细菌内毒素检查法动态浊度法.docx

细菌内毒素检查法 动态浊度法*尹立平( 天津市宝坻区药品检验所，天津 301800)摘 要 查阅有关文献资料，对细菌内毒素检查法 动态浊度法的原理、试剂要求、实验设计、试验方法、应用等方面 做一归纳，总结了选用实验试剂注意问题、操作关键技巧、试验步骤、建立标准曲线和回收率计算方法及其在药品检验中 的应用。关键词 细菌内毒素检查法，动态浊度法，内毒素，鲎试剂中图分类号: 927 12文献标识码: A文章编号: 1006-5687( 2014) 01-0050-03细菌内毒素检查法也称鲎试验法，用来判定供试 品中内毒素含量的限量是否符合规定的分析方法。目 前，国内 外药典收载的有凝胶法、浊度法和显色 法。 2010 年版中国药典二部附录中，将光度测定法中动 态浊度法收载为测定内毒素含量的方法之一。1实验原理动态浊度法是由内毒素与鲎试剂的 C 因子反应， 被激活的凝固酶切断凝固原蛋白中的精氨酸肽链，形 成凝固蛋白，在产生凝胶过程中发生浊度变化，用浊度 仪检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度 所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度 的 方 法。 此方法灵敏度高，操作简单，检测范围广( 0 006 300 EU / ml) 。2试验试剂2 1 内毒素标准品 细菌内毒素标准品是保证试验 的平行与重复性的重要参照标准物质，主要分为工作 标准品 CSE 和国家标准品 NS / SE。日常检验时，一 般均使用廉价的工作标准品。动态浊度定量法使用的 内毒素标准品要求稳定性好，效价准确，具有很好的重 现性。内毒素标准品的稀释过程操作是试验关键，不 正确操作会导致效价偏低，灵敏度标示偏高、阳性对照 不凝等1。故而 2010 年中国药典要求内毒素标准 品溶解后，在旋涡混合器上混合 15 min，以后每一步稀 释前最少混合 30 s2。2 2鲎试剂内毒素检查法结果准确度与所用鲎试 剂的灵敏度关联极大3，细菌内毒素检查时不能使用 灵敏度值高于限值的鲎试剂。动态浊度法应该选用定 量法鲎 试 剂，要 求 最 低 检 测 限 0 03 0 005 EU / ml。 现在市售的美洲鲎试剂 ( 缩写为 LAL) 与东方鲎试剂 ( 缩写为 TAL) ，功效相同。国产定量专用 TAL 目前有 KT、KTA 系列。KTA 最低检测限达到 0 005 EU / ml，可满足于动态浊度法检测需要。2 3 细菌内毒素检查用水 试验中鲎试剂的溶解、细 菌内毒素标准品及供试品的稀释都要用细菌内毒素检 查用水，不可以普通检查用水代替。2010 年版中国 药典明确要求动态浊度测定法所用细菌内毒素检查 用水内毒素含量小于 0 005 EU / ml，且对内毒素试验 无干扰作用。3 实验设计3 1内毒素限值( L) 的确定有两种方法可以确定 内毒素限值( L) 4: 依中国药典规定: 中国药典 2010 年版中有规定检查细菌内毒素项的化学药 424 个，生物制品 39 个品种的正文可以查到相应的 L 值。根据人的最大注射剂量: 计算公式为 L = K / M，L 为 供试品的细菌内毒素限值 ( 以 EU / ml、EU / mg、EU / U 表示) 。K 为人用按规定的给药途径不发生任何临床 不良反应时，每 kg 体重每 h 最大可接受的内毒素剂 量，以 EU / kg h 1 表示。静脉 ( 包 括 im，ip，SC，ia ) : 5 0 EU / kgh 1 ; 放射性药品: 2 5 EU / kgh 1 ; 鞘内:0 2 EU / kgh 1 。M 为人用每 kg 体重每 h 最大给药 剂量，以 ml / kgh 1 、mg / kgh 1 、U / kgh 1 等表示， 中国成人人均体重按 60 kg 计算，人体表面积按 1 62 m2 计算，注射时间小于 1 h 的按 1 h 计算。3 2 最大有效稀释倍数( MVD) 药品细菌内毒素检 查时，当内毒素限值 L = A 值( 鲎试剂灵敏度) 时，经干 扰实验证实无干扰，可以直接检查。当 L A 值时，需 要稀释供试品，但稀释的倍数不能超过最大有效稀释 倍数，用 MVD 表示。其计算公式为 MVD = LC / ，C 为 供试品溶液浓度，L 为供试品的内毒素限值， 为动态 浊度法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。当 L 以 EU / mg、EU / U 表示时，C 的单位为 mg / ml、U / ml; 当 L 以 EU / ml 表示时，C 为 1 0 EU / ml; 当供试品为注天津药学 Tianjin Pharmacy 2014 年 第 26 卷 第 1 期 51射用无菌粉末或原料药时，MVD = 1，可计算供试品的 最小有效稀释浓度 C = / L。3 3标准曲线的可靠性试验当试验条件发生了改 变或使用新批号的鲎试剂时，都可能会影响检验结果， 此时需制作标准曲线来确认试验的可靠性5。根 据 2010 年版中国药典二部附录要求，制备细菌内毒素 工作标准品稀释液，例 如 2 倍 稀 释 1 0、0 5、0 25、 0 125和 0 062 5 EU / ml，4 倍稀释 2 00、0 50、0 125、0 031 25 EU / ml。将 3 个浓度的稀释液，每一浓度的 3 支平行管的稀释液各取适量分别加入到预先加有 0 1 ml 鲎试剂的实验管中，混合均匀，插入细菌内毒素测 定仪进行检测，同时做 2 支阴性对照。当阴性对照在 规定的时间内不发生反应，将全部数据用最小 2 乘法 进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的 相关系数 r0 980，证明试验有效，否则须重新试验。 3 4 干扰试验 鲎试验法中为了确认供试品的 pH 值、温度、浓度及蛋白质和一些非内毒素杂质等对内毒 素的检测不产生干扰，无论新药老药在建立内毒素检 查法时需先做干扰试验，当供试品的来源、配方、生产 工艺改变或使用新批号鲎试剂等任何可能会影响检验 结果时，都需重做干扰试验。3 4 1干扰预试验将供试品用细菌内毒素检查用 水依次稀释至 2 倍、4 倍、8 倍、16 倍，最后的稀释 倍数不得超过 MVD，记为 Ai 液。一般不要以市售鲎 试剂灵敏度计算所得的 MVD 作为起始浓度。注射液 建议采用原液，粉针剂建议至少尝试往上几个浓度级， 探索其干扰程度，如没有干扰，方法则更可靠。以相同 稀释倍数的供试品溶液加入标准曲线中点 ( 或 附 近 点) 浓度( 设为 1) 的内毒素标准品，记为 Bi 液。分别 取上述各液( 每一浓度至少做 3 支平行管) 适量加入预 先加有 0 1 ml TAL 试剂的反应管内，混匀，立刻用细 菌内毒素检测仪进行检测。实验数据回归处理，按所 得线性回归方程计算平均回收率。回收率( % ) = ( Bi 液内毒素值 Ai 液内毒素值) / 1 100% 。当内毒素 的回收率在 50% 200% 之间，则认为在该试验条件 下供试品溶液不存在干扰作用。当内毒素的回收率不 在指定的范围时，可用加热、过滤、中和、透析等方法去 除干扰因素( 注意不要使供试品内毒素失去活性) ，重 新进行干扰试验。3 4 2 正式干扰试验 一般选择干扰预试验中内毒 素回收率接近 100% 的最大不干扰浓度或最小稀释倍 数，即可用这一最大不干扰浓度进行预干扰试验的验 证。取不同厂家不同批号最少 3 批样品制备下列供试 液: 通过干扰预试验的供试品溶液，不加内毒素，稀 释倍数不超过 MVD; 加入标准曲线中点( 或附近点)的一个已知内毒素浓度 ( 设为 m) 的供试品溶液，与溶液稀释倍数相同; 制备标准曲线的标准内毒素 溶液，至少 3 个浓度( 最低一点设为 ) ; 细菌内毒素 检查用水，不加内毒素，作为阴性对照。按干扰预试验 方法检测，计算内毒素回收率，如果回收率在 50% 200% 之间，则确认在该试验条件下可进行该供试品内 毒素检查。3 5供试品检查供试品为不同厂家不同批号最少3 批，按干扰试验中的操作步骤进行检测。用溶液 中的内毒素浓度减去溶液中的内毒素浓度，计算出 的内毒素的回收率，要在 50% 200% 的范围内。溶 液( 阴性对照) 反应时间大于标准曲线最低浓度的 反应时间。用溶液生成的标准曲线来( 溶液的结 果要符合 r0 980 的要求) 计算溶液的每一平行管 的内毒素浓度，若供试品溶液平行试验所得平均内毒 素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，则判 定供试品符合规定; 若大于或等于规定的内毒素限值， 判定供试品不符合规定。4应用中国药典2010 年版要求内毒素检查的化学药 品 424 个，生物制品 39 个，多采用鲎试剂凝胶法或凝 胶半定量法，采用动态浊度法定量测定的较少。近几 年仪器试剂的发展，技术的提高，有大量的文献报道采 用动态浊度法测定细菌内毒素含量。4 1化学药化学药类应用动态浊度法测定内毒素 含量报道较多，涉及到普通注射剂、抗菌药物、原料药 和放射性药品等，如詹云丽等6研究利巴韦林输液中 细菌内毒素含量，采用动态浊度法，结果表明将混合液 稀释至 5 倍后进行细菌内毒素定量检测是可行的。劳 海燕等7对 8 种注射用头孢菌素类抗生素定量稀释， 回收率为 50% 200% ，证实动态浊度法可以高效的 测定头孢类药物的内毒素含量。顾炳仁等8将精氨酸 原料药配制成 12 5 mg / ml 的溶液时进行动态浊度定 量测试效果满意。王海云9对 4 种放射性药品建立标 准曲线，完成了动态浊度法测定内毒素含量。4 2 中药 中药注射剂成分复杂，干扰较多，苑庆华 等10用细菌内毒素动态浊度法定量检测柴胡注射液 的细菌内毒素含量，稀释到 32 倍时排除干扰，回收率 在 50% 200% 范围内，方法可行。黄桂勇等11使用 细菌内毒素的动态浊度法可以高效地测定复方当归注 射液的细菌内毒素含量。舒玉萍等12 在复方苦参注 射液细菌内毒素定量检查法的实验探讨中，供试液稀 释 20 倍无干扰，回收率 50% 200% 范围内，可应用动 态浊度法定量测定其细菌内毒素含量。4 3生物制品马丽等13用动态浊度法对胸腺肽进52天津药学 Tianjin Pharmacy 2014 年 第 26 卷 第 1 期行细菌内 毒 素 含 量 测 定，结 果 可 行。罗 宇 芬 等14 对 七叶皂苷钠通过动态浊度法进行干扰试验和验证 试验，结果 16 倍稀释无干扰。宾漫容等15 对脑组织 注射液应用动态浊度法检测细菌内毒素，结果回收率 在 50% 200% ，证明可用动态浊度法测定其内毒素 含量。内毒素动态浊度法由于标准曲线的建立，最大限5 黄清泉，夏振民 药品细菌内毒素检查的试验设计J 中国药学杂 志，1997，32( 2) : 726 詹丽云，李楚云，刘杜妙，等 利巴韦林输液中细菌内毒素定量检测 的研究J 药理与毒理，2010，21( 7) : 47 487 劳海燕，林秋晓，冯聚锦 注射用头孢菌素类抗生素细菌内毒素动态 比浊定量法的研究J 中国药科大学学报，2005，36( 3) : 234 2378 顾炳仁 动态浊度法测定精氨酸中细菌内毒素的含量J 中华实 用医药杂志，2009，9( 8) : 17 1899m度地消除了内毒素标准品对试验结果的影响，试验结9 王海云 高锝TC酸钠注射液等 4 种产品的细菌内毒素定量测果不受内毒素标准品准确性的影响，同时计算回收率 更科学，对样品干扰行为的描述更为准确，结果可以保 存，利于质控，有可追溯性，尤其对于中药注射剂，其定 量意义更为重要。参考文献1 卫国，郑江 细菌内毒素定量检测的影响因素分析及对策J 局解 手术学杂志，2003，12( 3) : 214 2152 中国药品生物制品检定所 中国药品检验标准操作规范 S 北京: 中国医药科技出版社，2010: 287 3023 张 红 霞，陈 慧，马 金 刚 影 响 鲎 试 剂 灵 敏 度 测 定结果因素的分析 J 中国药师，2007，10( 8) : 825 8264 夏 振 民 药 品细菌内毒素 检 查的限 值J 药 物 分 析 杂，1995，15 ( 3) : 54定A 中国原子能科学研究院年报，2007: 30310 苑庆华，芮 菁，华 晓 东 柴胡注射液中细菌 内 毒 素 定 量 检 查 研 究J 西北药学杂志，2002，17( 6) : 260 26211 黄桂勇 复方当归注射液中细菌内毒素定量测定法J 山西中医，2008，24( 2) : 53 5412 舒玉萍，王美云 复方苦参注射液细菌内毒素定量检查法的实验探 讨J 齐鲁药事，2008，27( 9) : 539 54113 马丽，宾漫容，陈焕勇，等 胸腺肽注射液中的细菌内毒素的定量检 查J 中国生化杂志，2002，23( 6) : 302 30314 罗宇芬，劳海燕，林秋晓，等 动态比浊法鲎试验用于注射用 七 叶皂苷钠细菌 内 毒 素 检 测J 中国医院药学杂志，2002，22 ( 1 ) : 7 815 宾漫容，马丽，陈焕勇，等 动态浊度法定量检测脑组织注射液中的 细菌内毒素J 中国现代应用药学杂志，2002，19( 6) : 493 494治疗风湿免疫性疾病的新药研究进展*龚毅，鲁卓林( 天津市儿童医院，天津 300074)摘 要 风湿免疫性疾病是一类慢性进行性疾病，病程迁延。药物治疗是风湿免疫性疾病治疗的最基本、最主要手 段。常用的非甾体抗炎药、改善病情的抗风湿药、糖皮质激素已不能满足治疗要求，以生物制剂为代表的新药正走向历史 舞台。关键词 风湿免疫，