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MSI检测技术 微卫星简要介绍现用微卫星检测技术流程多重荧光PCR技术概略介绍毛细管电泳概略介绍微卫星检测的临床检测可行性 MSI检测技术摘要 MS Simplerepeatsequencesof1to6basepairs单核苷酸型 AAAAAAAA 双核苷酸型 ATATATAT 三核苷酸型 ATCATCATC MS Pronetoreplicationerrors DefectionofMMR MSinstability LS SporadicMSI LS MS 错误产生机制 Stutter又被称为影子带 或者DNA聚合酶滑脱产物 表现为PCR产物比主要扩增产物增加或减少一个或几个重复单位 MSIMAKERSINLS NationalCancerInstitute sponsoredworkshopin19972mononucleotiderepeats BAT25andBAT26 3dinucleotiderepeats D2S123 D5S346 andD17S250 Revisedin20025mononucleotiderepeats BAT25 BAT26 NR 21 NR 22 andNR 24 PromegaMSIAnalysisSystem5mononucleotiderepeats BAT25 BAT26 MONO 27 NR 21andNR 24 2pentanucleotiderepeats Penta CandPenta D criteria MSI HReplicationerrors 2makersMSI L1MSS0 实验流程 1 基因DNA的提取2 多重荧光PCR3 毛细管电泳检测4 分析数据 基因DNA的提取流程 Promega试剂盒法 分别挑选正常 肿瘤组织 显微切割 多重荧光PCR DiseaseMarkers20 2004 237 250JefferyW Bacher LauraA Flanagan 上游引物的5 端作荧光标记 JOE GreenFL BlueTMR Black 多重荧光PCR PCR反应体系 25 l 2 5 lGoldST R10XBuffer0 1 1 Meachprimers0 05 lAmpliTaqGoldDNAPolymerase 5Units l 1 2ngDNAPCR条件 1cycle95 Cfor11minutes 1cycle96 Cfor1minute 10cycles94 Cfor30sec onds ramp6secondsto56 C holdfor30seconds ramp50secondsto70 C holdfor45seconds 20cyclesat90 Cfor30seconds ramp60secondsto56 C holdfor30seconds ramp50secondsto70 C holdfor45seconds 60 Cfor30minutesfinalextension 4 Chold DiseaseMarkers20 2004 237 250JefferyW Bacher LauraA Flanagan 毛细管电泳检测 分析 微卫星位点经过荧光标记PCR扩增后 取适量PCR产物 分子内标 ILS600 溶于缓冲液 甲酰胺 中经遗传分析仪毛细管电泳进行扫描 通过检测片段长度来判断微卫星不稳定性 利用Genescan和Genetyper软件进行图像收集和分析 计算出微卫星等位变异扩增片段的大小 PromegaMSIAnalysisSystem Version1 2 横坐标代表片段长度纵坐标代表荧光强度 多重荧光PCR优点 多重PCR技术是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对 同时扩增多个序列 从而产生高度特异性的反应过程 该技术对DNA模板要求量小 高通量分析且省时 省力 省材 应用不同荧光标记可以解决不同PCR扩增位点长度的重叠 极大的提高效率 多重荧光PCR前提条件 所有引物对的退火温度必须接近 在同一反应体系中 所有引物对之间不能有相互作用 形成引物寡聚体 同色引物扩增产物应长度有别 这样才可同时对多个位点进行片段分析 毛细管电泳 清洗毛细管 更换电泳缓冲液 进样 电泳并同时在线检测 操作步骤 毛细管电泳优点 荧光标记毛细管电泳 FCE 快速 准确 敏感性强 可重复性好 结果易分析 高通量检测 客观性强聚丙烯凝胶电泳加放射显影或银染 传统方法 费时 步骤繁琐 判断结果主观性较强 MSI直肠癌的临床检测可行性 99 con cordancewithIHCNearly100 accuracyLowercostbacauseoftheuseofasinglemultiplexfluorescentMSIassayFindoutthosemisclassifiedonlybasedonIHC about5 MSI HtumorshadnormallevelsoffourMMRproteins DiseaseMarkers20 2004 237 250JefferyW Bacher LauraA Flanagan 关于突变的一些概念 Germlinemutation 由父母传给后代的突变 由于此种突变发生在精细胞和卵细胞中 故称为生殖系突变 Consititutivemutation 突变发生在配子或合子过程中 并且这种突变在合子分裂过程中得以保