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猪繁殖与呼吸综合征病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒毕业论文1 PRRSV病原学1.1 基因组结构PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，为一种有囊膜的单股正链RNA病毒，长度大概为15.0 kb，其中包括9个开放读码框(open reading frames, ORFs)。PRRSV的结构蛋白由ORF 27 编码，这些序列编码6 个具有帽子结构和poly尾的亚基因 mRNA，并且这些mRNA有共同的 3端的亚基因组，形成嵌套式结构，同时它们均获得来自PRRSV基因组 5端非编码区的引导序列8（图1-1）。根据基因的差异，PRRSV大致分为北美型和欧洲型。这两种基因型在全世界广泛传播，它们的基因组序列同源性约为40 %，两者的血清型明显不同9，并且每个基因型的不同分离株同时存在约20 %的异源性10、11。PRRSV能通过随机突变和基因重组不断演化12，其中由ORF5编码的GP5 蛋白是变异性最强的结构蛋白，美洲型和欧洲型之间的氨基酸同源性只有 50 %55 %13 。1.2 PRRSV蛋白ORF1a 和 ORF1b 编码病毒的复制酶蛋白，而结构蛋白由GP2a，GP2b，GP3，GP4，GP5，M 和 N 蛋白组成。其中GP2a，GP3，和 GP4 是通过二硫键连接形成异源三聚体并且糖基化的小囊膜蛋白14。GP5，M 和 N 蛋白为主要结构蛋白，GP5 为糖基化蛋白，它在病毒感染上起到了重要的作用；M 和 N 蛋白为非糖基化蛋白，其中M 蛋白在病毒的装配和增殖方面起着重要的作用15。1.3 PRRSV的理化特性图 1-1 PRRSV 的基因组结构及亚基因组表达模式示意图Fig.1-1 Schematic diagram of the genome organization and expression of PRRSV注：图中标明了复制酶基因（ORFs 1a 和 1b），结构蛋白基因（ORFs 2a，2b，3，4，5，6 和 7）和前导序列(L)。Note: The replicase gene (ORFs 1a and 1b), the structural protein genes (2a, 2b, 3, 4, 5, 6, and 7), and the leader (L) are indicated.PRRSV对氯仿、乙醚等有机溶剂较敏感。pH高于7或低于5时感染力迅速降低，在pH 6.57.5之间相对稳定16。PRRSV对温度同样表现敏感，经20 6 d, 37 1024 h或者56 1520 min处理后病毒滴度下降10倍；在37 48 h或56 45 min均能将病毒灭活，因此PRRSV在室温环境中存活时间较短，所以用于分离病毒的血清和组织样品应保存在-20 或者4 条件下，以保护病毒的感染性（在4 存放时间不能超过7 d）。2 PRRSV致病机制2.1 PRRSV的感染巨噬细胞和内皮细胞是PRRSV感染的主要靶细胞。Halbur等17认为只要存在巨噬细胞的器官和组织，都有可能导致PRRSV感染的发生。Li等18报道高致病性的PRRSV 分离株JXwn06有可能向上皮细胞扩散的趋势。已有资料表明，PRRSV首先和猪肺泡巨噬细胞上的受体结合，通过硫酸乙酰肝素(Heparin sulphate, HS)吸附PRRSV到PAMs,通过唾液酸粘附素( Sialoadhesin, Sn)介导PRRSV的内吞, CD163可能协助Sn内吞、病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中19-22。PRRSV感染后巨噬细胞的大量破坏，以致大为降低其对异物的非特异性吞噬清除功能，同时PAMs依赖于超氧负离子杀菌的功能也随之下降，进而易继发其它细菌和病毒感染机体而加重疾病的症状。研究发病机理的另一个领域是PRRSV和胎儿的相互作用，大约在经过90 d妊娠期后病毒可以穿过胎盘感染胎儿。到目前为止,只有有限的细胞类型能够在体外使PRRSV生长，包括猪原代肺泡巨噬细胞( PAM) 、PIMs、MA - 104 (非洲绿猴肾细胞) 和其衍生物(Marc - 145 和CL - 2621 细胞系) 、CRL - 1171细胞系、公猪的睾丸细胞、猪脾巨噬细胞、血液源单核细胞和脑小胶质细胞23。PRRSV的分离株不同，使其适合生长的细胞也不同。有些毒株仅生长在一种细胞上,有些则可以生长在多种细胞上。病毒经过57代的传代培养后，感染滴度一般为105107 TCID50/mL。PRRSV在细胞中呈杀细胞性复制，引起典型的细胞病理变化( CPE) , 但也有极个别毒株在细胞上不出现CPE。2.2 PRRSV的持续性感染PRRSV的持续性感染是造成严重危害的一个重要特征。有研究结果证明，PRRSV引起的病毒血症在猪群中可持续67周，甚至长达16个月。另有研究表明，PRRSV在感染后63132 d 都能在扁桃体、淋巴结（肺和非淋巴器官除外）检测到病毒，并且病毒在易感猪群中容易传播，直到260 d血清才成为阴性24。形成持续性感染的原因可能有两种：首先，对于宿主而言，PRRSV嗜好在肺泡巨噬细胞、单核细胞等免疫相关细胞中增殖，导致宿主大量免疫细胞损伤和死亡，造成宿主的免疫抑制；其次，此病毒具有广泛的抗原变异性，使之得以容易逃脱免疫系统的识别和清除，造成长期的病毒血症和持续性感染，并导致继发感染25。2.3 抗体依赖性增强作用 ( antibody dependent enhancement, ADE)ADE是病毒在相应抗体处理后，复制或感染能力显著增强的现象。在研究中发现26，在PAMs培养物中，加入一定效价的PRRSV抗体，可使PRRSV产量明显增加10100倍；在PRRSV病毒中加入抗体可使病毒在胎儿体内的复制能力比单独注入病毒显著增强，说明免疫抗体的存在有利于病毒的复制。在体内同样存在ADE效应，妊娠中期母猪在接种加有抗体的PRRSV后，可使病毒在胎儿中的复制明显增强，并且显著高于单独接种病毒；在生产中经常遇见感染PRRSV的刚断奶仔猪比肥育猪的临床症状表现严重的现象。接种PRRSV疫苗后能够迅速产生体液免疫反应，但这些高水平的抗体能够介导ADE，反而增强病毒感染。有研究表明27，ADE的产生和细胞表面的Fc受体有关，特异性抗体与病毒抗原形成免疫复合物后，借助细胞表面的Fc受体与靶细胞结合，从而促进病毒更容易侵入细胞。通过母源抗体获得对PRRSV被动免疫的仔猪，如果抗体水平下降至保护性水平以下(亚中和水平)，PRRSV就会表现出ADE活性，这样反而增加了仔猪感染和发病的危险性。由于ADE效应的存在，给PRRS疫苗的研发和应用带来了困难，因为疫苗毒诱导的抗体可能会增强野毒株在猪体内的复制，而野毒株产生的抗体同样有可能增强疫苗毒的复制，导致疫苗毒返强，进而造成新一轮的感染。3 PRRSV免疫学研究3.1 细胞免疫 研究表明，细胞介导的免疫反应在抗PRRSV感染中起到很重要的作用23。单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞是主要的免疫细胞，其中T淋巴细胞是细胞免疫的主要承载者。研究表明，在PRRSV的感染阶段中，T淋巴细胞亚群会发生显著变化28：CD2+、CD4+和CD8+细胞都会在感染的初期显著下降，其中CD4+细胞会持续下降；CD2+细胞则迅速恢复到正常水平；CD8+细胞缓慢上升，甚至在感染后10 d才能增至感染前水平。白细胞总数和淋巴细胞总数同样会出现这种感染后先急剧下降后缓慢回升的现象。PRRSV感染后还可诱导PBMCs和PAMs等细胞的凋亡29，并刺激产生辅助性T细胞(TH)和杀伤性T细胞(TC)。另外，PRRSV感染还能诱使猪体产生迟发性变态反应。Bautista 报道30，淋巴细胞产生的IFN-可抑制PRRSV在巨噬细胞中的复制，阻断病毒的正常合成。3.2 体液免疫 PRRSV感染后可引发机体产生全身性的体液免疫应答。尽管体液免疫在PRRSV免疫保护中的作用机制还不十分清楚，但猪体在感染PRRSV后会产生多种特异性抗体，有助于避免再次感染。猪接触PRRSV后，一般情况下第7天开始出现抗体，2周后即可检出抗基质蛋白M的抗体和衣壳蛋白N的抗体，4 5周后才出现主要识别囊膜蛋白E特异性的中和抗体，但它们滴度较低。由于中和抗体出现较慢，在临床上，PRRSV总是表现为长期的持续性感染，这些说明体液免疫的保护作用非常有限。Molitor报道23非免疫母猪所产仔猪被动获得PRRSV抗体不能产生保护作用，而免疫母猪所产仔猪则可获得保护；Yoon等26证明在被动获得抗体的猪体内, PRRSV感染和复制反而得到增强，即抗体依赖增强作用(ADE)。以上说明单独使用抗体也许并不能保证猪不发病, 细胞免疫的作用可能更加明显。但研究证明31-33，中和抗体在抗PRRSV感染中起重要作用，血清中的中和抗体可以保护怀孕母猪免受PRRSV感染，对仔猪同样起作用。通过被动免疫中和免疫球蛋白，能够为高危易感动物提供暂时的保护作用。3.3 细胞因子细胞因子是具有免疫调节功能的蛋白物质，由细胞分泌后可作用于靶细胞受体，维持靶细胞的成活、生长或促进其增殖和分化。PRRSV可以下调细胞因子诸如型干扰素(IFN-、IFN-)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)的产生。树突状细胞(dendritic cells, DCs)和巨噬细胞产生的早期细胞因子的抑制作用可弱化先天的免疫反应，延缓中和抗体的产生，减缓IFN-和细胞毒性T细胞的反应18。PRRSV感染PAM和单核细胞后造成的细胞死亡可引起多种细胞因子的释放，主要有IL-1、IL-6、IL-8、IFN-、IFN-和IFN-等，其中IL-1可直接作用于体温调节中枢引起猪发热；IL-6和IL-8参与T细胞和B细胞的分化与成熟；IFN-和IFN-则通过活化PAM和阻断病毒蛋白在PAM内的正常合成。冯丽丽34将PRRSV分离株经ADE途径感染PAM，结果表明ADE途径感染的PAM中病毒表达量明显增大，与此同时TNF-表达下调，NF-B 和IK-B 也同时表达下调，说明这些细胞因子在一定程度上与病毒的复制成反比关系。J.Gomez35等认为IL-1、IL-6和TNF-的表达与肺部病变程度相关；IL-12p40与IFN-的表达，IFN-与TNF-的表达，以及PRRSV的感染与IL-10的表达都存在显著相关性。IL-10可能在PRRSV免疫应答调节机制中起重要作用。已经证实IL-10具有广谱的抑制能力，例如抑制单核细胞分泌多种细胞因子和降低IL-4或IFN-的分泌，导致抗原递呈细胞递呈MHC 类抗原的能力下降，以及抑制核细胞的黏附等。无论是在感染北美型或者欧洲型PRRSV后，外周血细胞中IL-10的mRNA水平均有所上升，并且支气管肺泡灌洗液中IL-10浓度也会升高36。接种IL-10诱导性疫苗和接种非IL-10诱导性疫苗相比，PRRSV特异的IFN-分泌细胞分泌频率较低37。IL-10的产生可能是PRRSV感染后体液免疫受到一定抑制的原因之一38。之前被称之为INF-诱导因子的IL-18是最近几年才引起重视，它是一种具有许多功能的细胞因子。IL-18不仅能诱导INF-的产生，促进T细胞和NK细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤力，并且具有抗肿瘤和抗微生物感染的作用39。以上结果可见，细胞因子在机体的免疫应答中的作用非常重要。4 PRRSV疫苗目前尚无有效治疗PRRS的措施，因此主要靠综合防制措施来控制该病的发生和传播。预防本病的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，但它们在免疫力和安全性方面均存在着一定的缺陷。由于在灭活过程中造成抗原表位的缺失或抗原性减弱, 灭活疫