生物制品复习整理.doc

1生物制品：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料，制备用于人类疾病的预防、治疗和诊断的药品。 2生物制品学理论基础及技术基础：以微生物学、免疫学、生物化学、分子生物学等学科为理论基础；以现代生物技术包括基因工程、发酵工程、蛋白质工程等为技术基础。3防疫制品：1）主动免疫；2）被动免疫：抗毒素及免疫血清，血液制品 1980年，WHO宣布已消灭了天花，第二目标消灭脊髓灰质炎，第三目标全球消灭麻疹。4生物制品种类：1）疫苗（主动免疫）细菌类疫苗：如卡介苗、伤寒Vi多糖疫苗等。 病毒类疫苗：由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、重组DNA疫苗、亚单位疫苗等，如麻疹、基因工程乙型肝炎疫苗等。 联合疫苗：由二种或二种以上疫苗抗原的原液配置而成的具有多种免疫原性的灭活疫苗或活疫苗，如百日咳、白喉、破伤风联合疫苗等。 类毒素：由细菌产生的外毒素，经解毒精致而成。如破伤风类毒素等。2）抗毒素及免疫血清：由特定抗原免疫动物所得血浆制成的抗毒素或免疫血清，用于疾病的治疗及被动免疫、预防。如白喉抗毒素等。3）血液制品：如人血白蛋白、人免疫球蛋白等。4）细胞因子制品：由健康人细胞增殖分离提纯或由基因工程技术制成的具有多种生物活性的多肽类或蛋白类制剂，如干扰素、红细胞生成素（EPO）等。5）诊断制品：1）体外诊断制品：如伤寒、副伤寒诊断菌液、沙门菌属诊断血清等。 2）体内诊断制品：锡克试验毒素、单克隆抗体等。5生物制品的三大作用：预防，治疗，诊断6免疫调节剂的作用：提高人体的非特异免疫功能，以达到防病治病的效果。分类：1）细菌类免疫调节剂：如卡介苗等。 2）细胞因子：人体内某些细胞能分泌多种具有生物活性的因子，如干扰素等。7诊断试剂分类：细菌学诊断试剂，病毒学诊断试剂，免疫学诊断试剂，临床化学试剂，肿瘤诊断试剂，其他常用试剂。诊断试剂在防病治病中起着重要的“侦定作用”。8临床化学试剂分类：标准品，质量控制物、检测试剂盒。 标准品：指作定量测定时的定标物或参比物。 质量控制物：也叫质控物，用来控制实验室测定质量，判定测定结果的可靠程度。 9生物制品发展历史上重要首创、年代及发明者？ 1798年英国Edward Jenner开创了弱毒活病毒疫苗，即牛痘苗，这就是生物制品的诞生；19世纪末Pasteur发现减毒疫苗；1884年Salmon Smith创造了灭活疫苗；20世纪30年代出现冻干人血浆制品。10我国生物制品：创始于1919年，北平的天坛成立中央防疫处（北京所前身）11第一代疫苗是传统疫苗，第二代是基因工程疫苗（基因重组疫苗）开发活疫苗，第三代是核酸疫苗（基因疫苗）DNA。12学习生物制品基础及技术的意义：生物制品是人类与疾病作斗争的必不可少的强大武器；生物制品是多学科、多科技的结晶；生物制品是生命制品；生物制品又是反生物恐怖的重要手段。13、预防制品发展趋势：除改进疫苗制品质量，提供免疫效果，降低接种副反应，今后主要发展趋势是开发各种联合疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等安全、有效、稳定的新型疫苗。1 生物制品质量的特性：安全性、有效性、可接受性。2 QA质量保证：为使人们确信某一产品或服务能满足规定的质量要求所必需的有计划、有系统的全部活动； QC质量控制：为达到质量要求所采取的作业技术和活动；GMP药品生产质量管理规范：是在药品生产的全过程中，用科学、合理、规范化的条件和方法来加以控制，使发生差错事故、混药、污染的可能性降低到最低程度，从而保证生产出优质药品的一套管理制度；质量监督：为确保满足规定的要求，对程序、方法、条件、产品、过程和服务的现状进行的连续监视和验证，以及按规定的标准对记录所做的分析。3 GMP基本内容：1）人员；2）硬件（厂房设施、设备、原材料等）；3）软件。4 实施GMP的目的和意义：1）实施GMP是我国医药产品进入国际市场的先决条件；2）实施GMP是企业及其产品增强竞争力的重要保证；3）实施GMP，才能使药品质量得到最大限度的保证，才能保障人民安全用药，这是企业对人民的安全与健康高度负责精神的具体体现。5 GMP强调药品质量是设计和生产出来的，而不是检验出来的。6 GMP对人员的基本要求？ 人员培训的基本内容：1）有关法律、法规、制度的培训；2）微生物学基础知识培训；3）岗位培训；（4）政治思想教育。 人员健康与安全：患有传染病、皮肤病等疾病的人员，必须调离原生产岗位，以免对环境和产品造成污染。生物制品生产人员的行为规范：（1）行为的自觉性（2）操作的标准性（3）操作的正确性。7 GMP对洁净室要求：温度控制18-26，相对湿度控制45%-65%为宜。冷库：2-8，湿度：40-60%。8 GMP对物料的要求? 原辅材料的贮存管理：1）待验、合格、不合格原辅料要分开放置，并有易于识别的明显状态标志，以防止相互混淆，不合格品能及时按规定处理；2）挥发性物品要分开存放，避免对其他物料造成污染；3）毒、麻药品、放射性物品、易燃易爆物品等严格按国家规定储存和管理。 工艺用水的要求：注射用水一般要求在制备后6小时内使用；制备后4小时内灭菌，72小时内使用，或80以上保温、65已上保温循环或4以下存放。9 GMP对卫生无菌管理的基本要求：1）环境卫生：绿化面积50-60%；2）工艺卫生：无积附尘埃；3） 人员卫生：每年体检一次，人是生产过程中最大的污染源。10、GMP对批生产记录管理要求：批生产记录应具有质量的可追踪性。填写好的批生产记录由专人保存至药品有效期后一年，若未规定有效期，则至少保存三年。防止药品污染和混淆的措施：1）加强操作人员的培训和管理，确保其熟悉SOP并严格执行，最大限度地控制由人为因素引起的污染和混淆；2）加强设备的清洗与灭菌管理，设备应有明显的状态标志；3）加强清场管理。10、验证工作基本内容：厂房、设施与设备的鉴定；检定及计量的验证；生产过程的验证；产品的验证。再验证：（1）强制性再验证；（2）改变性再验证；（3）定期再验证。1 生物制品检定目的意义：制品的质量是生产出来的，检定只是客观地反映产品的质量水平。通过检定可以发现制品中存在的质量问题，提出改进意见。从而促进质量的提高。检定是制品质量控制基本内容之一，是质量保证的关键环节。2生物制品检定的前提：生物制品是在GMP的要求下生产的制品，才能保证质量，这是前提。 依据：生物制品规程。 生物制品检定的对象：原料的检定；辅料的检定，包装材料的检定；中间产品的检定；半成品的检定和成品的检定。从性质来分为三方面：理化、安全性、效力。3半微量凯氏定氮法的原理：量取一定体积样品（含氮量12mg左右）于凯氏定氮瓶中，加浓硫酸进行消化至澄明蓝绿色，使样品中的含氮物质经消化后变为硫酸铵，然后用氢氧化钠释放氨，并用硼酸吸收，再以标准酸进行滴定，由滴定的毫升数求出总氮量。4酚试剂法（Lowry）测定蛋白质含量的原理：在碱性溶液中，蛋白质与铜离子形成复合体，再与磷钼酸磷钨酸试剂（酚试剂）反应呈深蓝色，显色强度与蛋白质含量成正比。在此同时，用牛血清白蛋白标准品制备标准曲线，从标准曲线即可求出蛋白质含量。5聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的双重作用？ 以聚丙烯酰胺凝胶为介质，进行电泳。这是目前分辨力最好的一种电泳方法，用PAGE分离蛋白质，不仅具有电泳作用，而且有分子筛效果。一般用于制品的有效蛋白成分及残留杂蛋白的检查。6免疫电泳的特点：琼脂电泳与免疫扩散相联合的技术，应用于可溶性抗原和抗体系统的检定。7电泳的原理：根据蛋白质的等电点不同，在不同环境中所带电荷的差异，以及分子大小的不同。使它们在电场中泳动速度不同而被分离开来，这就是电泳。8鲎试验的原理：革兰阴性菌细胞壁成分-内毒素，可激活鲎变形细胞溶解物中的凝固酶原成为凝固蛋白，再经交连酶的作用，进而聚合为纤维状凝胶，由此创立了细菌内毒素检测的凝胶鲎试验技术。本法灵敏度高，特异性好，简便。10血液制品中检查有关病毒所用试剂的要求：必须是国家批批检合格的试剂。11、理想效力试验具备条件：1）试验方法具最佳代表性；2）试验方法不应烦琐，应简便易行，重复性好；3）结果应明确；4）试验结果要能与流行病学调查基本取得一致；5）所用实验动物应标准化。12ED50：恰使实验动物半数能抗病症的剂量，称为半数有效量，用ED50表示。 LD50：在生物学试验中，恰使全部实验动物半数出现死亡所需的剂量，称半数致死量，用符号LD50表示。 Lf（絮状单位）：能和一个单位抗毒素最先发生絮状沉淀反应的类毒素（或毒素）量称为一个絮状单位（Lf）。常用絮状单位数表示类毒素或毒素效价。13活病毒感染细胞后引起的三种细胞病变现象：细胞圆缩、细胞破碎、细胞融合等现象。14生物制品的质量检定主要分哪几大类？（1）生物制品的理化检定；（2）生物制品的安全检定；（3）生物制品的效力检定。15.生物制品规程的性质：是国家标准和技术法规，是国家对生物制品的最底要求。16生物制品标准品：用一已知效价的制品作为对照来校正试验结果，这种对照品就是标准品或参考品。 使用标准品的作用：使检定的尺度统一，尽量减少误差，从而获得一致的结果。17制备标准品的最基本要求：准确和稳定。18生物制品检定规范化管理的基本要求？1）检定实验室设计布局：检定实验室与生产区分开；实验室的温、湿度、净化级别等符合实验室要求。2）检定实验室、设备、仪器、仪表、小容器玻璃器皿、量具：设备、仪器、仪表有专人保管、维修保养，建立档案；状态标志；小容器玻璃容器、具需经专人标化验收，合格后方能使用，并贴上合格证；实验室的洁净室应按要求定期进行监测。3）试剂、溶液、标准品、检定菌毒种的管理：按SOP配制，并做好记录。4）检定操作：检定SOP编制；记录、报告单保存至药品有效期后一年，如无有效期，则至少保存三年。 5）检定人员：中专或高中以上学历。6）取样：按规定取样方法、数量进行取样，使样品具有代表性。 7）实验动物管理：按要求。1培养基：人工配制的含有适合微生物生产繁殖所需营养成分的混合物。生物制品用培养基种类：1）无菌试验用培养基；2）菌种保存培养基；3）鉴别培养；4）产菌培养基；5）产毒培养基；6）细胞培养基。2培养基主要成分：1）氮源；2）碳源；3）无机盐；4）维生素及其它促细胞生长因子；5）水；6）凝固物质；7）指示剂；8）缓冲剂；9）抑制剂；10）其它。培养基作用：是能满足微生物生长繁殖要求的一种营养物质。 3培养基制备过程：1）计算材料用量；2）填写配制记录和化学材料称料单；3）称量；4）溶解；5）调整pH值；6）过滤:培养基煮沸3-5分钟后过滤；7）分装；8）灭菌；9）储存。 培养基的装量与器皿的大小为容积的2/3，玻璃器皿先12130分钟高压灭菌。 培养基质量控制：1）外观检验（颜色、澄明度、软硬度）；2）无菌和pH值检查（培养基使用前应倒扣置35温房培养24小时，证明无菌后使用）；3）性能检查。4生物制品用水的分类：1）纯化水（去离子水、蒸馏水）；2）注射用水。生产过程用水要求：1）凡直接进入制品的生产用水以及分装制品的安瓿、瓶、管等的最后冲洗都要用注射用水；2）凡粗洗、培养基配制、一般溶液的配制或需进一步纯化的半成品的生产用水，可用纯水。5、生物制品用水的制备方法？ 1）离子交换法：是使用一种称为离子交换剂的物质进行的。这种物质在溶液中能以所含的可交换离子与溶液中的同种电性的离子进行交换。原水中的阴阳离子杂质在通过离子交换树脂时，被吸附在树脂的活性基团上，使原水得到纯化。 2）膜分离法：利用了高分子薄膜选择性地截留水中某些分子，从而使水得到纯化。6、消毒：用化学药品或物理方法杀灭物体或环境中病原微生物的方法，一般只破坏繁殖体，不破坏芽孢。 灭菌：用化学药品或物理方法清除或杀灭所有活的微生物（致病微生物、非致病微生物以及它们的芽孢在内）的方法。7、物理消毒灭菌法种类及用途？1）煮沸法和流动蒸汽消毒法； 2）间歇灭菌法：适用于不耐高温的营养物质的灭菌；3）巴氏消毒法：不破坏物品原有质量；4）高压蒸汽灭菌法： 适用于棉花、金属、玻璃、搪瓷及水溶液制剂的灭菌；5）干烤灭菌法： 玻璃器皿、金属器械类、粉剂等物品的灭菌，可以破坏热原质；6）紫外线杀菌： 用于无菌室内空气消毒和工作台面的表面消毒，干扰细菌DNA复制；7）电离辐射灭菌法： 用于医药用品、食物、对热敏感物品和高分子塑料制成的医疗用品等的灭菌；8）微波灭菌法： 在食品工业、医疗行业很受欢迎。8、压力蒸汽灭菌原理：1）细菌蛋白质在含水多的环境中遇热易凝固；2）蒸汽传导快，渗透力强；3）蒸汽中有大量潜伏热，可迅速提高温度。 灭菌效果监测：生物指示剂监测，灭菌后将其取出置55-60温箱中孵育7天后判别结果。9、消毒剂种类：高效（杀灭细菌芽孢和真菌孢子在内的所有微生物，如过氧乙酸、环氧乙烷）、中效（杀灭除细菌芽孢之外的各种微生物，如甲醛、碘伏、石炭酸）、低效（杀死细胞繁殖体，如苯扎溴铵）。影响杀菌作用的因素：浓度；温度与时间；微生物种类；有机物质；pH值。1） 含氯消毒剂：杀芽孢；2）过氧化物类:过氧乙酸；3）碘类；4）醛类；5）醇类：杀繁殖体和结核杆菌； 6）酚类:石炭酸； 7）杂环类:环氧乙烷； 8）季胺盐类消毒剂：新洁尔灭、苯扎溴铵10、生物制品常用防腐剂：硫柳汞、石炭酸、硝酸汞苯、氯仿、其他。11、生物制品生产过程中的污水种类及危害性？ （1）含病原微生物污水：其中含有的病原微生物可引起疾病的传播，流行病爆发，甚至人的死亡；（2）有机污水：其中含有高浓度蛋白质，容易腐败，使水产生臭味，恶化水质；（3）酸碱污水：排入水中，会使水的pH值发生变化，影响水体本身的缓冲作用，破坏水生态系统；（4）放射性污水：含有放射性物质的废水将对人体产生全身性的损伤，甚至遗留后患。1、分包装的作用：1）保护内装物；2）方便使用：；3）构成商品，促进销售；4）物流合理化。2、洁净区（室）的生产管理：1）洁净区（室）的管理：进入洁净室的人员应严格的更衣后才能入内，洁净室每日要清洁消毒；2）工艺规程：每种产品必须制定工艺规程，严格遵守工艺操作规程，保证产品质量；3）生产记录：生物制品的每个生产工序，必须有详细的生产记录，内容真实，及时完整，签名负责，并保存一定时间备查。分装人员要求：生物制品GMP管理中对从事生物制品生产人员的基本要求有明确的规定。分装人员除了应具备这些基本条件外，在健康要求上应更为严格，凡有活动性结核病、急性传染性肝炎、乙型肝炎表面抗原携带者，应禁止直接参与分装工作。有其他传染病的患者，在传染期中，亦不能直接参与分装工作。待分装制品，最后一次无菌试验不可超过6个月、标签必须完整明确、按要求放置于2-8冷库或室温下。3、冻干的原理：先将制品的水溶液冷冻（-10-40）成固态，然后在低温及真空条件下，利用直接升华的方法除去其中的水分，从而达到干燥的目的。冻干优点：1）可避免药品因高热而分解变质；2）所得产品质地疏松，加水后迅速溶解恢复药液原有特性；3）含水量低，不易氧化，有利于产品长期贮存；4）产品中的微粒物质比用其它方法生产者少；5）产品剂量准确，外观优良。4、分装过程的注意事项？ （1）分装前要加强对待分装制品的核对； （2）待分装制品的标签必须完整明确； （3）分装过程中应严格注意无菌操作； （4）制品尽量由原容器内直接分装； （5）含吸附剂制品或菌悬液制品分装时必须不时搅动，务必使制品混合均一； （6）制品应随分装随熔封； （7）活疫苗等易受温度影响的制品，在整个分装过程中应严格控制室温及分装制品的温度； （8）不同种类或不同批号的制品，不得在同室同时分装；（9）分装后质量合格的制品在得到质量管理部门包装通知单后方可进行贴签包装；（10）分装工作应根据制品性质在适宜温度下进行。5、包装材料的要求及管理： 1）凡直接接触药品的包装材料、容器必须无毒，与药品不发生理化作用； 2）使用过的包装材料不得重复使用； 3）标签由专人领取，限额发放，并做好记录，使用数与发放数应核对无误； 4）包装材料、容器不准采用污染产品和环境卫生的草包、麻袋、柳框等； 5）药品包装、标签必须按国家药品监督管理局要求印制； 6）注册商标印刷在药品包装容器或标签显著位置。1、 安全防护的重要性:安全防护可以有效的在生产过程中避免人身或设备事故，保护劳动者的安全，保证生产过程安全、高效、合理的进行，促进生产的进步，提高职业生活质量，最终促进经济发展。2 化学危险品：凡是具有燃烧、爆炸、毒害、腐蚀、放射等危险性，并在一定条件下能引起燃烧、爆炸、导致人体中毒、灼伤、死亡等事故和财产受损毁的化学物品均称为化学危险品。化学危险品的分类及性质：1）爆炸品：因受外力作用或化学反应而发生燃烧和爆炸的物品；2）易燃液体：常温下液态存在，具有易燃性和挥发性闪点在45以下的物品；3）自燃物品：无需外界热源，适当条件下可以自行达到燃点的物品；4）遇水燃烧物品：与水分子发生化学反应释放易燃、易爆气体的物品；5）易燃固体：燃点低、燃烧激烈的固体物品；6）压缩气体和液化气体：常温常压下储存在耐压钢瓶中，在外力或高热作用下易发生膨胀、爆炸的物品；7）氧化剂：一定条件下发生化学反应释放氧气促进易燃物的燃烧和爆炸的物品；8）毒害品：进入人体后产生强烈的毒害作用，甚至可以导致死亡的物品；9）腐蚀物品：人体或者其他物品接触后产生破坏性腐蚀作用的物品；10）放射性物品：可释放穿透力强而又不易察觉的射线的物品。3、爆炸的分类：物理学爆炸；化学性爆炸；混合气体爆炸(氢气与空气的比例达到4.1%74.1%时，遇到明火就会发生爆炸。氢气含量过少或过多都不会爆炸)。5.钢瓶剩余压力的要求：瓶内气体得不用尽，必须留有剩余压力，一般不得小于0.05mPa。6.易燃液体：常温下液态存在，具有易燃性和挥发性。闪点在45以下的物品是易燃物品。7.毒物进入人体的途径：毒物主要经呼吸道、皮肤、消化道等途径进入人体，引起毒害。8.放射性废物放置衰变法：对半衰期短（T1/230天的固体或液体放射性废物，集中放置大约10个半衰期后，可按一般废物处理。9.低浓度的放射气体和气溶胶排放要求：可通过高出周围150米内建筑3米以上的排气烟囱排入大气。10.外源性感染：是指病原体来自感染者体外，包括患者，带菌者，带菌动物及外界环境。内源性感染：是指病原体来自感染者本身，这大多数为体内的正常菌群感染，当机体免疫功能降低或正常菌群平衡失调时引发二重感染。11.生物制品生产中微生物感染途径：接触感染；经口感染；动物咬、抓伤和昆虫媒介；经呼吸道吸入。12.生物制品生产中产生的气溶胶有三种：滴核（残留有被溶解的固体或微生物的悬浮颗粒）、干粉（操作中火焰封口、烧棉花塞、灼烧接种环等有细微颗粒散发）和浮尘（被污染的粉屑、皮屑等漂浮于空气中）。13、防止生物感染的个人防护？ （1）个人防护用品：每一级生物安全水平都要求穿戴特殊类型的实验防护服。 （2）手部防护：在实验室使用手套。 （3）呼吸道防护：防尘面罩、呼吸器。（4）眼及脸保护：在微生物实验室眼睛防护非常重要。14、感染性废物的管理及处理？ 1）有病原微生物的废物处理：用消毒液充分浸泡后，在密闭容器内彻底粉碎，高压灭菌消毒。2）脏器废物处理：经过高温蒸煮熟化处理，然后粉碎或者匀浆化，最后高压灭菌消毒。3）血液制品处理：静脉采血用过的棉签、棉球回收后集中焚烧；装标本的试管和容器灭菌处理；采血用注射器初步消毒后再清洗；一次性注射器须无害化处理；采血浆用一次性血浆袋、输血器用后毁形。1、 细菌类疫苗：用细菌、螺旋体或其衍生物制成，进入人体后，使机体自身产生抵抗相应细菌能力的生物制品，称为细菌类疫苗。细菌类疫苗的用途：1）主要用于防止细菌性传染病的发生和流行。2）预防生物武器。2、筛选生产用菌种的原则：安全性、免疫原性、遗传学稳定性、无致癌性、生产适用性。 主种子批：有一定数量的来自原始种子批经传代、扩增获得的菌株。工作种子批：有一定数量的来自主种子批经传代、扩增获得的菌株，其生物学特征应与原始种子批一致。3、疫苗生产人工培养方法：1）固体培养基培养法；2）液体培养基培养法；3）液体培养基厌氧培养法。4、生物反应器的基本结构：罐体、搅拌系统、加温和冷却系统、进出气系统、进出液系统、检测和控制系统、管线和接头。检测和控制系统：包含温度、pH、溶氧、搅拌、进出液流量的控制。 5、细菌发酵罐培养（百日咳疫苗）的主要步骤和基本内容 （1）发酵罐的清洁：物理、化学方法清洗（2）培养基的加入和灭菌：一般以120，灭菌2030分钟。（3）菌种接种：以无菌操作方式将扩量制备的菌种压入发酵罐。（4）培养：培养参数设定，温度、通气总流量、溶氧、pH、搅拌转速、培养时间810小时。（5）培养过程中检测：细菌形态；细菌浓度；pH值。6、霍乱：古典生物型能引发流行性霍乱病，El-Tor生物型引起副霍乱病。菌体抗原的脂多糖（LPS）成分具有血清分型意义。有A、B、C3个因子，分为小川型（A、B、极微量C）；稻叶型（A、C）；彦岛型（ABC），用于疫苗生产的菌株为小川型和稻叶型，El-Tor生物型。 疫苗类型：1）死疫苗：由菌体加毒素产物构成；2）活疫苗。菌种要求：1）应具有典型的生物学性质；2）在组成疫苗时，多选用不同生物性和血清型的代表株。研究现状及展望：从两方面进行，活疫苗最为理想、无疑是长远目标；对死疫苗研究具有现实的意义。7、伤寒：引起肠热症，LPS是毒力因子又是保护性抗原。Vi抗原与伤寒杆菌的侵袭力和致病性有关。 存在问题及展望：伤寒疫苗的副反应是所有全菌体死疫苗中最强烈的一种，尤其当与甲、乙或（和）丙型副伤寒疫苗联合使用时更为显著。8、百日咳：属嗜血杆菌属。相菌毒力最强，有免疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性。有外毒素和内毒素。主要的凝集因子有1、2、3，WHO推荐在疫苗中采用含有1、2、3型因子血清型菌株。 生产菌种要求：1）生产用菌株必须是相菌株；2）使用菌株应与流行菌株所具之抗原因子相符；3）必须使用冻干菌种，使其保持稳定。 无细胞百日咳疫苗主要抗原：FHA（丝状血凝素）、PT（百日咳毒素）。9、卡介苗：结核杆菌属，胞浆内的核糖核酸是产生免疫的有效成分。抗酸染色（异染颗粒）鉴别方法之一。疫苗株建立：卡介苗是从牛体分离的一株牛型结核杆菌，对人有致病力，前后共传代了231代，经约13年时间，终于获得一株独立稳定的减毒株。 生产的特殊要求：应在有隔离设备的完全隔离区内进行，制品检定也应在隔离实验室进行。制备卡介苗的工序应完全防止日光及紫外线的影响。生产人员无结核病，定期复查。人员要专职，不允许做其他传染性工作。 我国生产疫苗菌株历史：1948年自丹麦引进的丹麦823株，北京所保存的D1株，我所保存的称D2株。1993年在全国统一推行我所种子批菌种D2PB302S2甲10株为生产株。传代方法及代次：从1974年开始，我所采用纱膜传代取代马铃薯传代方法。菌种传代以不超过12代为限。生产用菌株的质量要求：具备毒力低、免疫原性好、生产稳定以及耐受冻干能力强的特性。存在问题及发展方向：目前，尚没有一个地区或国家消灭结核病；在结核病防治的主要措施中，疫苗接种比化学治疗有着经济、方便的优越性，可以推广到全世界。10、鼠疫疫苗：琼脂培养基上菌落为粗糙型，肉汤中有薄菌膜。易被普通苯胺染料着色。有毒素和内毒素。接种采用皮上划痕法。毒株：弱毒鼠疫EV活疫苗株。11、炭疽：链状排列，病原菌中最大的杆菌之一。抗原结构可分为菌体抗原、荚膜抗原和毒素抗原三种。毒素抗原中的保护性抗原或片段免疫动物均具保护作用。存在问题：活疫苗生产用毒株毒力不稳定；活疫苗免疫途径问题。发展方向：建立Aro-菌株；构建PA菌株；新型佐剂研究。12、流行性脑脊髓膜炎 ：脑膜炎双球菌呈“肾形”双球菌。用巧克力培养基，国内多用改良半综合固体或液体培养基。培养的菌落呈灰白色似露水滴状。 抗原结构与功能：1）荚膜抗原：分群物质基础，有效保护性抗原。2）脂多糖（LPS）：增加免疫原性。 分群与分型：根据荚膜多糖分为13个血清群。血清学分型主要是在LPS与外膜蛋白基础上进行的。流脑多糖提纯和精制工艺：提纯、精制全过程应在85低温室内进行并应用冷却试剂。提纯和精制步骤：1）去核酸：培养收菌加甲醛杀菌后，离心去菌体，上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵使终浓度为0.1%w/v。混匀后离心收集沉淀物。将沉淀物均匀地悬浮于注射用水内，加等量的2M氯化钙使十六烷基三甲基溴化铵多糖复合物分解，搅拌混悬液1小时。加无水乙醇至最终浓度为25%v/v，沉淀核酸和大量可溶性蛋白，静置3小时，离心去除沉淀，保留完全澄清的上清夜。 2）沉淀多糖：于上述上清液内加乙醇至最终浓度为80%（v/v）沉淀A群多糖。沉淀完全聚结后离心收集多糖沉淀。用一定量的无水乙醇至少洗三次，去除残余十六烷基三甲基溴化铵和氯化钙，沉淀物约再用一定量的丙酮洗二次，真空干燥，将粗制多糖保存在-20以下待进一步精制。 目前存在问题：为T细胞不依赖抗原，接种婴幼儿仅产生IgM抗体，而不产生回忆反应亦无加强应答，免疫效果差，在此年龄组的发病与病死率都较高。 发展方向：目前国内正在研究多糖结合疫苗。多糖联合疫苗也将是发展方向。13、目前我国生产的细菌类疫苗种类：1）死菌体疫苗：伤寒、钩端螺旋体； 2）活菌体疫苗； 3）多糖类疫苗：伤寒Vi、A群流脑；4）联合疫苗：破伤风联合疫苗； 5）治疗用疫苗：卡介苗多糖。14、细菌类疫苗的发展趋势：（1）传统疫苗：1）提高现有疫苗的质量；2）提取有效成分制备组份疫苗；3）开发减毒活疫苗；4）开发联合疫苗；5）开发临床用疫苗。 2）基因重组疫苗：1）基因定向灭活或缺失减毒活疫苗；2）基因重组亚单位疫苗；3）转基因植物疫苗；4）DNA疫苗。1疫苗发展三个时期：古典疫苗时期（牛痘、狂犬疫苗为代表）；病毒培养疫苗时期（传统疫苗为代表：病毒类传统疫苗培养“三步曲”动物培养、鸡胚培养、细胞培养）；基因重组疫苗时期。三次革命：组织培养技术为代表的第一次疫苗革命；基因重组技术为代表的第二次疫苗革命；以核酸（DNA）疫苗技术为第三次疫苗革命。3病毒培养方法：细胞培养法、鸡胚培养法、动物培养法。病毒检测方法：血清学方法（中和试验、血凝及血凝抑制试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验）外源性病毒检查；活病毒量测定；灭活病毒效力测定。4疫苗安全性应注意问题：1）减毒活疫苗：防止毒力返祖；2）灭活疫苗：灭活不彻底，后果严重；3）污染外源因子（制备原代细胞动物尽可能为SPF级）；4）疫苗中的致敏原的问题。5活疫苗与灭活疫苗的优缺点？疫苗种类优 点缺 点活1一般仅通过自然途径免疫一次，可产 生广谱抗体，并具细胞免疫作用1毒株有毒力回升，返祖的危险2可自然传播给接触者疫2产生局部的分泌性lgA，有局部免疫作用。3可能发生严重副反应4有污染外源因子或生物活性物质之可能苗3免疫持久性长，可能在局部消除野型病毒5可因病毒干扰影响免疫效果6不易保存，易被热灭活灭活1较为安全1一般需多次接种及加强免疫疫2能制备多价混合疫苗2不能诱生局部抗体，一般无细胞免疫作用苗3稳定，耐热性相对较好3需要病毒抗原高浓度 4.抗原制造较困难6病毒类疫苗生产对毒种要求：1）来源：必须建立毒株的完整历史资料；2）管理：必须经国家药品监督管理局批准。3）主要质控项目：检查合格。细胞的要求：1）原代细胞（来源于动物活体组织SPF级动物）；2）二倍体细胞（规定传代水平内使用）；3）传代细胞（一般不能用作疫苗生产）；4）细胞质控（性质、质量、安全性检查合格）。8脊髓灰质炎疫苗： Salk：用猴睾丸或肾组织培养，经甲醛灭活制成脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV），Sabin：猴肾细胞培养温度和筛选，选育出三个型的减毒活疫苗（OPV）。毒株、细胞：昆明女孩分离型病毒，用原代猴肾细胞和2BS细胞，研究用Vero细胞生产。口服糖丸。生产毒种专项检定：1）家兔试验（查猴B病毒污染）；2）Rct特征试验（查是否减毒株）；3） d特征试验；4）SV40序列测定（查猴SV40病毒污染）。病毒原液专项检定：1）MAPREC试验：预测猴体神经毒力；2）猴体神经毒力试验。存在问题：1）服疫苗后肠道排毒；2）服苗有关病例。发展方向：1）主张使用IPV；2）开发和使用联合疫苗；3）发展重组DNA疫苗。9. 麻疹疫苗：血凝素与血溶素。对热极不稳定。沪191株分离减毒过程：沪191株1960年上海分离。原代人胚肾细胞传33代，原代人羊膜细胞传39代，适应到原代鸡胚细胞5代后，将培养温度从37降低到31至第10代后用于疫苗生产。问题：原发性免疫失败；继发性免疫失败；发病年龄后移和小年龄发病；麻疹接种后的神经系统反应。发展趋势：1）分离流行病毒，筛选免疫原性好、副反应低的疫苗减毒株；2）开发鼻腔接种和气溶胶疫苗或口服疫苗；3）推广使用联合疫苗；4）发展重组DNA疫苗。10、腮腺炎：血凝素、血溶素和神经氨酸酶。仅有一个抗原型，对热极不稳定。毒株及细胞：我所用S79株，武汉所用Wm84株。国内外多用SPF鸡胚细胞。11风疹：BRD-株（北京所分离），兰州所用松叶株（原代兔肾细胞培养）。生产用细胞、收液方法：我国用2BS株和MRC-5株，静止或转瓶培养多次收获病毒液。临床效果：一次免疫的抗体阳转率均95%，90%以上可维持15年。 存在问题：国外报道成人妇女疫苗接种后可引起13%15%发生一过性关节炎或关节痛。12水痘：无血凝素与血溶素。对温度、有机溶剂及胃蛋白酶极为敏感。建立过程：1974年从儿童水痘疱液，接种人胚肺细胞传11代，适应到豚鼠胚细胞传12代，再适应到WI-38人二倍体细胞传2代，MRC-5二倍体细胞传3代减毒建立，Oka株是至今WHO唯一认可的水痘减毒活疫苗。我所于1996年从日本引进，2000年获得生产文号产品上市。生产用细胞：国内外多用人二倍体细胞（MRC-5株和2BS株），静止或转瓶培养方法。水痘病毒不易从细胞内释放，需收集感染细胞用超声波等方法处理释放病毒。13甲肝：只有一个血清型。H2株（KMB-17细胞）；L-A-1株（2BS细胞）。病毒培养时间长（最长28天左右），静止或转瓶培养，感染细胞用冻融或超声波等方法破碎细胞释放病毒。14流行性乙型脑炎病毒：有血凝素，有抗原决定簇。乙型脑炎灭活疫苗：P3强毒株，用地鼠肾细胞（未经纯化）和Vero细胞（培养纯化）转瓶培养法。存在问题：动物外源因子问题；副反应发生率较高。 临床使用：为减少甲醛引起的疼痛，需加入亚硫酸氢钠溶液中和甲醛后再进行接种。15狂犬病疫苗：血凝素，凝集鹅红细胞。街毒：是疯犬或其它疯动物发病时，存在于痰液内及神经系统中的天然狂犬病毒。固定毒：是由“街毒”通过家兔脑内生长而对家兔的潜伏期固定于一定天数的减毒株。历史：1977年WHO推荐人二倍体细胞培养疫苗；我国80年代使用未经浓缩和纯化的地鼠肾细胞疫苗，94年规定使用浓缩疫苗，2000年10月，国家规定生产纯化疫苗。我国生产两种细胞基质纯化疫苗类:地鼠肾细胞和Vero细胞纯化疫苗。现用疫苗类型：1）人二倍体细胞疫苗、2）Vero细胞疫苗（CTN-1株和aG株）、3）原代地鼠肾细胞疫苗（aG株）、4）原代鸡胚细胞疫苗。16流感：甲、乙、丙三型。甲型为流行形式，乙型引起局部爆发，丙型以散在病例形式出现。有HA和NA。甲型毒株根据HA和NA结构不同又可分成许多亚型。甲型HA有14个亚型，NA有9个亚型。目前生产疫苗类型及优缺点：（每年2月底根据WHO国际流感合作中心确认的流行毒型别株）1）全病毒疫苗：不能去除病毒的脂质体成分，副反应问题未能解决。2）裂解疫苗：去除了病毒脂质体成分，保留病毒的HA、NA和内部抗原，免疫效果及反应性均较好。3）亚单位疫苗：去除了病毒的脂质体和内部抗原，反应性明显减小，但成分免疫效果不如前两者。17乙型肝炎：有三种抗原抗体系统，HBSAg有三种分子形式。三种抗原表达系统：酵母系统（最成功）、哺乳动物细胞系统（CHO细胞表达疫苗）及痘苗病毒载体系统。18肾综合征出血热疫苗：复制时出现三种特征性包涵体，37以上易灭活。毒种：1）鼠脑纯化疫苗：型LR1株；2）细胞培养疫苗：型Z10株（沙鼠肾细胞培养），型L99株（地鼠肾细胞培养）。甲醛或-丙内酯为灭活剂。19病毒类新疫苗技术路线：传统疫苗技术；基因重组疫苗；合成肽疫苗技术；抗独特型抗体疫苗技术。1细菌毒素：许多致病性细菌能产生一些毒性物质，称为细菌毒素。分为外毒素和内毒素。类毒素：由外毒素经甲醛作用及加温处理去除毒性而仍保留其免疫原性者称为类毒素。它是一种自动免疫制剂。内毒素：是菌体细胞壁的结构成分，细菌在生活状态时不能释放出来，只有在细菌死亡之后菌体自溶或用人工方法使细菌崩解后才能释放至外界环境中。外毒素：是指细菌在生长过程中所产生的毒素，可从菌体扩散或自溶后释放到菌体外者，称为外毒素。2、毒性逆转条件：类毒素稀释，温度，游离甲醛浓度。甲醛含量高，毒素不逆转。逆转随温度升高加快。 脱毒：毒素变成类毒素的过程成为脱毒，类毒素比毒素更稳定。3、白喉类毒素生产用深层通气培养方法着重掌握环节？1）温度（最适温度为34-35）；2）pH（生长最适pH为7.0-7.6，3）产毒最适pH为7.6-7.8）；4）糖量（主要是麦芽糖）；5）气量（供给最够的溶氧量）；6）氮源和生长因子的补充；7）培养时间（一般为50小时左右）。4、破伤风类毒素精制工艺步骤：超滤浓缩、硫酸铵沉淀（两段法）、超滤透析、除菌过滤。5、抗毒素：系指用细菌外毒素或类毒素免疫动物取得的免疫血清。抗毒素种类：是免疫血清的一种。归纳为抗菌、抗病毒和抗毒血清三大类。6衡量抗毒素精制效果优劣主要指标：（1）纯净度；（2）提纯系数；（3）收获率。7新型类毒素发展趋势：亚单位疫苗、合成抗原、CRMs的应用、克隆化tox基因的应用。 新型抗毒素发展趋势：研究以生物工程制备人性特异单克隆抗体。 1血液制品：是由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组份或血细胞组份制品，如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组）、红细胞浓缩物等，用于诊断、治疗或被动免疫预防。 血制品种类及用途：1）蛋白类制剂（维持、调节血液渗透压；运输和解毒作用；营养作用）；2）免疫球蛋白制剂（增强机体体液免疫）；3）凝血因子制剂（血液凝固）；4）几种主要的微量蛋白制剂。2蛋白质的分离方法及选择原则？ 1）根据蛋白质溶解度不同，即按蛋白质亲水性和疏水性的差异，进行分离的方法。包括盐析法、有机溶剂法、疏水层析法、等电点沉淀法 2）根据蛋白质分子大小、形状和密度差异进行分离的方法。有凝胶过滤层析法（分子筛）、透析法、超滤法、离心和超离心法等。 3）根据蛋白质所带电性的不同进行分离。如离子交换层析法、制备电泳等 4）根据蛋白质立体结构中的特定位点与某种特定配体的特异亲和力进行分离，方法叫亲和层析法。3低温乙醇法原理：乙醇可使蛋白质沉淀，主要基于其能显著降低蛋白质水溶液的介电常数。乙醇具有较低的介电常数，对蛋白质而言，环境介电常数越小其溶解度就越低，低温乙醇法分离蛋白质就是利用了这个特性。影响蛋白质沉淀反应的“五变系统”：1）pH（4.47.4）； 2）乙醇浓度（040%）； 3）温度（0-8）；4）蛋白浓度（0.2%6.6%）； 5）离子强度（0.010.16）。4、压滤技术：是一项通过分离工艺、过滤结构和滤板的改进而形成的技术，我们把这种经过改进的固液相分离技术称为压滤技术，并应用于血液制剂生产。 特点：分离过程中，五变系统的系数控制精度要求更高，各组份的沉淀形态也有所改变，沉淀颗粒更细、更小。在压滤分离沉淀过程中，必须加入一定量的助滤剂。5、血液制品生产常用的精制技术：1）脱醇、脱盐、纯化及浓缩常用的方法（超滤法、真空冷冻干燥法、透析法、层析精制法）；2）配制；3）除菌过滤；4）真空冷冻干燥；5）离心机及超滤技术。6、影响血液制品安全性的因素：1）血液可被污染和传播病毒；2）有偿供浆制度和采浆站管理； 3）血浆检测技术的局限；4）病毒灭活及去除技术的局限；5）生产过程的再污染；6）血浆采集及血液制剂输注用的器材污染。7、常见血源性传播病毒及危害性：HBV；HCV；HDV；HIV-1和HIV-2（AIDS）；HTLV（成人T淋巴细胞白血病）； PVB（可引起暂时性病毒血症）；HAV；CMV（巨细胞病毒减毒染血症）。8、原料血浆的控制措施（病毒的检测项目）：目前检测HIV、HCV的试剂盒测定的都是血浆中抗-HIV、抗HCV抗体，由于“窗口期”的原因，可能存在虽检测结果为阴性，但血浆已受病毒污染的情况。9常用的病毒灭活技术及原理： 1）加热法：巴斯德法（湿热法）、干热法。 原理：利用热力对病毒和蛋白破坏作用的差异； 2）有机溶剂/表面活性剂（S/D）法。 原理：破坏病毒包膜脂质镶嵌层结构； 3）丙内脂/紫外线照射法。 原理：使病毒核酸突变，阻碍其复制； 4）低pH法。 原理：使病毒在酸性条件下，随时间和温度影响而灭活。10、血液制品成品的质量控制：1）安全性2）有效性：免疫球蛋白抗体效价、效价或蛋白含量的限量要求；3）稳定性。1基因工程：所谓基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒等载体分子，构成遗传物质新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，且能持续稳定地复制和表达。2、限制性核酸内切酶特点：对DNA分子双链有特异性识别序列部位；2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；断裂的结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端-即粘性末端。 DNA连接酶特点：限制性核酸内切酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，DNA连接酶将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子。3质粒：是一些细菌的亚细胞结构，是存在于多种细菌染色体外的遗传单位，它们是一类双链、闭环的DNA分子，常含有一些特殊编码的基因。4、质粒作为外源基因的克隆载体基本条件：1）具有对一种或书中限制酶都存在一个识别位点，并在插入外源DNA及酶切后不影响质粒的复制； 2）在限制位点插入外源DNA形成的重组质粒，必须能进入寄主细胞； 3）必须能够为寄主细胞提供易于检测的表型形状作为标记，在寄主细胞内能自我复制、稳定地遗传； 4）具有较低的分子量和较高的拷贝数，操作起来简单方便。5细菌转化：宿主细胞得到外源的基因，转入DNA的遗传物质，引起遗传性质的转变。6Southern blot原理：根据毛细血管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤模上，然后通过同DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被“吸印”的DNA片段，这种实验方法称DNA吸印杂交技术。它是由R.Southern于1975年首先设计出来的，故又称为萨瑟恩DNA吸印杂交技术。7生产用工程菌株需要检测项目：1）质粒图谱； 2）电镜检查；3）对各代工程菌的其他检测项目；4）工程菌种的稳定性检查。8、高密度发酵过程中应注意的问题：在不影响外源基因表达水平的前提下，提高工程菌的发酵密度。9蛋白分离的层析技术：1）凝胶过滤（排阻层析、分子筛层析，利用分子大小进行分离）；2）离子交换法（在不溶性介质上引进带电基团形成不同介质）；3）疏水层析（在介质表面引进有疏水作用基团，使表面含有疏水基团的目的蛋白与之作用而吸附上去）；4）亲和层析（利用生物大分子的特异性，可以与另外一些物质进行专一性的可逆结合进行层析）；5）径向层析（层析分离原理同膜分离原理过程的结合）10制订基因工程纯化工艺需注意的问题：1）纯度应尽可能高；2）收获率尽可能高；3）投资尽可能少；4）工艺路线尽可能简短； 5）注意提高经济效益。1、诊断试剂：是检测相关抗原、抗体或机体免疫状态的实验诊断制剂以及化学方法检测机体代谢功能正常与否的化学试剂的统称。分类：1）临床化学试剂；2）免疫学诊断试剂；3）细菌学诊断试剂；4）病毒学诊断试剂；5）肿瘤诊断试剂；6）其他常用诊断试剂。2诊断试剂的质