洋葱内表皮细胞骨架的观察.ppt

洋葱内表皮细胞骨架的观察 一 实验目的 二 实验原理 细胞骨架 cytoskeleton 是指真核细胞中的纤维蛋白所组成的网络结构 细胞骨架的概念 红 微丝绿 微管 微管 主要成分微管蛋白微管主要分布在核周围 呈放射状向四周扩散 电镜下的微管 1 微管蛋白 一 微管的化学组成 微管蛋白 微管蛋白 微管蛋白 异二聚体 2个鸟嘌呤核苷酸 GTP 结合位点 可与秋水仙素 长春花碱结合 微管蛋白 微管蛋白 异二聚体 聚合 首位相连 原纤维 微管 13 微丝的形态与组分形态 是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝 直径5 7nm 长短不一 在细胞中 微丝可成束 成网或纤维状分散分布 主要分布与细胞质膜的内侧 在具有运动功能的细胞中比较发达 微丝 化学成分 肌动蛋白肌动蛋白结合蛋白 中间丝 直径介与微管与微丝之间 故得名中间丝 中间纤维IF 8 10nm 中间纤维则分布在整个细胞中 IF结构稳定 既不受秋水仙素也不受细胞松弛B素影响 并且也没有极性 二 实验原理 细胞骨架的功能 微管 微丝 中间丝 二 实验原理 细胞骨架组成及分类 根据组成成分及形态结构 细胞膜骨架细胞核骨架细胞外基质细胞质骨架 广义 狭义 二 实验原理 细胞骨架观察方法 二 实验原理 试剂选用原因 戊二醛固定能较好保存骨架成分 考马斯亮蓝R250染色 使骨架蛋白着色 胞质背景着色弱 有利于骨架显示 注意微丝微管和中间丝都是直径很小的结构 最大的单根微管才25nm左右 只能在电镜下观察 本实验用普通光镜是因为骨架纤维成束分布 染色后有夸大作用 由于细胞经抽提后剩下的主要是细胞骨架 使之显现更清晰 M缓冲液 M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定 在M缓冲液中 其中咪唑是缓冲剂EGTA和EDTA螯合Ca离子 溶液并提供Mg离子 在低钙条件下 骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张 便于观察 TritonX 100 聚乙二醇辛基苯基醚 是一种非离子型表面活性剂 或称去污剂 分子量为646 86 C34H62O11 它能溶解脂质 以增加抗体对细胞膜的通透性 非离子型表面活性剂它在水溶液中不产生离子的一种表面活性剂 它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团 表面活性剂表面活性剂分子结构具有两亲性 一端为亲水基团 另一端为疏水基团 溶解于水中以后 表面活性剂能降低水的表面张力 并提高有机化合物的可溶性 考马斯亮蓝G 250 考马斯亮蓝有G 250和R 250两种 其中考马斯亮蓝G 250由于与蛋白质的结合反应十分迅速 常用来作为蛋白质含量的测定 3 戊二醛 作为一种有机交联剂戊二醛在一定条件下能将单体 线型高分子或预聚物转变成三维网状结构的物质 戊二醛在1 浓度时 交联度已达到很高的程度 在此浓度以下 随浓度下降 交联度下降 溶胀度和降解率增加 浓度超过1 时 各指标无明显变化 交联剂是一种能在线型分子间起架桥作用 从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构的物质 促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质 三 实验用品 1 材料 2 器材 3 试剂 洋葱鳞茎 显微镜 小烧杯 滴管 载玻片 盖玻片 镊子 M 缓冲液 6mmol L磷酸缓冲液 1 TritonX 100 0 2 考马斯亮蓝R250 3 戊二醛 3 0 戊二醛 用0 2mol L磷酸盐缓冲液配制 0 2 考马斯亮蓝R250 甲醇46 5ml 冰乙酸7ml 蒸馏水46 5ml 三 实验用品 4 试剂配制 1 TritonX 100 一般配成30 储备液 通常TritonX 100与M 缓冲液以所需比例混合置于30 40 水浴2 3小时 以便液体充分混匀 使用时将30 储备液临时稀释成1 M 缓冲液 四 实验方法 3 冲洗 吸去缓冲液 用1 TritonX 100处理洋葱表皮25min 3 戊二醛固定30min 撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约1cm2大小若干片 置于磷酸缓冲液的培养皿中 使其下沉 1 2min 吸去TritonX l00 用M一缓冲液洗3次 每次5分钟 四 实验方法 5 冲洗 6 染色 7 制片 8 观察 PH6 8磷酸缓冲液洗3次 每次5分钟 用0