李劲松实验报告realtimePCR.pptx

Real timePCR使用及引物筛选时数据分析 报告人 李劲松 报告内容 1Real timePCR原理2PCR体系配制3Real timePCR软件操作4Real timePCR的两个用途5当前所遇问题及可供参考的解决方向6荧光数据处理及代码自动寻找最佳分离温度尝试 1Real timePCR原理 某些荧光物质与DNA双链结构结合后 其荧光性会剧烈改变 而当DNA双链解开后 其荧光性又会恢复 比如我们使用的EvaGreen核酸染料与DNA双链结合 受到同等条件的激发 核酸染料的荧光性会大幅度成倍增加 因此我们在PCR体系中加入过量的核酸染料后 可以通过检测荧光量得知DNA双链分子的量 Real timePCR即实时定量PCR 正如其名子一样 在整个DNA扩增或DNA溶解过程中 仪器能够每隔一定时间或温度 我们使用的仪器温度间隔0 1 反馈一个PCR管内体系当前荧光信息 用以反映当前双链DNA分子量 2PCR体系配制 2 1模板 取IR64以及日本晴叶片鲜样 剪刀剪碎 连同0 4mol LNaOH 40ul每孔 0 1mol LTris HCl pH7 5 160ul每孔 钢珠加入管中磨碎混匀 离心后取上清液即可得到 2 2引物 围绕SNP位点设计 交公司合成 稀释成10umol L 2 3混合体系 ddH2O实验室制得 其他如taq酶 DNTP等连同核酸染料直接购买公司已配好的混合液 2 4PCR体系中各成分加入量的比例 扩增时PCR体系为10mL 体系中各成分的比例如下 模板 浓度未知 引物 10umol L 引物 10umol L ddH2O 混合液27mL 8 1mL 8 1mL 91 8mL 135mL 3Real timePCR软件操作 3 1基本操作3 1 1打开Eco进入主界面3 1 2Applicationoptions选择HighResolutionMelt DetectionChemistry选择DNABindingDye StartingMaterial选择DNA Experimentname下的框内键入将要保存PCR及溶解过程的数据文件名 点选 进入下一界面3 1 3循环程序设计首先删除UDGIncubation列 PCRcycling 95 X2min 46cyclesX 95 X5sec 55 X30sec MeltCurve 95 X15Sec 55 X15Sec 95 X15Sec 循环程序设计图 3 1 4排版设计3 1 4 1Assays设计Assays设计可以把排版中的48个孔进行归类设计 设计为一类的孔对应的曲线图一定会在同一窗口中显示 不同类的孔可以选择同一窗口显示或不同窗口显示 我们在实验中把同一对引物的孔归为一类 3 1 4 2Samples设计在排版中设为同一samples空所对应的曲线图将被标致同一种颜色 我们在实验中把同一对引物 可理解成3 1 4 1中的一个类 根据模板的不同分成不同的samples 排版设计图 3 2注意事项 3 2 1使用real timePCR前先让仪器预热30分钟3 2 2在给排版贴膜后尽量避免刮花膜面中央 4Real timePCR的两个用途 4 1DNA定量与DNA延伸曲线单个双链DNA分子复制时 在理想状况下与细胞分裂一样 DNA分子数m与循环数c是指数关系 m 2cn个双链DNA分子复制时 在理想状况下 m n2c Log2m Log2n2c 两边同取以2为底的对数Log2m Log2n Log22cLog2m Log2n cm表示DNA分字数 经过一定的转换 由荧光染料及激发状态决定 就成了荧光值 在延伸实验中可任意设定 设定后称为荧光闸值 因此n的以2为底的对数与能使得荧光值达到m的循环数C成线性相关关系 因此可用一组已知浓度梯度的DNA模版进行PCR实验 可以得到一条关于Log2n与C的线性回归曲线 然后在同样的m值与相同的混合体系下 对未知浓度的DNA进行PCR后得到C值 把C值带入线性曲线即可求的未知DNA浓度 荧光值 循环数图 DNA延伸曲线 Cq值 初始DNA分子量对数回归曲线 事实上 在每个以 温度X时间 变化作为循环的过程中 体系内的每个DNA分子并不一定都能同步完成DNA复制过程 因此我们把e作为DNA分子在每个 温度X时间 循环中的扩增效率 在DNA双链形成前荧光物质也会有个初始荧光值m0故实际的荧光值 m nK 1 e c m0注 k表示双链DNA分字数与荧光增加值关系系数 4 2DNA定性与溶解曲线DNA双链主要通过H键保持相对稳定的双链结构 AT间2个H键 GC间通过3个H键相连 因此不同长度 不同GC比例的DNA双链的键能通常会不相同 在相同的温度下 具有不同键能的DNA分子热稳性不同 具体表现为升高同样的温度后 DNA分子的溶解情况会不同 我们做的SNP分子标记筛选正是利用该原理 由于一段核苷酸链上某个碱基的突变 比如C突变为T 这时发生碱基突变的双链DNA分子H键总数会比原链少一个 其分子热稳性也发生改变 通过对DNA分子间热稳性微小差异的分析即可区分仅有一对碱基不同的DNA分子 当然如果GC或AT互相发生突变时 双链DNA分子的键能将不会改变 因此该方法就有局限性了 荧光值 温度图 DNA溶解曲线 相对荧光百分率 温度图 DNA溶解曲线 5当前所遇问题及可供参考的解决方向 在进行了多对引物PCR后 我们会发现有的引物扩出的目的片段的溶解曲线会表现出明显的多态性 而有的引物的目的片段的溶解曲线不能明显区别亲本 杂合体以及突变体 以引物11 2为例在71 1 左右时 扩出的DNA片段溶解曲线能很好的反映出DNA片段的多态性 如下图所示 DNA溶解曲线 作为反例的引物11 1情况似乎没有那么好 所以我们在引物筛选时很快认定该引物的扩增片段不存在SNP 如下图所示 DNA溶解曲线图 事实上我在一次调试 自动寻找最佳分离温度代码 的过程碰巧用到了引物11 1的数据 运行结果显示该引物在87 附近出现最佳分离温度 这令我对自己编写的代码特别失望 因为平时寻找出的最佳分离温度很小有超过80 的 不甘心的我打开Eco文件找了将近30分钟 将用于调整图像的四根竖线分别放在85 2 86 0 87 2 87 8处时引物11 1所扩出的目的片段的溶解曲线表现出了了SNP 如下图所示 DNA溶解曲线 由于各种噪音的影响 原始的荧光数据很少能用作直接进行SNP区分的 而是要对荧光数据进行各种降噪处理后才能用于SNP的判定 Eco软件中用于移动改变溶解曲线位置的四条竖线是四个可以改变对原始荧光数据处理的方式的四个变量 每个变量至多有390个左右的可选值 四个变量组合有79 768 958种可供选择的对原始荧光数据的处理方式 Eco软件仅提供手动移动选择变量 通过直观看来选定合适的组合方式这显然会影响我们筛选SNP位点的质量及效率 由于软件只提供了原始荧光数据 隐藏了处理后的值 目前只能确定左边第一条竖线的含义 用于改变原始荧光数据处理方式的四条竖线 因此之前我们认为不存在SNP的引物对实际上可能会是合格的 假设设计的引物正确无误 且PCR过程也很好的把存在SNP的目的片段也扩了出来 但由于二级结构以及引物二聚物等各种因素的影响 基于荧光数据的溶解曲线很可能不轻易表现出SNP 以至于该引物日后不能用于标致 如果该处的SNP不是那么重要 我们就放弃或者找比较好的SNP位点代替 但如果该位点的SNP至关重要 我们就得考虑重新设计能够避开噪音的引物 当然我们还有一个选择 对现有的荧光数据进行深层次的各种变换 放大SNP位点引起的荧光值差异 减小噪音对溶解曲线的影响 但是有一个问题我们必须的考虑到 对数据进行各种处理的方式经常是基于主观的尝试性 很少会去先分析各种影响因素可能会对荧光数据造成的变化规律 因为对多重不定向微小影响因素分析需要大量的数据和时间代价 因此通过各种变换得出的能够区分SNP的数据往往会随着处理的层次加深 其数学性增强 而实际代表性减弱 也就是说经过多重变换找出的区别不一定是由SNP所引起 可能是模板情况或仪器内排版中的物理位置 甚至就是一个偶然 6荧光数据处理及代码自动寻找最佳分离温度尝试 由仪器直接获取得到的荧光值与温度的曲线图像噪声往往很大 比如来自加样时不同的DNA模板浓度及量 混合体系中酶 碱基浓度等影响DNA分子扩增量的因素均会影响到荧光值 温度溶解曲线 从而影响到SNP的判定 通过对原始数据的处理将可能会区分出SNP 原始荧光值温度溶解曲线 经过以55 时荧光值为参照百分化求导后相反数的温度溶解曲线 经过以55 时荧光值为参照百分化 求导 倒数后的温度溶解曲线特写 以63 的荧光值为参照溶解曲线 以55 的荧光值为参照溶解曲线 第一类问题及第一类自动寻找最佳分离温度代码尝试 我们设计SNP引物进行realtimePCR是为了以后将筛选到的SNP位点用于杂交过程中基因标致检测 因此我们需要的不仅仅是具有明显SNP引物 还有该引物扩出的具有多态性DNA片段的识别标准 我们选择的是在什么温度下能最清晰地区分不同类DNA分子的溶解曲线 以及日后在该温度下区分群体性质的标准范围 有的引物扩出的片段多态性特别明显 如下图所示 荧光值转换值 温度溶解曲线 a b c 上图可看出 曲线根据颜色的差异被明显地分成了3支 不同的颜色代表仅模板的不同 且有能明显区别3种颜色温度 我们只要选择能区分3种颜色曲线的最佳温度 以及在该温度下同一颜色曲线纵坐标范围 既可用于日后上群体的标准 第一类问题就产生了 对于提供的图像我们用肉眼去选择最佳分离温度是很有主观性的 所选的温度很难让人承认是最佳分离温度 在找同一颜色曲线的范围时 就更不方便了 于是我想到了用代码处理 即自动寻找最佳分离温度代码的设计 代码的核心思想是用两个指标用于最佳分离温度的判定 一是同一颜色 模板 对应曲线的重合情况 用标准差来反映 二是三种颜色曲线 求平均之后得到的数据 两两相互间的最少距离 代码的具体算法是对每一个温度下对应的上述两个值进行比较 选取方向为标准差越少 最少距离越大 经验证能够有效找出合适的分离温度 第一类自动寻找最佳分离温度代码的局限性分析第一类代码主要是用于对有明显SNP引物的最佳分离温度及该温度下荧光转换值的区间进行准确快速的查找 该代码在进行查找时 荧光值的转换方式是确定的 我选着的是把55 处的荧光值最为1 其他荧光值均为对其的比率 以消除同一种DNA片段不同浓度对溶解曲线的影响 因此该代码仅能对一些特别明显的SNP引物进行处理 对于需要进一步处理的荧光数据是无法使用的 第二类问题及第二类自动寻找最佳分离温度代码尝试 对原始数据不同处理下的溶解曲线图 第二类自动寻找最佳分离温度代码是针对SNP不明显设计 代码能够提供众多的对荧光数据的处理方式 代码在运行过成中先对每一种数据处理执行第一类自动寻找最佳分离温度代码的功能 然后对所有处理进行再次比较 优中选优 目前我编写的第二类代码仅能提供400种左右的对原始数据的处理方式 不过我还会投入时间寻找好的对原始数据的处理方式嵌入代码中用于最佳温度的查找 对代码寻找最佳分离温度分析 如过目前使用的仪器自带软件提供了满足我们足够需要的功能