人参皂苷的提取与分离 材料.doc

人参皂苷的提取与分离 学 生 姓 名 专 业 班 级 学 院 摘要 首先认识人参和人参皂苷，了解人参皂苷的详细作用和功效，接着研究了人参茎叶总皂苷含量提取方法，用详细的工艺提取人参皂苷，并且用对显色反应和薄层层析对提取物进行鉴定，为以后的人参茎叶的开发利用奠定基础。 关键词：皂苷；人参茎叶；鉴定。 Abstract. The first ginseng and ginseng saponin, understanding the role and efficacy of ginseng saponin in detail, then study the effect of ginseng stem leaf total saponin extraction method, with the detailed process of extraction of ginseng saponin, and used for color reaction and thin-layer chromatography to extract were identified, for the future of ginseng stem and leaf development lays a foundation. key words: saponin; ginseng stems and leaves; appraisal;目 录摘要IAbstractII1绪 论11.1 人参概述11.2 人参的化学成分11.2.1 人参皂苷11.2.2 人参蛋白 1 1.2.3 人参多糖1 1.2.4 无机元素21.2.5 其他成分21.3人参的生理功能及药理活性21.3.1增强免疫功能21.3.2抗衰老21.3.3抗肿瘤31.3.4增强学习和记忆能力31.3.5保护心血管系统32实验部分52.1 实验材料52.2 人参皂苷的提取分离52.2.1人参皂苷的提取分离原理52.2.2人参皂苷提取和苷元分离工艺流程52.3 人参皂苷的检识72.3.1显色反应72.3.2薄层层析73讨论94结论10参考文献111 绪 论1.1 人参概述人参系五加科植物人参(Panax ginseng CAMey)的干燥根，人类对人参的利用在神农本草经中已有记载，据今已有2000多年的历史，但人们偏向于对人参根的利用，而对人参茎叶的开发从近几年才开始。人参茎叶是人参的地上部分，比根具有更高的人参总皂苷含量，具有补气益肺，祛暑，生津的功能，用于气嘘咳嗽，冒热烦躁，津伤口渴，头目不清，四肢倦乏等症。我国是人参的故乡，人参是我国的传统名贵中药，具有对多种疾病防治效果和对人体滋补强壮作用，已久为世界上驰名中药。其应用历史相当久远，在我国医药史上具有特殊的地位。人参为五加科人参属植物，通常所说的商品人参是指该植物的干燥根。始载于神农本草经，列为上品，享有“中药之王”的美誉，居东北三宝之冠。在我国主产于吉林及其周边的东北三省，我国在世界上也是人参重要的主产国和输出国之一。近年来，无论在人工栽培、采收加工、组织培养，还是有效成分的提取、分离，含量测定，活性成分，生理机能以及新产品的研制开发等方面，都进了较深入的研究工作，也取得了一定进展。1.2人参的化学成分人参主要含人参皂苷、人参多糖、人参蛋白等生物活性成分，是人参具有“百草之王”美誉的物质基础。1.2.1人参皂苷人参皂苷是人参、西洋参、三七等五加科人参属植物的主要活性成分，主要包括三种类型：达玛烷型四环三萜皂苷（包括原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷）、奥克梯隆型四环三萜皂苷和齐墩果酸型五环三萜皂苷。在人参根中的人参皂苷主要分布在表皮上，但人参植株的不同部位总皂苷含量也不同。1.2.2人参蛋白人参蛋白也是人参的主要成分，蛋白质和多肽在人参的生长、发育及生物功能表达等方面都起着重要的作用。主要包括：类RNA酶蛋白、核糖核酸酶、几丁质样蛋白、木聚糖酶、皂苷-葡萄糖苷酶。1.2.3人参多糖人参的化学成分很丰富，除了人参皂苷、人参蛋白外，还含有多种糖类，其总糖含量为4%-6%。包括单糖、低聚糖和多糖。人参含有丰富的人参多糖，多糖中含多肽，结合成糖肽。低聚糖，又称寡糖，根据寡糖的生物学功能可分为功能性寡糖和普通寡糖两大类。普通寡糖如麦芽糖、蔗糖等可被人体消化吸收，产生能量。而功能性寡糖，因不能被人和动物肠道吸收，决定了它们独特的生理功能。近年来，国内外对功能性寡糖的研究十分活跃，其主要生理功能体现在抑制肠道病原菌的生长繁殖，减少有毒发酵产物及有害细菌酶，预防、治疗便秘、腹泻，清除有害物质、保护肝脏功能，降低血清胆固醇和血压，增强免疫功能，抗衰老作用等。1.2.4无机元素人参含有人体必需的铜、锌、铁、钙、镁、锰、纳、钾等无机元素。近几年来很多学者认为中草药无机成分与有机成分具有协调作用，已引起人们的关注。氨基酸人参中含有丰富的天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、异亮氨酸等人体必需的氨基酸。1.2.5其他成分人参中还富含维生素类、生物碱及核苷类、酮类及黄酮类、聚乙炔醇类、甾醇类、酶类、木质素类、脂肪酸以及挥发性等有效成分。人参含大量的挥发油，是人参的特有香气。红参含有微量的人参麦芽醇，具有抗氧化作用。1.3 人参的生理功能及药理活性1.3.1 增强免疫功能 人参具有调节人体免疫功能的作用，包括增强体内吞噬细胞的活性，刺激机体对各种抗原产生相应的抗体，促进T淋巴细胞转化增殖等多种形式。1.3.2抗衰老 人参抗衰老作用是目前颇受重视的研究课题，这是由于自古以来人们就认为人参具有延年益寿作用11,12。另一方面乃由于老龄人口的急剧增加，研究抗衰老药物己是社会和人们的潜在要求，药理学研究证明13,14，人参的抗衰老作用是通过增强物质代谢、提高抗体免疫功能、调节内分泌、抗氧化等多种作用形式来实现的。1.3.3抗肿瘤 虽然人参抗肿瘤作用研究始于60年代初，但近些年来这项研究才受到学者们的重视，中国学者最初发现人参多糖对免疫功能具有促进作用，进一步发现人参多糖对多种动物移植肿瘤有抑制作用15,16，这种人参多糖制剂，现己正式用于临床治疗。临床实践证明，人参多糖注射液对胃癌病人有增强免疫功能和延缓病情进展的作用，特别是将其与放疗和化疗合并应用时，可对抗放疗和化疗引起的造血和免疫功能的抑制，使放疗和化疗的疗程延长，从而增强了放疗和化疗的疗效。人参皂苷对人体骨肉瘤U2OS细胞增殖的抑制作用。研究表明人参皂苷Rf - Rg1 - F1、PPT显著地促进了U2 OS细胞的凋亡。其作用通过抑制细胞周期或促进细胞凋亡来阻止U2 OS细胞的增殖23,25。 人参皂苷抗癌抗转移作用,主要基于人参皂苷肠内菌代谢物。人参皂苷肠内菌代谢物及其脂肪酸酯可能是人参皂苷在体内抗癌的真正活性成分2,4。人参皂苷Rb1 被结肠内细菌代谢为M I、M I逐渐水解为20( S) - 原人参二醇皂苷29,30。如Rb1、Rb2、Rc 由结肠内细菌代谢为M I。M I在肝中进一步生物转化为脂肪酸酯。脂肪酸酯抑制肿瘤作用比M I强, EM I可能是人参皂苷在体内的真正活性成分。EM I的药代动力学和生理学需要进一步深入研究。1.3.4增强学习和记忆能力前苏联学者报告人参和五味子都能加速条件反射的建立。近些年来，药理学家们用防御和逃避性条件反射方法证明，人参皂苷对化学药物引起的记忆获得和记忆巩固不良均有明显改善作用，但对记忆再现缺失影响不明显。在各种皂苷中，以人参皂苷的作用最佳，其他皂苷也有一定作用，但药效较差24,26。1.3.5保护心血管系统对人参活性物质的研究结果表明，人参中对心血管起作用的物质是人参皂苷，它具有明显的强心作用，能增加心肌的收缩力、减慢心率、增加心输出量和冠脉血流量。人参皂苷对动脉硬化的抑制作用。抑制酪氨酸激酶活性的药物具有抗动脉硬化的活性。据陈英杰报道; 二醇组人参皂苷中Ra1、Rb1、Rd、R0、显示有较强的抑制酪氨酸激酶活性用;人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd最强,而三七参苷- R4、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh2、竹节参苷- L8、人参皂苷- Ia、20 (R)人参皂苷- Rh1、人参二醇及齐墩果酸显示中等强度的抑制作用。人参皂苷抑制酪氨酸激酶活性的构效关系为PPD - 型皂苷- 齐墩果酸皂苷 PPT - 型皂苷。人参皂苷对脂蛋白脂肪酶的激活作用。高血脂,是因为乳糜微滴和低密度脂蛋白的积累和由于心脏中的脂蛋白脂肪酶活性降低造成的。口服人参皂苷抑制乳糜微滴和低密度脂蛋白的积累。使血浆和心脏中的脂蛋白脂肪酶活性恢复正常。起到降血清甘油三酯和胆固醇的作用2,7,8。 2 实验部分2.1实验材料人参茎叶(干） 无水乙醇 天平、 布氏漏斗、 烧杯(100ml、250ml、500ml)、 量筒(10ml、50ml、100ml、250ml)、 滴管、 漏斗、 铁架台、 玻璃棒、 试管、 滤纸、 剪刀 硅胶G 毛细管 氨性醇 树脂 玻璃板 浓硫酸等2.2 人参皂苷的提取分离2.2.1人参皂苷的提取分离原理人参皂苷元与多个分子糖结合成苷，具有较强的亲水性，易溶于水和低级醇类，实验室采用热水提取人参皂苷，提取液加碱（CaO）除杂。再用酸调至中性，上大孔树脂柱，先用水洗去色素至无色，再用70的氨性醇洗至无色，人参皂苷便溶于乙醇洗脱，回收乙醇，便得到人参总皂苷。人参总皂苷和稀HCl在醇液中进行温和酸水解，可得到三种皂苷元，齐墩果酸、人参二醇和人参三醇。而不能得到原人参二醇和原人参三醇，这是因为在酸水解过程中侧链的20位碳原子上的羟基（OH）与该链上的双键（CC）易闭环，而形成带有三甲基四氢吡喃环的人参二醇和人参三醇。水解后，除去醇、氯仿萃取物经硅胶柱层析分离即可得到三种单体皂苷元，经重结晶获得纯品，分别与已知皂苷的红外光谱相一致。2.2.2人参皂苷提取和苷元分离工艺流程一.人参皂苷提取工艺 人参茎叶粗粉20g热水提取1小时，粗滤，（棉花）提取液 药渣加0.6g是会乳沉淀，并调至PH910，放置10分钟，抽滤沉淀物滤液浓硫酸调PH7，放置10分钟。中性提取液回收后，上大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用 70氨性醇洗至绿色。乙醇洗脱液回收乙醇人参总皂苷（黄白色）二.参皂苷元的水解和苷元的分离流程 人参总皂苷加含5HCl的50乙醇液，加热回流2小时沉淀 水解液（酸性皂苷元部分）加水稀释，水浴蒸去醇，氯仿萃取3次（10，5，5ml）水层氯仿层无水NaSO干燥，回收氯仿总皂苷元少量苯溶解，硅胶柱层析，用苯乙酸乙脂 （8：2）洗脱组分 组分 组分95乙醇重 95乙醇重丙酮结晶结晶3次结晶3次2次齐墩果酸人参二醇人参三醇mp299-301mp245-250mp244-246三.操作方法 人参总皂苷的提取：取人参茎叶粗粉20g，放入烧杯用热水（8090）提取1小时，然后用棉花粗滤，在所得滤液中加入0.6g水石灰乳除杂并调PH910放置10分钟左右，过滤，再将滤液用浓硫酸（少量）调PH7，放置10分钟左右，回收提取液至少量（510ml），再上大孔树脂柱（注：此柱应提前洗好，清洗办法略）先用蒸馏水洗至无色，再用70的乙醇洗至无色，分别用小瓶接收。便得到了乙醇洗脱液，回收乙醇，便得到了人参总皂苷（黄白色）。人参皂苷的水解称取人参皂苷45g（不足时由老师提供），加20倍量含5HCl的50乙醇溶液，加热回流2小时，放冷，加0.5倍水，水浴去醇，转入分液漏斗中，用氯仿萃取3此（10，5，5ml），合并氯仿层，加少量无水硫酸钠干燥，回收氯仿即得总皂苷元。苷元柱层析分离称取100200目硅胶（105活化30分钟）50g，用苯做洗脱剂湿法装柱，柱顶放一层脱脂棉，压上数个玻璃球，放出多余的苯（至高于吸附剂1cm），计算保留体积。总皂苷元用少量苯溶解上柱，用苯乙酸乙脂（8：2）洗脱，薄层检识（与苷元标准品对照）相同组分合并，回收溶剂。齐墩果酸、人参二醇用95乙醇重结晶，人参三醇用丙酮重结晶，纯品80干燥，收集于小瓶中。 注：由于人参花、叶中人参皂苷含量高且廉价，所以本实验可用人参地上部分作原料进行实验，脱脂34次，由绿变棕红即可，其它操作同前。如果用人参根总皂苷元进行柱层析，要求学生精制人参二醇进行红外光谱鉴定。若用人参花、叶总皂苷元进行柱层析分离，则要求学生精制人参三醇进行红外光谱鉴定。2.3人参皂苷的检识2.3.1显色反应 醋酐浓硫酸反应（Liebermamm-Burchand反应）取人参皂苷样品少许，溶于冰醋酸中，加醋酐浓硫酸试剂（19：1）数滴，混匀，呈红紫色。 泡沫反应：取人参皂苷样品少许于试管中，加水23ml溶解，密塞，用力振摇1分钟，产生大量持久泡沫。2.3.2薄层层析一.人参皂苷TLC：吸附剂：硅胶G板展开剂：正定醇乙酸乙脂水（8：2：10）上层。氯仿甲醇水（13：7：2）下层。对照品：根、叶、花甲醇液(10mg/ml)显色剂：10乙醇液（V/V），110加热10分钟，至棕红色斑点出现。二.人参皂苷元TLC吸附剂：硅胶G板展开剂：苯乙酸乙脂（1：1）对照品：人参二醇、人参三醇、齐墩果酸甲醇液显色剂：同皂苷三.光谱数据齐墩果酸：IR ：3301，1700NMR()：5.30，1.85，1.63，1.24，0.91，0.75人参二醇：IR ：3301，1626NMR()：3.60，3.13，1.88，1.65，1.33，0.90人参三醇：IR ：3340，1617NMR()：6.32，4.60，3.62，1.95，1.60，1.30，1.16，1.04，0.90，0.82 3讨论 1.萃取操作时，注意振摇不能过于剧烈，以防止产生乳化现象。 2.人参皂苷的含量测定经典的方法是将其提取、分离、再与标准品(人参皂苷标准品)对照进行含量研究。通常用纸层析显色、薄层扫描或HPLC方法，这些方法适合于针对某一个皂苷的含量测定。但皂苷类化合物在结构上或药理活性有相似之处。所以测得某一单个皂苷的含量，有时并不能说明问题。苷药理作用相近，某种程度上，总皂苷是各个皂苷的总和。 3.利用试剂检识皂苷比较灵敏，但专属性较差。 4 结 论本实验使用溶剂提取法提取人参皂苷并对提取物进行鉴定。人参茎叶中的总皂苷含量是根中的2-3倍，国内外对人参茎叶皂苷提取工艺的报道很多，但由于制得的人参茎叶皂苷纯度低，农药残毒含量高，致使人参茎叶皂苷的生产和利用受到限制。 参考文献1. 高蔼茹,田尚衣,于玲玲等,人参茎叶总皂苷示差比色法测定,中药,1989,20(1):13142. 赵余庆,袁昌鲁,傅玉琴等,人参茎叶中微量三萜化合物的化学研究,药学学报1990,25(4):2973013. 刘昕,陈滴,李清民,刘松艳,L东北刺人参根挥发油成分GCMS分析-特产研究2008,30(2)4. 窦德强,靳玲,陈英杰,人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望J,沈阳药科大学学报,1999,16（2）151-1565. 王红艳,徐绥绪,陈英杰等,人参单体成分药理活性研究的新进展J,中国药物化学杂志,1992,2（3）73-786. 张树臣,中国人参 19927. 王本祥,人参的研究 20028. 杨国愉,冯正直,皇甫恩,苗