甘薯皮中黄酮的提取及抑菌作用分析研究毕业论文.doc

甘薯皮中黄酮的提取及抑菌作用研究摘 要：采用乙醇浸提法对甘薯皮中黄酮的提取，由单因素实验表明在提取温度80，乙醇浓度70%,料液比1：25，提取时间60min时提取，提取率高。本实验还对其抑菌活性进行了研究。通过滤纸片法对3种浓度(0.6、1.2、2.4mg/mL)的甘薯皮黄酮溶液进行了抑菌试验。结果表明，甘薯皮黄酮溶液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母都有一定的抑菌效果，随着甘薯皮黄酮溶液浓度的增加，其抑菌作用也增强。3种浓度的甘薯皮黄酮溶液溶液对黑曲霉都没有抑菌效果。同时本实验还测出了甘薯皮黄酮溶液对实验中几种菌种的最低抑菌浓度MIC值，它们的MIC值为大肠杆菌0.3mg/ml, 枯草芽孢杆菌和啤酒酵母0.6mg/ml。关键词：黄酮；乙醇浸提；滤纸片法；抑菌性；最低抑菌浓度sweet potato skin flavanone extraction and bacteriostasis function researchAbstract: The use of ethanol extraction of flavonoids in sweet potato peel extract, from single factor experiments show that the extraction temperature 80, the concentration of 70% ethanol, liquid ratio 1:25, when the extraction of 60min extraction time, extraction rate. This experiment also for its antibacterial activity were studied. Through filter paper on three kinds of concentrations (0.6,1.2,2.4 mg / mL) of sweet potato skin flavonoids for the inhibition test solution. The results show that the sweet potato skin flavonoids solution on E. coli, Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae have some antibacterial effect, with the sweet potato skin flavonoids increase in solution concentration, also enhanced its inhibitory effect. Concentration of three kinds of sweet potato skin flavonoids on Aspergillus niger solution solution inhibitory effects are not. At the same time, this experiment also detected the sweet potato skin flavonoids solution of several strains of the experiment the minimum inhibitory concentration MIC values, and their MIC value of E. coli 0.3mg/ml, Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae 0.6mg/ml.Key words: Flavonoids; ethanol extraction; filter paper method; Bacteriostasis sexual; the minimum inhibitory concentration甘薯皮中黄酮的提取及抑菌作用研究1 引 言甘薯又名红薯、番薯、地瓜、红苕、山芋等，属旋花科一年生植物，原产于南美洲。我国古代已大量种植。近年来，国际市场掀起了“红薯热”，美国、日本、韩国及我国，尤其是港澳地区人民对红薯特别钟爱，红薯被称之为“长寿食品”和“太空食品” 。古代就有部分地区生产甘薯，然而在南北方广泛种植是从明代开始的。明代时红薯由福建商人从吕宋(菲律宾)引入中国。甘薯具有很高的营养价值和药用价值，而且由于其产量高，很快在全国范围内推广，成为我国的主要粮食作物之一，最初红薯种植的主要目的就是作为粮食用，尤其是二战后，世界粮食严重短缺，饥荒严重，红薯的种植面积发展很快，我国在1960年前后红薯种植面积达到了最高峰。如今甘薯不仅可以成为轻工业的重要原料，而且可加工转化为多种类型的食品，具有极大的开发前景。经过农业科研部门多年的科研攻关，不断创新，培育出了一批优质、高产、用途多样的甘薯新品种，如水果薯、饮料薯、紫色薯、果脯薯、药用薯、蔬菜薯、高淀粉薯等等。在轻工上可以制食用酒、酒精、淀粉果糖、味精、粉条等；在化工上可制柠檬酸、乳酸、溶剂、塑料稳定剂、聚乙烯、冰醋酸、醋酸纤维、涤纶树脂、农药及染料等；在医药上可制葡萄糖、赖氨酸、脯氨酸、复方氨基酸、链霉素、庆大霉素及维生素C等。目前很多学者对甘薯活性成分进行了深入的研究。例如对甘薯抗氧化物质、甘薯糖蛋白、甘薯凝集素等物质分离提取工艺及其生物活性的研究，研究工作取得了不少进展。但甘薯中黄酮类化合物鲜有人研究。随着科学的发展和研究的深入，甘薯的功能会得到更多的开发。其中甘薯皮也具有很高的营养价值和作用，而甘薯皮中主要成分就是黄酮类化合物。黄酮类化合物是植物光合作用产生的一种天然有机物，广泛存在于植物的各个部位，包括根、茎、叶、花、果实中1。现代医学研究表明，黄酮类化合物具有多种生物活性和药理作用，它可以降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管流量增加，抗心率失常，软化血管，降血糖、血脂，具有抗氧化、消除体内自由基、抗衰老和提高机体免疫力的作用2。2 绪 论 甘薯(Ipomoea potatoes(L) Lam)是一种既可作粮食生产种植，也可作经济作物发展的农作物。它具有高产、稳产、适应性广、生产成本低、经济效益高、营养丰富、保健作用好和加工用途广泛的特点3。在加入WTO后，国内、国际农产品市场竞争更加激烈的情况下，随着我国工农牧业生产的发展和人民生活水平的提高，甘薯已从粮食作物转为经济作物、饲料作物和营养保健食品，作为工业原料、饲料和副食用比重日益增大。各地推广种植的品种绝大多数属于粮、饲兼用型，但高淀粉工业原料型和食用型的甘薯品种前景看好。目前我国对甘薯生产更加重视，进一步加强了甘薯种质资源搜集、保存和甘薯品种改良以及甘薯栽培、加工利用等方面的研究。2.1 甘薯的营养功能和保健作用营养丰富、保健价值较高。近代科学证明：每公斤甘薯含糖290克、蛋白质20克、脂肪2克，可产生热量；钙、磷、铁含量分别为180、200和4毫克；尼克酸、维生素A、B1、B2分别为5、13、1.2和0.4毫克，是防病及延缓衰老的重要物质；还含有较多的鸡、鸭、鱼、肉等食品内缺少的黏液蛋白，能抑制人体内胆固醇沉淀，阻止动脉硬化，减少高血压发生；甘薯纤维进入人体内可刺激肠蠕动，减少便秘、防治痔疮、阑尾炎、糖尿病和肠癌发生1。甘薯具有营养丰富、口感好、产量高、食味佳、含糖量高、加工食品味美等多种优点，有延缓衰老的作用，对消化道、心脑血管疾病有较高的功效，并具有良好的防癌、抗癌之功效。1995年美国生物学家发现，甘薯中含有一种化学物质叫氢表雄酮，不仅可以用于预防肠癌，还可以用于预防乳腺癌；1996年日本国立癌症预防研究所证明了，在蔬菜王国里，熟、生甘薯的抗癌性，高居于蔬菜抗癌之首，超过了人参的抗癌功效。又因甘薯生长于地下，在生长过程中几乎不受病虫害的危害，因此不需施用任何化肥、农药，可谓是“纯天然无公害绿色食品”，甘薯自身的这些优点和特点大大附和了人们的消费新趋势。因此，近几年来，甘薯在国际、国内市场发展十分迅速，且发展势头旺盛4。甘薯在我国种植已有400多年的历史。古人很早认识到甘薯的保健功能，据本草纲目记载，甘薯有“补虚乏、益气力、健脾胃、强肾阴”的功效；“红薯蒸、切、晒、收，充作粮食，使人长寿；”陆川本草说，甘薯能生津止渴，治热病口渴；本草纲目拾遗说，甘薯能补中、和血、暖胃、肥五脏。据福建珍藏的古籍金薯传习录记载，甘薯有6种药用价值：治痢疾和泻泄；治酒积和热泻；治湿热和黄疸；治遗精和白浊；治血虚和月经失调；治小儿疳积。在实际应用中，民间单验方常用于治疗湿疹、夜盲症、便秘、浮肿、外伤等症5。2.1.1 预防肿瘤和抗癌作用甘薯可以预防肺、前列腺、胃、胰、结直肠、食道、口腔、乳腺、肝、膀胱、宫颈等部位肿瘤。Franceschi等报道，摄食甘薯可降低消化道癌变的危险性，认为主要是甘薯黄酮抗氧化作用的结果。1995年，Levy在肿瘤培养细胞中发现，甘薯黄酮对子宫、乳腺、肺癌细胞的增殖抑制作用远大于-胡萝卜素、-胡萝卜素。同年Giovannucci研究了类胡萝卜素如：番茄红素、-胡萝卜素、-胡萝卜素、叶黄素和-玉米黄质等与前列腺癌的关系发现，只有甘薯黄酮可明显降低前列腺癌的发病率。在Norris等进行的群体调查病例对照研究中，也发现摄食含胡萝卜素的食物对前列腺癌的发生无保护作用，但是摄食甘薯黄酮和甘薯制品却都与降低前列腺癌的发生呈弱相关。Nagasawa对40d龄未交配的、乳腺癌高发的SHN小鼠的研究中发现，摄食一定量的甘薯黄酮可显著抑制乳腺癌，并伴有乳腺中胸苷酸合成酶活性、血清中游离脂肪酸和催乳素浓度的降低。美国费城大学生物学家于1995年发现甘薯含有脱氢表雄酮，将其注入用于培养癌细胞而饲养的白鼠体内，发现可防止乳腺癌和结肠癌，并使白鼠寿命延长了13。研究发现，它在人的血液中增加100 gkg，死亡率下降36，随着人的年龄增加而减少，凡含量高的人，寿命就长，证明了它具有防癌和延长寿命的作用6。日本国立癌症预防研究所对26万人饮食生活与癌症关系的统计调查，证明了甘薯的防癌作用。他们通过对40多种蔬菜抗癌成分的分析及抑癌实验结果，从高到低排出20种对癌症有显著抑制效应蔬菜的次序：熟甘薯名列防癌抗癌蔬菜的首位，生甘薯居第二7。另外，甘薯含有特殊的激素类物质-类固醇，有防止和缓解血癌、乳腺癌的作用。鹿儿岛大学的藤井信教授发现甘薯里的花色苷成分能抑制癌症。花色苷存在于甘薯的红皮里，以老鼠为对象进行的动物实验表明，这种物质有抑制皮肤癌细胞增殖的作用。另外，据日本农业新闻报道，日本两名科学家分别发现甘薯对癌症有抑制作用，这将为甘薯开辟新的用途。食物营养学专家道冈攻在对甘薯残渣进行废物利用的研究过程中发现，把从甘薯汁里提取的神经节苷脂添加到子宫颈的癌化细胞里进行培养，1周后发现癌化细胞的数量几乎没有任何增加，不仅如此，这种物质还能把细胞分裂的时间延长10多倍，并在这个过程中作用于基因，把癌化的细胞转化为正常细胞。2.1.2 增强免疫功能钱康年证明了西蒙1号甘薯叶片药物对轻度损伤的肝功能有恢复作用，经毒理研究及临床观察均无明显毒副作用、无禁忌症，说明其有一定免疫增强作用。台建祥等以特白一号甘薯叶为主要原料制成“维康”，饲喂用环磷酰胺抑制免疫机能的动物及高脂模型动物，临床结果表明，“维康”具有提高免疫功能和防治高脂血症作用，对脾气虚和脾不统血症有良好、可靠的保健治疗作用8。阚建全等的研究结论：经DEAE52和Sephadex住层析纯化的北京2号甘薯糖蛋白，当浓度达50g/mL时可促进PHA对人外周血淋巴细胞转化，100g/mL或者150g/mL时可显著提高PHA刺激的人外周血淋巴细胞转化，刺激指数分别达到6.5和4.5(P0.05)。在小白鼠实验中，随着甘薯糖蛋白剂量增加，脾淋巴小结增多扩大，胸腺T细胞线粒体增多，这些结果都表明甘薯糖蛋白有明显的增强免疫调节的作用9。2.1.3 降血脂、降胆固醇功能李亚娜等的研究发现，甘薯糖蛋白显著降低血清胆固醇的效应，主要表现在升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，而对低密度脂蛋白胆固醇(LD-C)有降低作用。同时，与高脂组比较，甘薯糖蛋白对肝脏胆固醇含量的升高也具有明显的抑制作用(P0.05)说明甘薯糖蛋白有明显的降血脂功能10。日本科学家对130种植物研究得出甘薯抑制胆固醇功效最大，也是甘薯中一种脂质和糖类物质相结合的作用。也有日本学者发现甘薯含有粘液蛋白，它是一种多糖蛋白的混合物，属于胶原和粘多糖类物质，在机体内显示出神奇的生理机能，能增进机体健康，防止疲劳，使人精神充沛；可以防治心血管脂肪沉积，维护动脉血管壁的弹性，减少皮下脂肪的堆积，预防肥胖病；可以防止肝、肾和结缔组织萎缩；可以和无机盐类结合形成骨质，使软骨保持一定的弹性，对预防胶原病颇具功效。2.1.4 增强血小板功能黎盛蓉等研究发现，西蒙1号甘薯叶粗制剂对治疗原发性及继发性血小板减少性紫癜有效率达70%，经毒理研究及临床观察均无明显毒副作用，电镜观察，提示西檬1号有促进巨核细胞恢复及促进血小板形成的作用，据实验室检查，提示有促进血小板功能恢复的可能11。李明文等也证明了甘薯叶多糖制剂能够刺激低血小板动物血小板生成素的产生，具有明显的止血和增强血小板作用，而对正常动物没有任何影响12。 我国科学家利用西蒙1号提取物，通过5年300例临床实验证明了甘薯具有保健和医疗作用，其中110个糖尿病例中，血糖下降的达97.3%，190个血液病例中，过敏性紫癜和出血症状消失的人数占96.9%13。其医疗的机理就是甘薯含有丰富的物质，有效地提高了免疫功能。2.1.5 抗衰老,延长寿命人类多食甘薯，能够保持人体心血管壁的弹性，防止动脉粥样硬化及肝脏、肾脏器官结缔组织的萎缩，同时还能保持消化道、呼吸道以及关节囊、血管腔的润滑作用。我国台湾省台南县的亚洲蔬菜研究发展中心副主任陆之琳教授指出：甘薯是一种“生理碱性”食品，它能中和米、面、肉、蛋等所产生的酸性物质，起着维持健康人体血液的弱碱性作用。日本科学家认为长期食用甘薯，可使脸色红润、容光焕发、精力充沛、延年益寿。近年来，美国墨西哥大学发现甘薯中含有类似雄性激素的物质，其对人体特别对皮肤有益。刘连瑞等报道，甘薯叶提取物具有抑制肿瘤生长作用，进而引起肿瘤组织出血性坏死，对白血病有一定疗效14。根据国外资料和北京农学院的试验结果，甘薯叶有抑制病菌增殖，调节免疫功能，提高机体抗病力，延缓衰老，提升血小板，止血，抗癌，降血糖，通便，利尿，催乳，解毒，防治夜盲症等康复功能，它不仅是正常人的营养食品，而且是上述病人的功能食品15。综合甘薯保健功能各方面的研究，虽然不能否定甘薯所含各种化学成分之协调与综合影响，但其主体成分是以苯并毗喃骨架为基础的带有多个酚性羟基的化合物。该类物质在甘薯中的含量，因品种及物候条件之不同而有差异。2.1.6 其他作用在食品行业中，诱人的色泽是食品的重要感官指标。它通过刺激消化液的分泌、增加食欲来吸引消费者。但是天然食品在加工保存的过程中极易褪色或变色，因此为了改善食品的色泽，常常在加工的过程中添加食用色素，以改善其感官性质。由于化学合成色素的毒副作用越来越受到重视，使得天然色素的应用成为必然的发展趋势。从甘薯直接浸提出来的甘薯色素和胡萝卜素，可用于水果类的食品如冰淇淋、奶制品饮料、果汁饮料、奶酪、水产品、果冻、谷物食品以及色拉装饰等。人体减肥保健食品。甘薯中几乎不含有脂肪，因此可直接食用甘薯作为减肥食品。同时可将甘薯叶片开发成茶叶也具备一定的减肥作用，但为了强化减肥效果，可采用复合茶的配方，以达到更佳的减肥目的。美容健肤卫生方面。当前商品种类很多，膺品也不少，其实美容健肤的基本要求，就是创造各种条件，清除皮肤代谢过程中存在的不利因素，不论是霜、膏、露、乳，其配料目的都不能脱离这一基本点。甘薯成分中的绿原酸、花青素、维生素C及维生素E等，都有保护皮肤的功能，可以利用皮肤吸收功能，促使某些物质透入皮肤，使皮肤延迟老化，保持青春。在保健饮料方面，可以开发浓缩甘薯汁、鲜果汁配合饮料及其他牛奶等饮料的调味营养饮料，从国外消费情况衡量，方便、营养的调味混合饮料原液也是很有发展前途的。日本一家食品加工企业已经制造出含有浓缩神经节苷脂的甘薯清凉饮料，产品上市后颇受消费者好评。2.2 黄酮类化合物研究概况黄酮类(flavowids)的名称来源是由于该类化合物大都显黄色，并且其4-位都有羰基之故。在黄酮类化合物分子结构内具有碱性阳原子能与碱性氧原子，能与矿酸成盐，所以过去也曾把黄酮类化合物称为黄碱素类化合物。黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物，30年来一直是国内外研究开发的热点。这类化合物多存在于双子叶植物及裸子植物中。苔类中很少含有黄酮，而藻类、微生物、细菌中没有发现黄酮类化合物存在。黄酮类化合物在自然界大部分以甙的形式存在，另一部分以游离态存在。由于黄酮类化合物广泛分布于植物界，其生理活性多种多样，引起了广泛注意，研究进展很快，目前己分离出的黄酮类化合物总数超过4000个，广泛应用于医药领域。2.2.1 黄酮类化合物结构与分类黄酮类化合物一般是具有二个苯环(A-环与B-环)通过中央三碳链(C-链)相互连接而成的C6-C3-C6基本碳骨架的一系列化合物依据三碳链的氧化程度和是否成环，以及B-环的连接位置(2-或3-位)可将该类化合物分为7种基本的碳骨架类型。见图2-1，2-2。图2-1 大豆异黄酮甙元结构式 图2-2 5,7-二羟基黄酮黄酮化合物种类繁多，其共同性在于其分子结构中都包含以黄酮为母体的基本结构。依据分子结构中C环2,3位双键,3位经基、4位酮基及B环在2或3位的定位情况，黄酮可分为6大类:黄酮(flavone)、二氢黄酮(flavanone)、黄酮醇(flavonol)、黄烷醇(flavanol)、花青素(anthocyanin)和异黄酮(isoflavone)。黄酮类如黄酮(flavone)、三经黄酮(apigenin)普遍存在于各种植物中如芹菜、苹果等；黄酮醇类如懈皮素(quemetin)为中药材懈皮的功效成分；黄烷醇类如儿茶素(catechin)为茶多酚的主要成分；二氢黄酮如抽皮素(naringenin)多存在于橘类水果中；花青素类如花青素(cyanidin)主要存在于各种浆果中；异黄酮类如三经异黄酮(genistein)存在于豆类植物中16。2.2.2 抗氧化与促氧化作用植物黄酮被普遍认为是高效的天然抗氧化剂，但事实上植物黄酮同时具有抗氧化和促氧化两种相反特性。植物黄酮对疾病的预防作用一般认为在于其优良的抗氧化及清除自由基特性，然而这些植物多酚物质在抗肿瘤及诱导肿瘤细胞凋亡方面，其促氧化活性可能比其抗氧化活性更加重要16。2.2.3 抗菌作用黄酮类药物还具有抗菌作用。黄酮化合物licochalconeA、licochalconeB、glabridin、glabrene等对格兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的抑制作用相当于链霉素，对酵母菌和真菌抑制作用高于链霉素，但对大肠杆菌和绿脓杆菌抑制作用远低于链霉素17。LicochalconeA体外对革兰阳性球菌、杆菌和棒型菌有明显的抑制作用，其最低浓度为0.3u/ml8u/mI。2.2.4 抗心率失常作用胡小鹰等研究的抗心律失常作用18。结果表明，50mg/kg100mg/kg甘薯总黄酮可延长乌头碱诱发的小鼠心律失常潜伏期，减少氯仿诱发的小鼠心室纤颤阳性率;25mg/kg50mg/kg甘薯总黄酮可增加哇巴因诱发豚鼠出现室性早搏、室速、室颤和心搏停止所用剂量。由于甘薯类黄酮与异黄酮素对乌头碱诱发的心律失常有明显拮抗作用，提示有效成分可能为异黄酮素19。3 甘薯皮中黄酮的提取3.1 材料与方法3.1.1材料与仪器供试材料：甘薯皮，乙醇，亚硝酸钠，氢氧化钠，硝酸铝。供试仪器：722型可见分光光度计、电子天平、干燥箱， 恒温水浴锅。3.1.2试验方法(1) 原料预处理 紫色甘薯皮经干燥、粉碎、过60目筛后备用。(2) 芦丁标准曲线的绘制18,19采用NaNO3-Al（NO3）3-NaOH显色法。即准确称取20mg芦丁标准试剂，用50%乙醇溶液，定溶至100ml，摇匀，得浓度为0.2mg/ml标准溶液；准确吸取芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0ml于8只25ml容量瓶中，然后分别加入1ml5%亚硝酸钠，摇匀，放置6min，加入1ml10%硝酸铝，摇匀，放置6min，加入10ml4%氢氧化钠溶液，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，放置10min后，在510nm处测定其吸光度。以吸光度A对芦丁浓度C作图，得标准曲线（图3-1）。 回归方程为：A=0.0114C+0.0133，R2=0.998.图3-1 芦丁标准曲线(3) 样品含量的测定 精确称取样品2g于250ml三角瓶中，加入一定体积分数的乙醇溶液浸提，浸提后浓缩，定容至25ml。然后吸取提取液1.0ml，置于25ml容量瓶中，按3.1.2（2）的方法测定吸光度。根据上述回归方程求得黄酮含量。计算样品中黄酮总含量如下.C=CXV1V3/V2m其中，C为样品中黄酮总含量（mg/g）；Cx为由标准曲线求得黄酮含量（mg/ml）；V1为定容体积（ml）；V2为吸取试液体积（ml）；V3为提取液体积（ml）；m为样品质量（g）。(4) 单因素试验 称取适量样品，在不同条件下分别观察料液比、乙醇浓度、提取时间及提取温度对提取率的影响，按照3.1.2(2)中方法测定吸光值并依据回归方程计算含量，以芦丁含量表示甘薯皮中黄酮类物质的含量。3.2 结果与分析3.2.1 单因素试验(1) 料液比对提取效果的影响 在乙醇浓度为60%、提取温度为80、提取时间为1h的条件下，考虑料液比对提取效果的影响。（见图3-2）图3-2 料液比对提取效果的影响从图3-2可以看出，随着料液比的增大，提取量逐渐增大，料液比为1：25时，提取量最高。而后，随着料液比继续增加，提取量则有所下降。(2) 乙醇浓度对提取效果的影响 在料液比为1：25、提取温度为80、提取时间为1h的条件下，考察乙醇浓度对提取效果的影响。（见图3-3）图3-3 乙醇浓度对提取效果的影响从图3-3可以看出，随着乙醇体积分数的增加，提取量逐渐增大，但乙醇体积分数达到70%时，提取量最高。而后，随着乙醇体积分数继续增加，提取量则有所下降。(3) 浸提时间对提取效果的影响 在乙醇浓度为70%、料液比为1：25，提取温度为80的条件下，考察提取时间对提取效果的影响。（见图3-4）图3-4 提取时间对提取效果的影响从图3-4可以看出，提取时间为60min时效果最好，时间过长，对于提取的意义并不是很大。(4) 浸提温度对提取效果的影响 在乙醇浓度为70%、料液比为1：25.提取时间为50min的条件下，考察提取温度对提取效果的影响。（见图3-5）图2-5 温度对提取效果的影响从图3-5可以看出，温度在80时，提取量最大。温度超过80，随着温度升高，提取量则减少。 4 甘薯皮中黄酮的抑菌4.1 材料与方法4.1.1材料（1）供试菌种 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、黑曲霉。（2）供试黄酮 通过乙醇浸提法在提取温度80，乙醇浓度70%,料液比1：25，提取时间60min条件下大量提取，再经过旋转蒸发器浓缩所得。(3)供试仪器 旋转蒸发器、三角瓶、培养皿、涂布棒、酒精灯、接种环、游标卡尺。4.1.2培养基的制作普通营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。121灭菌15min。葡萄糖土豆汁培养基：土豆汁230ml，蒸馏水770ml，葡萄糖10g，琼脂20g，l10灭菌20min。土豆汁培养基：土豆汁230mL，蒸馏水770mL，琼脂20g，l10灭菌20min。4.1.3菌悬液的制备把大肠杆菌和枯草芽孢杆菌原菌种接种于普通营养琼脂培养基斜面上，37培养2022h，用10mL灭菌生理盐水洗下菌苔备用。把啤酒酵母原菌种接种于葡萄糖土豆汁培养基斜面上，28培养24h，用10mL灭菌生理盐水洗下菌苔备用。把黑曲霉原菌种接种于土豆汁培养基斜面上，28培养24h，用10mL灭菌生理盐水洗下菌苔备用。把上述菌悬液分别用灭菌的生理盐水配制成含菌数106 cfu/mL的菌悬液。4.1.4 含菌平板的制备将上述各培养基灭菌后倒入培养皿内，每个培养皿约20mL。待培养基凝固后，用灭菌吸管吸取上述各种菌悬液0.1mL注入培养皿内，再用灭菌的涂布棒迅速将菌液涂抹均匀，制成含菌平板。以上操作均在无菌室内进行20。4.1.5 抑菌活性的测定用无水乙醇把甘薯皮中提取的黄酮分别配制成0.6、1.2、2.4mg/mL的溶液。在上述3种不同浓度的黄酮溶液中，分别放人直径为10mm的灭菌滤纸片(4片为1组)，浸泡2h。待其自然干燥后，用紫外线照射灭菌1015min。用无菌镊子将浸透3种浓度黄酮溶液的滤纸片放在含菌平板上， 把每个处理过的培养皿放到各供试菌最适温度下培养：细菌37 24h，酵母菌、霉菌28 48h。用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小，并以此判断不同浓度的黄酮溶液对供试菌的抑制效果21。4.1.6 最低抑菌浓度的测定采用液体稀释法测定22 。即以上配置的各种培养基，分别倒入培养皿中，再加入不同浓度的黄酮溶液，配制成黄酮溶液系列浓度的培养基。接相同量的菌液。于37 (细菌)或28 (真菌)下培养24h或48h；另取不接种任何菌种作为空白对照。以培养基中完全没有菌生长时的最低浓度为MIC。根据MIC初步确定抑菌浓度范围。4.2结果与分析4.2.1抑菌效果不同浓度甘薯皮黄酮溶液的抑菌效果见表4-1。表4-1不同浓度甘薯皮黄酮溶液的抑菌效果菌种空白对照抑菌圈直径/mm0.6mg/ml1.2mg/ml2.4mg/ml大肠杆菌无抑菌圈12.1412.3513.25枯草芽孢杆菌无抑菌圈10.5412.4213.36啤酒酵母无抑菌圈10.8311.5211.86黑曲霉无抑菌圈无抑菌圈无抑菌圈无抑菌圈由表3-1可知，3种浓度的甘薯皮黄酮溶液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母都有一定的抑菌效果，但对黑曲霉却没有抑菌效果。随着甘薯皮黄酮浓度的增加，其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母的抑制作用也增强。4.2.2 最低抑菌浓度各种菌种的最低抑菌浓度见表4-2（甘薯皮黄酮原溶液为4.8mg/ml）。表4-2 不同菌种的最低抑菌浓度 供试菌种甘薯皮提取物浓度1：22.4mg/ml1：41.2mg/ml1：80.6mg/ml1：160.3mg/ml1：320.15mg/ml大肠杆菌-+枯草芽孢杆菌-+啤酒酵母-+注:+长菌，-不长菌。由表3-2可知，甘薯皮黄酮溶液对几种测试菌种的MIC值分别为：甘薯皮黄酮溶液对大肠杆菌的抑菌效果最好，其MIC值为0.3mg/ml，其次为枯草芽孢杆菌和啤酒酵母，其MIC值都是0.6mg/ml。5 结论与展望本实验采用乙醇浸提法提取甘薯皮中黄酮，用分光光度法测定黄酮含量，方法简便，提取效率较高。结果表明，最优提取条件为：提取温度80 ，70%乙醇，料液比1：25，提取时间60 min。本实验证实了甘薯皮黄酮溶液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母等一些菌种都有一定的抑菌效果，并且随着甘薯皮黄酮溶液浓度的增加其抑菌作用也增强，同时还测出了甘薯皮黄酮溶液对于以上几种菌种的最低抑菌浓度。这给甘薯皮黄酮溶液在抑菌方面的发展提供了理论依据和工艺参数。鉴于甘薯本身是一种高产稳产、廉价、易种易繁的低投入传统作物，值得大力开发。谢 辞在蚌埠学院的四年生活就要结束了，回首四年岁月，有时光飞逝之感。在此四年，我的学识、修养与理念有了进一步的提升与拓展，在论文即将完成之际，向给予我无私帮助的人们致以深深的敬意。本次论文是在导师王娣老师的悉心指导下完成的。导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本次论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！ 本次论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此感谢王娣，田长城老师的指导和帮助；感谢实验室的赵老师和李老师的指导和帮助！感谢蚌埠学院食品科学与工程系教研室对本课题的指导和帮助。最后衷心的感谢所有对我和我的课题有过帮助和关心的人们。作者：闵小江2009年6月10日参 考 文 献1 赵国华，李志孝，陈宗道甘薯多糖SPPI-FRH组分的结构与抗肿瘤活性J中国粮油学报，2003，18(3)：59-612 李雨露，甘薯营养价值及开发利用J，粮食与油脂，2002，(4)：423 谭西贵我国甘薯生产前景展望J.安徽农业科学，2004，32(1)：1851904 孙建国质量与生活J 中国检验检疫.2006,第4期5 周玲甘薯与保健J中国食物与营养，1996(6)：47-486 梁敏，邹东恢，王殿友甘薯的保健功能与开发利用J山东食品科技，2003(5)：3-47 钱康年药用甘薯叶片药理作用的初步研究J中药与临床，1990，21(1)：2-l18 台建祥，华希新，王家万特白一号薯叶制品功能性实验及临床应用研究J作物学报，1998，24(2)：161-1679 阚建全，阎磊，陈宗道甘薯糖蛋白的免疫调节研究J西南农业大学学报，2000，22(3)：257-26010 李亚娜，赵谋明，彭志英甘薯糖蛋白的分离、纯化及其降血脂功能J食品科学，2003，24(1)：118-12111 林金源甘薯叶水萃取物之抗突变性J食品科学(台湾)，1993(3)：301-31012 黎盛蓉，唐果成，齐振华西蒙1号治疗血小板减少症50例近期疗效观察J临床血液学杂志，1992，5(1)：8-1013 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Isddns，国外医药(植物药分册)，1994,9(4),173。18 李长生，朱笃，邓娟，等鸭儿芹总黄酮提取及含量测定研究J食品科学，2006，27(11)：357-36019 朱靖博，张或，张公亮，等仙人掌中总黄酮提取工艺的研究J食品工业科技，2005，26(2)：11311520 周德庆微生物学实验手册M上海：上海科学技术出版社，198721 刘慧，徐红华，王明丽，等聚赖氨酸抑菌性能的研究J】东北农业大学学报，2000，31(3)：29422周德庆微生物实验手册M上海：上海科学技术出版社，1986袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇