IPS技术手册.pdf

上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 1 人类诱导性多能干细胞 人类诱导性多能干细胞 iPSiPS 细胞 细胞 技术指导手册技术指导手册 目录 目录 1 前言 1 2 人类胚胎成纤维细胞培养 2 3 重编程载体构建 3 4 病毒包装 4 5 人类 iPS 细胞的诱导 6 6 iPS 细胞鉴定 8 6 1 碱性磷酸酶活性检测 9 6 2 干细胞表面 marker 的免疫染色检测 9 6 3 干性因子的去甲基化程度分析 11 6 4 干细胞内源基因的表达分析 13 6 5 端粒酶活性检测 14 6 6 核型检测 15 6 7 拟胚体形成 15 6 8 畸胎瘤形成实验 15 7 干细胞技术培训及服务一览表 15 8 附录 16 1 前言前言 iPS 细胞最初从成纤维细胞重编程而来 因为它们准备和操作相对简单 其 他细胞类型 包括来自外胚层 中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生 iPS 细胞 Eminili et al 2008 2006 年 Yamanaka 和 Takahashi 利用逆转录病毒系统在成 鼠的成纤维细胞导入四个转录因子 Oct3 4 Sox2 c Myc 和 Klf4 Yamanaka 因 子 将其重编程为 iPS 细胞 它具有跟小鼠 ES 十分相似的特性 尤其重要的是 iPS 细胞也能产生后代 2007 年 iPS 技术在人类体细胞中得以应用 人类 iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响 Takahashi et al Yu et al 2007 由于 iPS 细胞具有和 ES 类似的功能 却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 2 和法律等诸多瓶颈 因此在医疗领域的应用前景非常广阔 成为干细胞研究的热 点 自然 和 科学 杂志分别将其评为 2007 年第一和第二大科学进展 随后 iPS 细胞的研究日新月异 近几年来 iPS 研究方面取得的一系列的重大成果让我们欣喜不已 然而 这才刚刚开始 iPS 细胞能真正用于临床惠及大众还面临着很多技术上的问题 一方面 iPS 产生的方法有待改进 另一方面 iPS 细胞的定向分化手段需继续探索 斯丹赛干细胞生物技术公司拥有成熟稳定的胚胎干细胞 iPS 细胞技术平 台 将竭力为全国各类进行干细胞 iPS 研究的科研机构 高校 相关医疗机构和 制药企业等提供高品质产品和优质的服务 目前 公司提供两种人类 iPS 细胞系 分别由 4 因子和 6 因子所诱导 方 便科研工作者做后续的研究 细胞系名称货号 SiDSH 01 0209 001 SiDSH 030210 001 另外 对于新手提供初学者试剂盒 名称货号包装 人类胚胎干细胞培养初学者试剂盒 0101 001 1kit 小鼠胚胎干细胞 培养初学者试剂盒 0102 001 1kit 人类诱导多能干细胞产生初学者试剂盒 0104 001 1kit 小鼠诱导多能干细胞产生初学者试剂盒0105 0011kit 这些产品都是经过严格的质控 为您科研的成功提供了基本的保证 2 人类胚胎成纤维细胞培养人类胚胎成纤维细胞培养 材料 材料 人胚肺成纤维细胞 货号 SDSC 07 SDSC 08 规格 1 106 支 人类胎儿包皮成纤维细胞 货号 SDSC 17 规格 1 106 支 0 25 trypsin 胰酶 Sidansai 含 10 FBS 的 DMEM 成纤维细胞完全培养液 Sidansai 货号 0810 500 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 3 实验步骤 实验步骤 人类成纤维细胞培养及传代方法基本与 293T 细胞相同 先吸弃废液 用 0 25 Trypsin 消化 一般 T25 瓶加 1ml 即可 放培养箱 3 5 分钟 待细胞大部分脱落时就可加含 FBS 的 DMEM 培养液终止消化 反复吹 打至细胞至单细胞悬浮液即可 传代比例为 1 3 1 5 Point 此细胞系消化时间比 293T 细胞稍长 请不要在加入 Trypsin 后马上拍打使 其脱落 否则会导致细胞结块 吹打不散 细胞传代比例大概为 1 3 1 5 不能传得太稀 否则不易生长甚至停止 生长 传代间隔时间为 3 4 天 3 重编程载体构建重编程载体构建 用于重编程的病毒载体 其构建方法与普通载体构建的方法基本相同 一般用慢 病毒 腺病毒或逆转录病毒质粒作为质粒构建的载体 质粒名称货号 iPS 慢病毒载体Lenti oct4 GFP0401 001 Lenti sox2 GFP0402 001 Lenti cMyc GFP0405 001 Lenti klf4 GFP0406 001 Lenti nanog GFP0403 001 Lenti lin28 GFP0404 001 Lenti SV40LT GFP0408 001 iPS 腺病毒载体Ad Oct4 GFP Ad Sox2 GFP Ad cMyc GFP Ad Klf4 GFP Ad Nanog GFP 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 4 Ad Lin28 GFP Ad Htert GFP 4 病毒包装病毒包装 材料 材料 293T 细胞 Sidansai 货号 0211 001 转染试剂 Fugene Roche 货号 4709713001 实验步骤实验步骤 1 包装细胞铺板 包装细胞铺板 传代 293T 细胞前将 T75 培养瓶用明胶包被 每瓶 T75 加 1 5 2mL 明胶 于 37 C 培养箱放置 10min 以上 传代 293T 细胞 将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净 加入 2mL 0 25 胰酶胰酶 使其均匀覆盖 瓶底 置于 37 C 培养箱中 3min 取出 轻轻摇晃可发现细胞开始脱离瓶底 待 其全部脱落 加入 3mL 37 C 水浴中预热的培养液 用用 10mL 移液管进行吹打移液管进行吹打 较大力吹打 6 8 次即可 不留死角不留死角 瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶瓶口口 小力小力 将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞 之后 将所有细胞吸出 置于 15mL 离心管中 取 50ul 混匀后的细胞于 1 5mL eppendorf 管中 加入 450ul DMEM 培 养液 即为即为 10 倍稀释倍稀释 混匀混匀 取取 10ul 细胞于计数板中计数细胞于计数板中计数 计数板上共 4 大格 每大格 16 小格 计数时 4 大格均计数 总数除以 4 得每大格细胞数 再乘 以 10 10 倍稀释 即为实际 n 万 mL 细胞浓度 铺细胞前 用明胶包被的培养瓶取出 轻晃使明胶将瓶底完全覆盖 之 后吸净剩余的明胶 即可将细胞铺上 细胞数量为 1000 万 T75 最后加新鲜 培养液至总体积为 10ml 2 转染转染 第二天做转染前先观察细胞密度 80 90 满即可进行转染 满即可进行转染 转染前无 需换培养基 做脂转 complex Opti MEM 需在 37 C 水浴中预热 Fugene 转染试剂需恢复转染试剂需恢复 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 5 至室温方可使用 使用前需摇匀 至室温方可使用 使用前需摇匀 转染每瓶 T75 的 complex 成分如下 含 cDNA 的 lv 质粒 10ug pVSVG 5ug delta 8 91 7 5ug opti MEM 补足至 1mL 后 用 1mL 枪混匀 正常吹打 5 6 次 加入 56ul Fugene 转染试剂 加至加至 opti MEM 液面之下液面之下 吹打吹打 3 4 次次 再用 1mL 枪混匀 正常 吹打 5 6 次 室温放置 15min 即可加入 T75 瓶中 晃匀后 最好隔隔 2 4h 后后 再再取出培养瓶取出培养瓶晃匀一次晃匀一次 3 收集病毒收集病毒 转染后 12 24h 将 T75 瓶中的培养基弃去 加入 10 DMEM 培 养液 10mL 即开始收集病毒 分别收集转染后 48 96h 的病毒上清 收集后可置于 4 C 冰箱短期保存 4 病毒滴度测定 病毒滴度测定 收集病毒后即可测病毒滴测病毒滴度度 悬浮感染 悬浮感染 在 24 孔板中测定病毒滴度度 先用明胶包被 24 孔板 10min 以上 同步骤 1 每孔加入 200ul 明胶 消化 293T 细胞 步骤 1 2 24 孔板每孔铺被 15 万细胞 可将细胞做 mix 体积扩大到 15 万细胞 500ul 加入 1 1000 polybrene 终浓度为 10ug mL 混匀 每孔加入 500ul 15 万细胞即可 将病毒上清 4000rpm 离心 5min 将细胞碎片离至管底 分别取 2ul 或者 5ul 病毒上清至上述步骤中的 24 孔板一孔中 摇匀后放入培养箱中 48h 后即可在荧光显微镜下观察其滴度度 5 病毒滴病毒滴度度确定 确定 15 万 293T 细胞 48h 即可刚好长至 90 100 满 此时即可固定细胞 计数 确定病毒滴度度 将培养基用真空泵吸去部分 务必不要将其吸净 由于务必不要将其吸净 由于 293T 细胞易飘细胞易飘 固定固定及及 DAPI 染色整个过程请务必保染色整个过程请务必保持持 293T细胞处于液面之下细胞处于液面之下 用PBS 涮涮 3 次 加入 4 PFA 室温固定 30min 24 孔板每孔 200ul 用 PBT 洗洗 2 次 每次 3 分钟 PBS 将 DAPI 1000 倍稀释 每孔加入 200ul 避光室温静置 5min 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 6 PBS 洗 2 次 每次 5 分钟 即可在荧光显微镜下计数 取 2 3 处取平均值 病毒滴度度 IU mL 荧光细胞占总细胞数的百分比 加入的病毒上清体积 1 5 105 103 6 停止收集病毒上清 用 75 酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去 7 病毒在感染目的细胞前用 0 45um 滤膜过滤后 预热方可使用 我们提供的主要包装病毒 病毒种类携带基因货号包装 慢病毒Oct40501 1071 107 Sox20502 1071 107 Nanog0503 1071 107 Lin280504 1071 107 c Myc0505 1071 107 Klf4 0506 107 1 107 SV40LT0507 1071 107 4 factors mixture0508 1072 107 6 factors mixture0509 1072 107 腺病毒Oct40510 1081 108 Sox2 0511 108 1 108 Nanog0512 1081 108 Lin28 0513 108 1 108 c Myc0514 1081 108 Klf4 0515 108 1 108 SV40LT0516 1081 108 此外 我们还提供相关的病毒包装培训病毒包装培训 为期 1 周 学成后方便迅速搭建平台 5 人类人类 iPS 细胞的诱导细胞的诱导 材料 材料 已经测定好滴度的慢病毒 以 6 种为例 体细胞 以人类胎儿包皮成纤维细胞为例 货号 Sidansai SDSC 17 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 7 助转剂 polybrene Sidansai 货号 0832 050 胰酶 Sidansai 0 1 gelatin 明胶 Sidansai DMEM 含 10 FBS 培养液 成纤维细胞完全培养液 Sidansai 货号 0810 500 滋养层细胞 CF 1 MEF cells Sidansai 货号0303 100 人类胚胎干细胞培养液 Sidansai 货号 0801 500 人类胚胎干细胞条件培养基 Sidansai 货号 0803 100 基质胶 Sidansai 货号 0829 040 Point 6 种病毒所含基因分别为 OCT4 NANOG SOX2 LIN28 C MYC KLF4 由预实验可知 慢病毒感染人类胎儿包皮成纤维细胞细胞的最佳比例 MOI 为 10 1 即 10 个病毒颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被 感染上 且细胞干扰最小 在实际感染过程中 为了减少病毒批次间差异对 iPS 产生效率的影响 保证实验的成功率 我们一般会设定一个 MOI 的梯度 5 1 10 1 20 1 病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种 两种方法均可行 不影响感染 效率 细胞生长不受影响 故均可用 开始病毒感染实验以前 请先准备好滋养层细胞 MEF 病毒感染步骤病毒感染步骤 悬浮感染方案 悬浮感染方案 a 先用 0 1 gelatin 预包被一个 T25 瓶 包被时间约为 10min b 待细胞生长良好时 用 0 25 trypsin 消化 收集到一个 15ml 离心管中 用血小板计数板计数 具体过程见成纤维细胞培养 protocol 之后取出用于感染 实验所需的细胞量 比如 1 105 c 若感染 1 105的细胞 以感染比例 5 1 10 1 20 1 计算出各个 MOI 下所 需的病毒量 将所需的各个病毒量加入 15ml 离心管中 混匀后 用 0 45um 过滤 器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质 避免对后续实验的影响 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 8 d 然后将 1 105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中 溶液体积最后补足至 2ml 最后加入 2ul 助转剂 polybrene 使用浓度为 10ug ml 将整个体系混匀后 转移到已经预包被好的 6 孔板的一孔中 摇匀后放入 37 C 培养箱中 过夜 e 病毒感染 24 小时后 第 1 天 将昨日感染的细胞消化下来 铺到事先准 备好的 MEF 上 按 T25 瓶每瓶铺 5 104的细胞 铺 2 个 T25 瓶即可 也可以铺 到 6 孔板中 f 第 2 天 将 DMEM 培养液换成 hESC 培养液 继续培养 以后每 2 天换液 一次 g 逐日观察 待细胞长至第 5 7 天时 可见小的细胞聚集 细胞形态已经 明显发生了改变 由梭形变圆形 生长聚集在一起 h 直至第 12 天 由于 MEF 使用时间过长 故培养液换成 CM conditioned medium HES hESC 正常培养液 的 1 1 混合液 以提供给细胞充足的营养 i 待细胞长至第 20 天左右 可以挑克隆 将 ES like clone 挑至新的 MEF 上 按 hESC 培养方法继续培养 扩增 IPS 克隆与正常的人类胚胎干细胞在形态上 基本无异 6 iPS6 iPS 细胞鉴定细胞鉴定 iPS 细胞的鉴定主要包括以下几种 细胞的鉴定主要包括以下几种 碱性磷酸酶活性检测碱性磷酸酶活性检测 干细胞表面干细胞表面 marker 的免疫染色检测的免疫染色检测 干性因子的去甲基化分析干性因子的去甲基化分析 干细胞内源基因的表达分析干细胞内源基因的表达分析 端粒酶活性检测端粒酶活性检测 核型检测核型检测 拟胚体形成拟胚体形成 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 9 畸胎瘤形成实验畸胎瘤形成实验 下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤 6 16 1 碱性磷酸酶活性检测 碱性磷酸酶活性检测 其它其它所需材料及准所需材料及准备 备 PBS 缓冲液 4 多聚甲醛 即 4 PFA 1 x 润洗缓冲液 e g TBST 20mM Tris HCl pH 7 4 0 15M NaCl 0 05 Tween 20 碱性磷酸酶染色步骤碱性磷酸酶染色步骤 以 以 24 孔板染色为例 孔板染色为例 a 吸出细胞培养液 用 PBS 润洗 2 3 次 用 PFA 固定 1 2min 注意 不要固定 超过 2min 过度固定会使碱性磷酸酶失活 b 吸出固定液 用 PBS 洗 2 次 c 吸出 PBS 用 TBST 润洗一次 d 准备碱性磷酸酶试剂 溶液 A 白 溶液 B 绿 溶液 C 50ul 50ul 400ul e 加足量的染色试剂使染色液能足够覆盖孔底 室温避光放置 10 15min 吸出染色液 用 PBS 缓冲液润洗一次 最后保存于 PBS 溶液中 显微镜下观察染 色结果 未分化细胞染色为蓝 紫色 分化的细胞染色为无色 6 2 6 2 干细胞表面干细胞表面 markermarker 的免疫染色检测的免疫染色检测 可用的试剂盒包括 货号包装所鉴定的抗体 0701 01010testOct4 Sox2 Nanog SSEA4 Tra 1 60 Tra 1 81 0702 01010testOct4 Sox2 Nanog SSEA1 SSEA3 SSEA4 Tra 1 60 Tra 1 81 0703 01010testOct4 Nanog Sox2 SSEA1 表达于人类 ES iPS 细胞中的标志物包括 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 10 Stage specific embryonic antigen 3 SSEA3 Stage specific embryonic antigen 4 SSEA4 Tumor related antigen 1 60 TRA 1 60 Tumor related antigen 1 81 TRA 1 81 OCT4 SOX2 Nanog 表达于小鼠 ES iPS 细胞中的标志物包括 Stage specific embryonic antigen 1 SSEA 1 OCT4 SOX2 Nanog 免疫染色步骤 免疫染色步骤 1 首先把细胞固定在4 多聚甲醛 4 PFA 中 室温放置30min 2 在无水乙醇中浸泡两次 每次20min 或3次 10min 次 注意 此步骤仅限于核蛋白 如注意 此步骤仅限于核蛋白 如Oct4Oct4 NanogNanog或或Rex1Rex1等 不能用于膜蛋白如等 不能用于膜蛋白如 SSEASSEA 和和TraTra等等 3 将上述溶液吸干 先用1X PBS洗涤一次 再用抗体稀释液 0 2 BSA和 0 1 TritonX100溶于PBS 洗涤两次 4 此步骤可不操作 进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应 用封闭液 含 1 BSA 4 normal serum 0 4 TritonX100的PBS溶液 封闭细胞 5 将一抗稀释在抗体稀释液中 加到样品上 室温2h或4度放置过夜 6 用PBT 0 1 TritonX100 洗涤细胞3 5次 7 将二抗稀释在抗体稀释液中 并加到细胞样品上 室温放置1h 注意注意 从步骤从步骤7 7开始 样品要注意避光 开始 样品要注意避光 8 用PBT洗涤3次 9 将DAPI 1mg ml in PBS 母液以1 1000 用PBS稀释 室温放置5min OR 将JASMIN hochest 母液以1 1000用PBS稀释 室温放置5min 10 用PBS洗涤5min 两次 11 再用4 多聚甲醛室温固定30min 12 最后再用 PBS 洗涤两次 每次 5min 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 11 6 36 3 干性因子的去甲基化程度分析干性因子的去甲基化程度分析 Bisulphite Squencing 法分析甲基化状态法分析甲基化状态 一 一 Bisulphite 处理基因组处理基因组 DNA 1 将基因组 DNA 置于冰上 液体石蜡冰上预冷 2 给每个样品准备 6 个 Ep 管 每管加 300ul 液体石蜡 3 准备样品 1 每个样品取 210ng 的 DNA 稀释到 21ul 2 新配 2M 的 NaOH 用超纯水配 1 6g NaOH 20ml 水 每管样品中加 4ul 使之终浓度为 0 3M NaOH 3 50 15min 4 准备 2 低熔点 argrose 0 02g ml 用双蒸水配 100 5min 之后置于 50 待用 5 向 3 中的 DNA 液中加入 50ul2 低熔点 argrose 混匀 保持 50 6 吸取上述 argose 和 DNA 混合液 加 10ul 管 于第二步预冷的矿物油中 冰上 至少 30min 使 beads 坚硬 7 向 beads 中加入 500ul 2 5M Sodium metabisulphite 新配 摇匀 使 beads 位于分层上 离心甩一下 8 50 避光反应 4h 12h 不超过 16h 18h 一般 12h 附 Sodium metabisulphite 的配制总体积 20ml I Hydroquinone220mg H2O2ml 50 避光溶解 黄红色 II Sodium bisulphate7 6g H2O8ml 2M NaOH5ml 50 避光溶解 每隔 10min 晃一次 溶 30min I II 分别配好后 在暗处混合 混合后颜色变浅 降为室温即可使用 终止反应 洗脱 1 1ml TE ph8 0 洗 3 次 10min 次 2 0 5ml 0 2M NaOH 洗 2 次 每次 15min 时间不可缩短 3 1ml TE ph8 0 洗 3 次 10min 次 4 每管 beads 加 100ul TE 4 保存 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 12 二二 Bisulphite PCR 方式 巢式 PCR 引物 2 对 第一轮outside forward outside reverse 第二轮inside forward inside reverse 体系 1stround 25 l ddH2O8 3 10 buffer2 5 Primers 10 M 2 0 outside F R dNTP 10mM 2 0 rTaq0 2 template beads 10 0 94 5min 94 30s 55 60 45s 退火温度根据引物设定 72 50s 72 7min 2ndround 50 l ddH2O35 5 10 buffer5 0 Primers 10 M 4 0 inside F R dNTP 10mM 4 0 rTaq0 5 template1 0 94 5min 94 30s 55 60 45s 退火温度根据引物设定 72 50s 72 7min 注意事项 注意事项 1 第一轮的模板为 beads 吸出的时候要小心 防止滑落或者弄碎 在其他都加 好之后再加 beads 2 第二轮的模板是第一轮反应的产物 为胶状 加入之前应在 55 度化开 三 纯化 三 纯化 PCR 产物产物 参见相关参见相关 Kit 说明书说明书 四 连接至 四 连接至 T vector 体系 基本按照 T vector 说明书 Solution I 的体积应占总体积的一半 T vector 35 cycles 35 cycles 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 13 每个反应 0 5ul 比如 PCR 产物浓度高时可用以下体系 PCR 产物浓度较低时适当增加体积 Insert 纯化好的 PCR 产物 3 ul T vector0 5 ul Solution I3 5 ul 16 连接过夜 第二天转化 最后挑克隆 抽质粒并且送测序即可 6 46 4 干细胞内源基因的表达分析干细胞内源基因的表达分析 实时定量实时定量 PCRPCR 检测内外源基因的表达检测内外源基因的表达 6 4 16 4 1 抽提抽提 RNARNA 1 将培养板每孔上清吸掉 用移液管加 500 l TRIZOL 反复吹打来裂解细胞至 均一通亮的液态后 收集到 1 5ml 离心管中 也可将细胞收集在离心管中后 再用 TRIZOL 裂解 2 每 500 l TRIZOL 加 0 1 ml 氯仿 盖紧样品管盖 用力摇晃试管 15 秒并将 其在室温孵育 2 3 分钟 在 2 8 下 12 000 g 的离心力高速冷冻离心 15 分 钟 离心后混合物分成三层 下层红色的苯酚 氯仿层 中间层 上层无色的 水样层 RNA 无一例外地存在于水样层当中 水样层的容量大约为所加 TRIZOL 容量的 50 3 将水样层转移到一干净的试管中 通过将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA 最初均化时的每 500l lTRIZOL 对应0 25ml 异丙醇 将混合的样品在 15 30 条件下孵育 10 分钟并在 2 8 下 12 000 g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟 RNA 沉淀在离心前通常不可见 形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和 管底 4 移去上层悬液 用 75 的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次 每 500 l 的 TRIZOL 加 0 5 ml 的 75 乙醇 旋涡振荡混合样品并在 2 8 下以 7 500 g 的离心力高 速冷冻离心 5 分钟 5 在操作的最后 简单干燥 RNA 沉淀 取 DEPC 水来溶解 RNA 并在 55 60 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 14 下孵育 10 分钟 紫外分光光度计测 RNA 浓度 6 4 2 反转录反转录 RNA 用反转录 用反转录 Kit 1 取 5 gRNA 加适量 DEPC 水至 11 l 再加 1 l Oligo dT Primer 共 12 l 体 系混匀 70 5 分钟 2 置冰上 加 4 l 反转录缓冲液 1 lRNA 抑制剂 2 ldNTP 混匀 37 5 分钟 3 置冰上 加 1 l 反转录酶混匀 42 1 小时 4 70 10 分钟失活反转录酶 得到的 cDNA 可以用于后续 real time PCR 实验 6 4 3 实时荧光定量实时荧光定量 PCR real time PCR 1 real time PCR 程序 95 5min 94 15s 66 10s 72 15s 2 4 步重复 40 循环 72 5 min 2 反应体系 2X realtime PCR master mix 含染料 SYBRGreen 1 7 5 l Primer Mix 25 M each 0 1 l Template 反转录好的 cDNA 稀释 10 倍后使用 0 3 l H2O7 1 l 共 15 l 体系 6 5 端粒酶活性检测端粒酶活性检测 推荐用端粒酶活性检测试剂盒 Millipore 货号 S7710 方法详见 kit 内 上海斯丹赛生物技术有限公司上海斯丹赛生物技术有限公司www SiDanS 15 不再赘述 6 6 核型检测核型检测 6 7 拟胚体形成拟胚体形成 拟胚体的制备 将得到的 iPS 细胞系扩增培养后 按正常传代步骤消化下 来 洗涤去除 MEF 细胞 将细胞吹打至小团块 比正常传代大小再小一些 然后悬浮培养在 EB 分化培养液中 3 天后换第一次液 之后每 2 3 天换液一次 直至收集 收集 EB 后用 TRIZOL 裂解 抽提 RNA 反转录 通过 real time PCR 的方法 见 real time PCR 检测的具体 protocol 检测各胚层 marker 的表达情况 或者也可以将 EB 贴壁培养数日 通过免疫染色免疫染色的方法检测各胚层分化 marker 的表达 6 8 畸胎瘤形成实验畸胎瘤形成实验 将得到的 iPS 细胞系传代培养至