针;然后缓慢注入(2min)备好的细胞悬液10l,以防止颅内压增高过快;注入后留针3min,使接种细胞悬液在局部产生的压力逐渐弥散;出针时亦应先左右旋转,并缓慢退针,避免针道产生负压,使接种的细胞悬液沿针道外溢,播散.亦有文献报道为了防止种植转移而采用双倍1640培养液加1%琼脂糖作为接种细胞悬液f5.对于C6/adr组有2只大鼠接种部位形成囊肿,未发现肿瘤细胞生长,考虑为同种异体接种引起的免疫排斥反应有关,并非接种方法本身所致.大鼠脑内接种后均见肿瘤生长,其生长速度及程度与接种时间相关,动物出现明显的颅内压增高症状时间较晚,此时颅内肿瘤已经生长到相当程度,并出现脑水肿等继发改变.与症状相比,磁共振检查可在早期准确显示肿瘤生长情况,接种当天磁共振检查即可显示接种部位的异常信号灶,随时间延长,肿瘤信号逐渐增大,二者之间具有一定的规律性.建立大鼠胶质瘤模型是为了模拟人脑胶质瘤的临床治疗过程13,4,笔者根据大鼠接种后肿瘤在脑内的生长过程及其磁共振表现特点,并结合进一步逆转胶质瘤耐药性的体内实验的具体治疗需要f2,将其分为三个阶段:2周以内,肿瘤直径<2mill为早期;35周,肿瘤直径<5mm为中期;5周以上,肿瘤直径5mm为晚期.根据以上分期,结合体内实验的要求,处于中期的肿瘤动物模型最适于实验操作,因为此期肿瘤已经生长的较大,操作目标易于定位,而且肿瘤的生长尚留有较大的时间余地,有利于在一定时间段内对实验对象进行观察.而肿瘤生长早期和晚期则不适于体内实验操作.在对肿瘤动物模型进行磁共振动态监测的同时,对不同时期的大鼠进行同步组织学检查,进一步证实了肿瘤模型的影像学结果.对照研究神经胶质瘤多药耐药细胞株C6/adr及其原始细胞株C6两组大鼠动物模型发现,两种肿瘤细胞体内生长特性相似,二者接种后同期的肿瘤大小,生存期统计学分析显示二者无显着性差异46February2004(P>0.05).多药耐药细胞株C6/adr虽然系原始细胞株C6在体外培养中应用化疗药物经多次传代筛选而来,但是前者对多种化疗药物均有不同程度的耐药性,而且在筛选过程中是否出现其他生物学性质如侵袭程度的改变亦未可知.因此,了解两种细胞接种后其体内生长特性并无显着差别对于在体内实验中进一步对照研究二者耐药性的变化提供了重要依据.综上,笔者参考文献方法并结合自己的实践,成功确立了大鼠神经胶质瘤多药耐药细胞株动物模型,该方法稳定,可靠,与人类神经胶质瘤的生长规律有一定相似之处,是胶质瘤体内实验的重要基础.本研究还显示利用磁共振检查可以准确有效地动态监测活体脑内肿瘤生长情况,为体内实验提供理想的实验工具.(本文图3见插图第6页1参考文献1刘福生,张庆林,赵丽,等.胶质瘤多药耐药细胞系C6/adr的建立及其生物学特性的研究.中华神经外科杂志,2o01,17(2):109.1122刘福生,张庆林,赵丽.等.胶质瘤多药耐药细胞系C6/adr的建立及其耐药性逆转的研究.中华神经外科杂志