海洋酵母菌发酵产铁载体的分析毕业论文.doc

海洋酵母菌发酵产铁载体的研究摘要铁载体在人类疾病的治疗、鱼病的控制及环境修复等方面有着巨大的应用前景。本次实验使用已知的高产铁载体的海洋普鲁兰类酵母HN6.2及其改造菌株菌株。将这两个菌株采用一系列不同的常用培养基进行培养，测量其在不同培养基中铁载体的产量。然后选取铁载体产量最高的培养基在2L发酵罐中进行扩大化培养。通过间隔连续取样，对菌株的生长情况、还原糖含量和铁载体产量进行检测，从而获得最佳的培养时间，从而为以后的实验提供参考。最终得到的最佳培养基为加入了鸟苷酸的产铁载体培养基，最佳的培养时间为108h,铁载体产量可达0.511g/L.关键词：普鲁兰酵母、铁载体、培养基、扩大化培养、培养时间The studies on siderophore production by the marine yeastAbstractSiderophore has a great prospect for the treatment of human disease, fish disease control and environmental restoration. High-yield siderophore strain Aureobasidium pullulans HN6.2 and Its strain of gene knock-out are used in this experiment . These two strains are cultured with a range of different commonly used culture media. Measuring the production of siderophore in these media, then select the medium whose production of Siderophore is the highest for enlarge culture in a 2L fermenter. By sampling every 12 hours, the growth of the strains, reducing sugar content and siderophore production were detected,Then the best culture time can be got which can provide a reference for further experiments.Keywords: Aureobasidium pullulans HN6.2, siderophore, medium, enlarge culture, Incubation time目录1前言11.1铁载体的定义11.3真菌铁载体的生物合成31.4铁载体的检测51.4.1化学法51.4.2生物法61.5铁载体的应用72不同培养基中海洋普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2的铁载体产量72.1实验材料与试剂82.1.1菌种82.1.2试剂82.1.3培养基82.2培养条件82.2.1平板培养82.2.2液体培养82.3铁载体浓度测量（Csaky试验法）92.4实验过程92.5实验结果与讨论93菌株的扩大化培养133.1 实验材料与试剂133.1.1 菌株133.1.2试剂133.1.3培养基143.2培养条件143.2.1平板培养143.2.2液体培养143.3铁载体浓度测量（Csaky试验法）143.4蛋白浓度测量（考马斯亮蓝染色法）143.4.1标准曲线的绘制153.4.2蛋白浓度测量153.5还原糖浓度测量（Somogyi-Nelson 比色法）153.5.1标准曲线的绘制153.5.2还原糖浓度测量153.6 实验过程153.7实验结果与讨论16参考文献16致谢161前言几乎对于所有的生物来说，铁都是一种必需的元素。作为一种过渡元素，铁可以再氧化与还原态之间进行可逆的转换。因此在许多不同的辅助因子当中都含有铁元素，比如血红素基和铁硫簇。这使得铁元素在包括脱氧核糖核酸合成，氧化磷酸化和电子运输在内的很多关键的代谢过程中都是不可或缺的。同时，铁元素也可以促进有害生物分子氧化。因此，通过控制铁元素的吸收和胞内储存，生物体体液内的铁元素浓度被牢牢的控制着。铁在地壳中的丰度很高，居所有元素第四位。因此自然界的铁元素含量相当丰富。然而由于大气中的氧气使铁氧化为难溶于水的氧化物或氢氧化物，生物可利用的铁的量极其有限。在可利用的铁元素极其缺乏的情况下，为了获取环境中的可溶性铁，大多数真菌都会合成至少一种类型的铁载体。为了能够正常生存，大多数的真菌和细菌都拥有某些特殊的机制以从它们的宿主之中获得铁元素。铁在许多生化反应中都有重要的催化作用。然而由于宿主的封闭，真菌和细菌等微生物往往不能随意的从其所生 存的环境周围获得铁元素。高亲和力的铁元素吸收系统使得真菌能够从它们所寄宿动物或植物体内获取有限的铁元素，比如铁载体介导的铁元素吸收和还原性铁的同化。要想保证细胞内正常的生化反应进行，同时又不会因为胞内铁元素过量而导致细胞中毒，就必须维持细胞内铁元素的稳态。而调节铁的吸收又对维持细胞内铁元素的稳态起了至关重要的作用。铁载体在真菌与宿主间的反应当中发挥着不同的作用。铁载体的生物合成大多需要费核糖体肽合成酶的参与。而非核糖体肽合成酶的基因敲除工作使得许多铁载体得以划定。这些分析表明在许多真菌当中毒力、抗氧化胁迫、有性及无性发展、铁元素的储存和防止铁诱导性中毒等方面均有铁载体的参与。1.1铁载体的定义铁载体是微生物适应低铁环境而合成的一类螯合铁离子的配位体（Winkelmann，1991），其分子量一般不大，约为5001000Da。绝大多数真菌和细菌都可以产生铁载体。有一些微生物虽然不能产生铁载体，但却可以利用其他微生物合成的外源铁载体，如酿酒酵母（Lesuisse et al.，1998）。铁载体最显著的特点就是对于三价铁离子超高亲和力，它甚至可以让微生物从不锈钢当中提取铁元素(Askwith et al. 1996; Neilands &Neilands 1995)。Neilands（1981）将铁载体的特性归纳如下：（1）相对分子质量很小（5001000Da），也有文献报道1500Da；（2）它们对高铁离子具有高度特异性，高亲和力，结合常数在10251052之间，可以从宿主体内铁结合蛋白上摄取铁；（3）其生物合成受溶液中铁浓度的调节。1.2铁载体的分类根据其化学组成，铁载体可以大体可以分为三种：1邻二苯酚类（catechols） 2羧酸类（carboxylates）3异羟肟酸类（hydroxamates）。除了由接合菌生产的羧酸类铁载体，几乎所有的真菌铁载体都是异羟肟酸类(van der Helm and Winkelmann 1994)。大多数铁载体具有三个可以螯合铁的部位。值得注意的是，有为数不少的真菌不仅可以摄取自身合成的铁载体，而且也同样可以摄取有其他真菌合成的不同类型的铁载体。这种生存策略可能是为了与其他种类竞争或是为了保护自身能量代谢而进化出来的。除了辅助摄取环境中的铁，铁载体在胞内铁的贮存当中也起着一定作用。在很早以前就已经有人详细的发表过异羟肟酸类铁载体的化学性质(van der Helm and Winkelmann 1994; Renshaw et al. 2002)。真菌的异羟肟酸类铁载体主要由四个家族组成：（1）玫瑰红酵母酸（rhodotorulic acid）（2）萎蔫酸（fusarinines）（3）粪生素（Coprogens）（4）高铁色素（ferrichromes）。其代表性的结构及特点如图1-1所示：图1-1真菌异羟肟酸类铁载体结构Fig1-1 Structures of fugal hydroxamate siderophores大多数铁载体包含三个羟基，这些羟基与肽键或酯键相连形成一个八面体复合体。玫瑰红酵母酸的的结构最为简单，是N-乙酰-N-羟基鸟氨酸的哌嗪二酮。重要的是，这种铁载体仅包含两个羟基基团，并形成铁2（玫瑰红酵母酸）3复合物。萎蔫酸可以是单体、线性二聚体或三聚体，或环状三聚体。萎蔫酸的前体，环状萎蔫酸C（也叫梭原素），包含有三个顺式N-乙酰-N-羟基鸟氨酸（被称为单体顺式萎蔫酸）。它们之间以酯键相互连接。萎蔫酸C的N-乙酰化导致了更加稳定的三聚体萎蔫酸C的形成。粪生素中有两个反式萎蔫酸以头对头的方式通过肽键形成一个哌嗪二酮单位，还有一个反式萎蔫酸分子通过酯键连接到肟酸的碳末端基团上。高铁色素（ferrichrome）与铁色素（Ferrichromes）相似。高铁色素A和铁菌素都是包含有三个N-乙酰-N-羟基鸟氨酸和三个氨基酸所组成的环状六肽。三个氨基酸分别是甘氨酸，丝氨酸或丙氨酸。需要注意的是，高铁色素和粪生素是指其各自家族的特定成员。1.3真菌铁载体的生物合成真菌铁载体大多是源于L-鸟氨酸的异羟肟酸盐型（Plattner and Diekmann，1994），不像细菌那样变化很大。由于真菌异羟肟酸型铁载体相同的基本单位是N-酰基-N-羟基-鸟氨酸，所以，它们的生物合成途径是非常相似的（Hider，1984；Mei and Leong，1994）。1994年Plattner和Diekmann提出真菌铁载体大致的生物合成途径（Plattner and Diekmann，1994）（图1-2）。首先是L-鸟氨酸在L-鸟氨酸-N-羟基化酶（L-ornithine-N-hydroxylase）的催化下通过N-羟基化形成N-羟基-L-鸟氨酸（Winkelmann，1992；De Luca和Wood，2001）第二步是N-羟基-L-鸟氨酸通过酰基化形成N-酰基-N-羟基-L-鸟氨酸（Plattner and Diekmann，1994）。这是大多数真菌铁载体的基本结构单位。酰基供体是酰基CoA的衍生物，这步反应是由酰基CoA：N-羟基-L-鸟氨酸-N-酰基转移酶催化的。第三步是几个N-酰基-N-羟基-L-鸟氨酸单位的缩合（Plattner and Diekmann，1994）。两个或三个单位缩合形成二肽或三酯，如链孢氨酸C（fusarinine C）、红酵母酸和粪生素B（coprogen B）。对于铁色素（ferrichromes）的合成，这些单位与氨基酸缩合形成环肽。值得注意的是铁载体合成过程中的缩合是由非核糖体肽键合成酶（NRPS：non-ribosomal peptide synthase）催化的，与一般蛋白质在核糖体上由肽键合成酶催化合成的方式不同（H.Haas，2003）图1-2真菌异羟肟酸类铁载体的生物合成途径Figure1-2 The biosynthetic pathway for hydroxamate siderophores in fungi1.4铁载体的检测铁载体的检测方法有很多。并且随着相关学科的不断发展，新的检测方法不断出现，原有的检测方法也得到了很大改进。现将铁载体的常用检测方法总结如下：1.4.1化学法Arnow在1937年提出儿茶酚法（Catechols）。这种方法主要用于儿茶酚类铁载体的检测，其大体原理为：Fe3+儿茶酚类铁载体与儿茶酚类铁载体结合后呈红色的显色反应，并且在510nm有最大光吸收值，根据此波长下样品的吸光度可对铁载体进行定量检测和测定（Arnow，1937）。Schwyn和Neilands在1987年提出了CAS法（Chrome Azutol S）。该法为验证铁载体的产生和存在提供了一个快速便捷的检测方法。此法不依赖于铁载体的结构，而是通过螯合作用产生的显色反应来检测铁载体。它的原理是：在有铁载体存在时，由于铁载体能够与Fe3+形成更稳定的螯合物，伴随着Fe3+从其结合紧（消光系数至少100000）的蓝色化合物转移到铁载体中而发生颜色变化，其颜色从蓝色转变为橙色或紫色。此法可以根据颜色的深浅通过比色法来定量计算铁载体的浓度（Persmark et al.，1989）。CAS分析法是一种高灵敏度的化学方法，这种方法不依赖于铁载体的结构而是基于铁载体对Fe3+的亲和性。其原理可用下面的化学式表示：FeDye3-x + Ly- FeL3-y + Dyex-Csaky试验法是检测异羟肟酸酸类铁载体最灵敏、专一性最强的方法。该方法是从检测羟胺的方法发展而来的（Csaky，1948）该方法中需要将样品在硫酸中加热，从而释放出在酸性条件下稳定的游离态羟胺，而其它可能干扰测定的含氮化合物在酸性条件下不稳定。经过这些处理，含异羟肟酸类样品的颜色由红色变为紫色，所以可以在520nm下通过比色进行定量测定。本次实验中对铁载体的检测就是使用了该方法1.4.2生物法生物法检测铁载体是一种定性的检测，不像化学法可以进行定量检测。但是它可用以考察微生物合成铁载体的能力。常用的方法有有限铁生长法（Iron-limitied culturing）和交叉培养法（Cross-feeding）限铁生长法就是通过在培养基中加入与铁具有高亲和力的化学螯合物（如EDDHA、双吡啶）来获得低铁条件（Hiroaki et al.，2002；Hiroshi et al.，2000）。在低铁培养基中生长时，微生物分泌螯合能力更强的铁载体到培养基中与螯合剂竞争铁（Crowley et al.，1991）。如果微生物能够在低铁介质中生长良好，证明其能够分泌螯合铁能力更强的铁载体，因此，可以根据微生物在低铁介质中生长状况判断其能否合成铁载体及其合成铁载体的能力。交叉培养法则是用已知的指示菌株检测未知的待测菌株，指示菌自身不能合成铁载体，但其质膜上具有能够吸收利用铁载体必需的受体蛋白，因此必须利用外源铁载体来维持生长。将待测菌的培养上清液、提纯的铁载体或细胞活体加入到已经接种了指示菌的限铁培养基中，经过适当培养后，观察指示菌的生长情况。如果指示菌生长，表明指示菌生长所需的铁载体来自于待测菌，则说明待测菌能够合成铁载体。由于不同铁载体之间，不同菌株之间存在差异，不同铁载体的检测方法各有利弊。目前尚没有一种可以快速准确检测所有铁载体的方法。因此应在实际实验中根据具体情况选择适当的方法。1.5铁载体的应用治疗像-地中海贫血的铁过量和铝过量的症状的药物一般被称为DFO（Day and Ackrill，1993；Faa and Crisponi，1999），它也是铁载体。但是它有一系列的副作用（Dexter et al.，1999；Kontoghiorghes，1995；Martell et al.，1999），所以有人想利用天然产生的铁载体（Bergeron et al.，1994；Peterson et al.，1976）和人工合成的铁载体类似物（Dexter et al.，1999；Hershko et al.，1998；Martell et al.，1999）作为治疗Fe和Al过量的口服DFO的有效替代物，从而来治疗这些疾病。通过对5个地中海贫血症病人的静脉注射真菌异羟肟酸类铁载体红酵母酸，取得了一定疗效。但是在动物实验中发现，口服红酵母酸并没用明显效果。铁载体在实际应用中的另一个被人关注的地方就是它对锕系元素的溶解性（Brainard et al.，1992）。锕系元素具有放射性，不仅是是潜在的致癌物，而且还会对环境造成放射性污染。利用铁载体的该性质，可以治疗锕金属中毒（Faa and Crisponi，1999；Loyevsky et al.，1993； Stradling，1998；Weinberg，1999），亦或是利用铁载体处理含锕系元素的放射性污水。2不同培养基中海洋普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2及其改造菌株R6的铁载体产量 海洋普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2是一株高产铁载体的酵母菌株。其改造菌株R6敲除了SreA基因。该基因在周围环境铁离子充足的情况下可以抑制铁载体合成。因此，改造菌株的铁载体合成受周围环境中铁浓度的影响较小。为了衡量天然培养基和合成培养基之间哪个更有利于铁载体产生，本次实验将海洋普鲁兰类酵母HN6.2及其改造菌株R6分别接种于三种不同天然培养基和实验室常用产铁载体培养基之中，并以Csaky试验法测量铁载体浓度。以此选出最适宜菌株产铁载体的培养基，为下一步实验做准备。根据相关资料，产铁载体培养基加入L-鸟氨酸后铁载体的产量明显增加。因此本次实验也对天然培养基加入了L-鸟氨酸，以此来测试L-鸟氨酸是否对天然培养基也有同样的效果。2.1实验材料与试剂2.1.1菌种海洋普鲁兰类酵母HN6.2HN6.2的改造菌株R6（敲除了SreA基因，其铁载体产量受周围环境中铁浓度的影响减弱）2.1.2试剂1N H2SO4溶液醋酸钠溶液（Sodiun zcetate）: 35g醋酸钠晶体溶于100mL蒸馏水中对氨基苯磺酸(Sulfanilic acid):1g对氨基苯磺酸溶于100mL，30（v/v）的乙酸中，加热溶解。碘溶液（Iodine solution）:1.3g碘溶于100mL冰醋酸中硫代硫酸钠溶液：-萘胺（-Naphthylamine solution）:3g-萘胺溶于100mL，30的乙酸中1M L-鸟氨酸豆饼粉水解液配置：称取32g豆饼粉，溶解于250ml 0.5N的稀HCl中。110灭菌20min,趁热调pH至6.2。10000rpm离心5min，取上清液用滤纸过滤。用蒸馏水将滤液定容至800ml。分装于塑料瓶中冷冻备用。2.1.3培养基YPD培养基（w/v）：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，固体培养基加2.0%琼脂粉。麦芽汁培养基（w/v）：葡萄糖2.0%，麦芽浸粉2.0，pH 6.2豆饼粉水解液培养基（w/v）：葡萄糖2.0%，豆饼粉水解液配制，pH 6.2产铁载体培养基（w/v）：蔗糖2.5%，(NH4)2SO4 0.4%，K2HPO4 0.3%，柠檬酸 0.1%，MgSO4 0.008%，ZnSO4 0.0002%，pH 6.2。配制过程中所用的玻璃器皿都经过6 N的HCl溶液浸泡过夜，用三蒸水冲洗，去除容器上附着的痕量铁，以避免其对实验引起干扰2.2培养条件2.2.1平板培养将菌种接于YPD培养基，在28下培养48h。2.2.2液体培养将活化的酵母菌接种于5.0 mL各培养基中，在30和180 rpm下振荡培养24h，即为种子液。取一定量的种子液接入装有50ml各种培养基的250ml三角瓶中（使接种后OD600nm为0.3）。在28下，180rpm摇床培养120h。其它培养条件按实验要求进行。2.3铁载体浓度测量（Csaky试验法）（1）取1mL待测液，加1mL1N的H2SO4,130下处理30min或沸水浴6h（2）加入3 mL醋酸钠（3）取上述反应液1 mL，加4 mL蒸馏水（4）加0.5 mL对氨基苯磺酸和0.2 mL碘溶液（5）室温下放置5-7min（6）加0.2 mL硫代硫酸钠去除多余碘（7）再加入0.1mL-萘胺，显色20-30min后测520nm处吸光度（8）经标准曲线y=0.1313x+0.0012计算，可得羟胺浓度2.4实验过程将海洋普鲁兰类酵母HN6.2及R6别接种于YPD平板上，在28下培养48h，以活化菌种。将两组活化的酵母菌分别接种于5.0mlYPD液体培养基、麦芽汁培养基、豆饼粉水解液培养基和产铁载体培养基上，28和180rpm下振荡培养24h，作为种子液。将装有50ml各种培养基的250ml三角瓶分为两组，每一组均是由YPD培养基、麦芽汁培养基、豆饼粉水解液培养基、产铁载体培养基组成。其中一组每瓶中加入500uL的 L-鸟氨酸，另一组则不加。将种子液分别接种于两组培养基中（使接种后OD600nm为0.3），在28下，180rpm摇床培养120h。从每个三角瓶分别取5.0mL菌液，12000rpm下离心5min。分别测量上清液羟胺浓度，并根据稀释倍数换算为铁载体浓度，相互比较。2.5实验结果与讨论经不同培养基培养并处理后，测量520nm处的吸光度值。从图2-1,2-2中我们可以看出产铁载体培养基相比于其他天然培养基更有利于菌种生产铁载体。同时我们将加L-鸟氨酸组和未加L-鸟氨酸的相同培养基的铁载体产量相比较，发现产铁载体培养基在加入L-鸟氨酸后，铁载体产量明显增加，这与已知结论相符。而各种天然培养基加入L-鸟氨酸后铁载体产量增加则不明显（图2-3,2-4）。由此可见L-鸟氨酸对天然培养基效果不大。图2-1未加入L-鸟氨酸的铁载体浓度Figure 2-1 Siderophore concentration without L-ornithine 图2-2加入L-鸟氨酸的铁载体浓度Figure 2-2 Siderophore concentration with L-ornithineData are given as means SD, n=3.经过以上一系列实验，从图2-1中我们可以清晰的看出，菌体在产铁载体培养基中的铁载体产量远远大于在其他培养基中的产量；从图2-2中可以看出产铁载体培养基在加入了L-鸟氨酸后，菌株的铁载体产量明显增加，而L-鸟氨酸则对各种天然培养基中菌株的铁载体产量影响不大。由图1-2我们可以知道，L-鸟氨酸是铁载体合成的原料之一，因此加入L-鸟氨酸有利于铁载体的合成。而在天然培养基中，菌体可利用的铁较为充足，因此铁载体的合成不旺盛，L-鸟氨酸的影响也就相对较小。我们发现加入L-鸟氨酸的产铁载体培养基最有利于铁载体合成，而且在相同条件下经改造的菌株R6铁载体产量优于原菌株HN6.2。因此我们选用产铁载体培养基和菌株R6进行下一步的扩大化培养。3菌株的扩大化培养如上所述，在扩大化培养的中，我们使用加入L-鸟氨酸的产铁载体培养基在2L发酵罐进行发酵。发酵温度为28，发酵罐转速为200rpm。为了获得最佳的培养时间，我们每个12h进行一次取样，以测量发酵罐中的菌体生长情况和铁载体产量。3.1 实验材料与试剂3.1.1 菌株海洋普鲁兰类酵母HN6.2的改造菌株R6。3.1.2试剂考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)：称取100g考马斯亮蓝G250，溶于50 mL 90乙醇中，加入85的磷酸100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在棕色瓶中。标准蛋白质溶液：称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，配制成1mg/mL蛋白溶液。铜试剂：A. 4 CuS04 5H20 B. 称取 24g 无水碳酸钠，用 850m1 水溶于大烧杯中，加 120g 含 4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（可适当加热）后加入碳酸氢钠 16g, 再加入 120g 无水硫酸钠，全溶及冷却后加水至 900m1 ，沉淀 12 天，取上清液（要求严格时过滤）即可备用。使用前将 A 与 B 按 1 ： 9 混匀即可。砷钼酸试剂：25g 钼酸铵溶于 450ml 蒸馏水中（加热溶解，但温度接近 150 时易分解），待冷却后再加入 21 ml 浓 H2SO4 混匀。另将 3g 砷酸氢二钠（ Na2HAs04 . 7H20) 溶解于 25ml 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期备用。葡萄糖标准液：准确称取分析纯葡萄糖 200mg, 溶解定容到 l000ml。1N H2SO4溶液醋酸钠溶液（Sodiun zcetate）: 35g醋酸钠晶体溶于100mL蒸馏水中对氨基苯磺酸(Sulfanilic acid):1g对氨基苯磺酸溶于100mL，30（v/v）的乙酸中，加热溶解。碘溶液（Iodine solution）:1.3g碘溶于100mL冰醋酸中硫代硫酸钠溶液：-萘胺（-Naphthylamine solution）:3g-萘胺溶于100mL，30的乙酸中3.1.3培养基固体YPD培养基：（w/v）：葡萄糖2.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，琼脂粉2.0%。产铁载体培养基（w/v）：蔗糖2.5%，(NH4)2SO4 0.4%，K2HPO4 0.3%，柠檬酸 0.1%，MgSO4 0.008%，ZnSO4 0.0002%，pH 6.2。3.2培养条件3.2.1平板培养将菌种接于YPD培养基，在28下培养48h。3.2.2液体培养将活化的酵母菌接种于150 mL的产铁载体培养基中，在30和180 rpm下振荡培养40h，即为种子液。取一定量的种子液接入装有1.5L产铁载体培养基的2.0L发酵罐中（使接种后OD600nm为0.3）。在28下，转速200rpm培养120h，并每隔12h进行一次取样检测。其它培养条件按实验要求进行。3.3铁载体浓度测量（Csaky试验法）（1）取1mL待测液，加1mL1N的H2SO4,130下处理30min或沸水浴6h（2）加入3 mL醋酸钠（3）取上述反应液1 mL，加4 mL蒸馏水（4）加0.5 mL对氨基苯磺酸和0.2 mL碘溶液（5）室温下放置5-7min（6）加0.2 mL硫代硫酸钠去除多余碘（7）再加入0.1mL-萘胺，显色20-30min后测520nm处吸光度（8）经标准曲线y=0.1313x+0.0012计算，可得羟胺浓度3.4蛋白浓度测量（考马斯亮蓝染色法）3.4.1标准曲线的绘制以1mg/mL蛋白溶液按照表3-1，将其配成不同浓度。595nm下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。表3-1 标准曲线绘制配比管号123456蛋白质标准液(ml)0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水(ml)1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 蛋白质含量(ug)020406080100考马斯亮蓝溶液(ml)555555最终所绘标准曲线如图3-1所示图3-1 蛋白浓度标准曲线（OD595）Fig3-1 The standard curve of protein3.4.2蛋白浓度测量取待测样品200ul，加入1ml考马斯亮蓝。3min后，595nm下比色，根据标准曲线即可得到蛋白浓度。3.5还原糖浓度测量（Somogyi-Nelson 比色法）3.5.1标准曲线的绘制在 7 支刻度试管中，分别加入 200ug/ml 标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，再顺序加入蒸馏水2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4ml，配成每毫升含0、10、30、40、50、60ug 葡萄糖的溶液。每试管加入铜试剂 2m1, 混匀后沸水浴中加热 10min ，立即冷却，再加入 2m1 砷钼酸试剂。 用分光光度计在 620 nm 波长下比色，测其吸光度。以吸光度为为横坐标，糖浓度（ ug/ml ）纵坐标，绘制标准曲线。最终所绘标准曲线如图3-2所示图3-2 葡萄糖浓度标准曲线（OD620）Fig3-1 The standard curve of glucose3.5.2还原糖浓度测量取待测样品400ul，加入400ul铜试剂。沸水浴中加热 10min后，再加入 2m1 砷钼酸试剂。 用分光光度计在 620 nm 波长下比色。根据标准曲线即可得知样品内的还原糖浓度。3.6 实验过程将海洋普鲁兰类酵母HN6.2的改造菌株R6接种于YPD平板上，在28下培养48h，以活化菌种。将活化的酵母菌接种于150 mL的产铁载体培养基中，在30和180 rpm下振荡培养40h，即为种子液。取一定量的种子液接入装有1.5L产铁载体培养基的2.0L发酵罐中（使接种后OD600nm为0.3）。在28下，转速200rpm培养120h，并每隔12h进行一次取样。对所取样品平均分为两份。在12000rpm下离心5min。其中一份样品取上清液，测量其铁载体浓度及还原糖浓度，并烘干，测量菌体质量。另一份样品弃去上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3次。用一定体积的蒸馏水重新溶解沉淀，进行超声波细胞破碎。测量细胞破碎后的悬浊液的胞内蛋白浓度，并对悬浊液12000rpm下离心15min,测其铁载体浓度。由此可计算出每克蛋白质所包含的铁载体量。根据多次取样测量的结果，绘制发酵的菌体生长、铁载体产量及还原糖浓度的曲线，根据曲线可得到最佳的培养时间。3.7实验结果与讨论R6菌株在含蔗糖2.5%，(NH4)2SO4 0.4%，K2HPO4 0.3%，柠檬酸 0.1%，MgSO4 0.008%，ZnSO4 0.0002%，10 mM L-鸟 氨酸，pH 为6.2的1.5L产铁载体培养基中经过120h的发酵，根据每隔12h取样的结果，绘制出其菌体生长曲线，铁载体产量曲线及还原糖浓度曲线如图3-7、3-8、3-9、3-10所示图3-7 发酵罐中最佳发酵条件下R6的菌体生长曲线Fig3-7 Time course of cells growth by the yeast R6Data are given as means SD, n=3.图3-8发酵罐中最佳发酵条件下R6的胞外铁载体浓度Fig3-8 Time course of the siderophore production out of cells by he yeast R6Data are given as means SD, n=3.图3-9 发酵罐中最佳发酵条件下R6的胞内铁载体浓度 Fig3-9 Time course of the siderophore production in cells by he yeast R6Data are given as means SD, n=3.图3-10 发酵罐中还原糖的浓度Fig3-10 Time course of Reducing sugarData are given as means SD, n=3.由图3-7、3-8我们可以看出，细胞干重的增加在96h后减缓，胞外铁载体浓度在108h处有最大值0.511g/L。图3-9显示胞内铁载体浓度总体呈上升趋势，并且同样在108h处有最大值。但胞内铁载体浓度相对于胞外要低得多，特别是到了发酵后期，几乎可以忽略不计。从图3-10可以发现还原糖的的浓度有一个先升后降的过程。原因可能是由于产铁载体培养基的碳源为蔗糖，属于非还原性糖，因此在开始阶段还原性糖的浓度极低。随着菌体生长，蔗糖被分解为还原性的葡萄糖和果糖，故还原糖浓度升高，随着菌体数量的增加，碳源被逐渐消耗，所以发酵后期，还原糖浓度降低。综上所述，以R6菌株，使用产铁载体培养基在2L发酵罐中以最佳条件发酵，在108h左右铁载体产量最高，菌体生长充分，碳源也基本上得到了充分利用。因此在此条件下108h为最适发酵时间。参考文献1李俊峰，李红芳，姚淑敏，池振明.J61321(Alteromonas aurantia)菌株产铁载体培养条件的研究.青岛科技大学学报（自然科学版），2007，28（1）：20-23.2池振明.现代微生物生态学M.北京:科学出版社,20103王伟琳.海洋酵母普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）铁载体的研究:硕士学位论文. 山东青岛:中国海洋大学海洋生命学院,2009.4马再超. 产铁载体海洋普鲁兰类酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2菌株遗传改良的研究, :硕士学位论文. 山东青岛:中国海洋大学海洋生命学院,20125 Linda JOHNSON，AgResearch Limited, Grasslands Research Centre, Tennent Drive, Private Bag 11008, Palmerston North, New Zealand，mycological research 112 (2008) 1701836 H. Haas，Molecular genetics of fungal siderophore biosynthesis and uptake:the role of siderophores in iron uptake and storage,Appl Microbiol Biotechnol (2003) 62:3163307 Adams, A., Gottschling, D. E., Kaiser, C. A., Stearms. T., Yeast Immunofluorescence. In: Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998, p. 100 (Chinese translated ed.)8 Adjimani, J. P. & Emery, T. Stereochemical aspects of iron transport in Mycelia sterilia EP-76. Journal of Bacteriology, 1988, 170:1377-1379.9 Adjimani, J. P. & Emery, T.Iron uptake in Mycelia sterilia EP-76. Journal of Bacteriology, 1987, 169: 3664-3668.10 An, Z. Q., Zhao, Q., McEvoy, J., Yuan, W. M., Markley, J. L. & Leong, S. A. The second finger of Urbs1 is required for iron-mediated repression of sid1 in Ustilago maydis. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1997, 94: 5882-5887.11 An, Z., Mei, B., Yuan, W. M. & Leong, S. A. The distal GATA sequences of the sid1 promoter of Ustilago maydis mediate iron repression of siderophore production. EMBO Journal, 1997, 16:1742-1750.12 Andrews S.C.,Robinson A.K.Bacterial iron homestasis.FEMS Microbio.Rev.,2003,27:215-237.13 Anguianobehran R,Searcybernal M L,Lizarragapartida,et a1Pathogenic efects of Vibrio alginolyticus on Larvae and postlarvae of the red abaloneJ.Diseases of Aquatic Organisms.1998,33(2):119-12214 Anke, H. & Diekmann, H. Stoffwechselprodukte von mikroorganismen.125. Mitteilung. Biosynthese von sideraminen in pilzen. cis-2-Anhydromevalonsure-hydratase and cis-2-anhydromevalons ure: CoA-ligase. Archives of Microbiology, 1974, 95: 213-225.15 Anke, H., Kinn, J., Bergquist,K. E.& Sterner, O. Production of siderophores by strains of the genus Trichoderma-isolation and characterization of the new lipophilic coprogen derivative, palmitoylcoprogen.Biology of Metals,1991, 4: 176-180.致谢时光飞逝，短短的一学期很快就过去了。在此，我要首先感谢我的导师池振明教授。毕业论文的顺利完成，与池老师的悉心教导和严格要求是分不开的。在此向池教授表示衷心的感谢和诚挚的敬意，并祝愿老师身体健康、工作顺利！论文的顺利完成还要感谢本实验室池哲师兄、马再超师兄、王光远师兄等实验室诸位老师和师兄师姐的的无私帮助。他们对我在实验过程中的热心帮助，使得不成熟的我能够克服实验中出现的各种问题。在此真心祝愿他们学业有成，工作顺利！论文的顺利完成同样要感谢我的父母和亲友，是他们一直在背后默默地支持我、关心我、鼓励我，他们的支持和无私的奉献是我学业顺利完成的巨大动力，衷心祝愿我的家人永远健康、幸福！最后还要衷心感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆