「Hela肿瘤细胞培养操作规程【内容详细】」.doc

Hela肿瘤细胞培养操作规程一、实验准备1、细胞培养室的灭菌消毒 细胞培养室及操作台用75%酒精擦洗3遍2、实验所需器材准备 （1）移液器枪头的灭菌、烘干。（2）3、培养基及溶液的配制 PBS溶液的配置： 培养基的配置：二、细胞的复苏操作1、把冻存管从液氮或-80冰箱中取出来后，立即37水浴，同时轻微摇动。待液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。2、把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。3、把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。4、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。5、3天换一次培养基。三、 细胞的传代1、培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。2、把原有培养基吸掉。3、加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。4、细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。5、用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。6、把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。7、倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。8、根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。四、 冻存细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分把钟，写明细胞种类，冻存日期。4 30min，-20 30min，-80过夜，然后放到液氮灌中保存。 冻存液的配制： 70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。要注意的就是无菌操作！培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器。用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2 h，使之充分溶解。在超净台内过滤。分装到250 mL的玻璃瓶内。用封口膜封好，-20保存，过滤结束时，还要取少许培养基进行菌培，验证培养基是否是无菌。 胎牛血清的处理：没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在56条件下灭活30 min。在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停地摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出来。注意：刚取出的冻存血清不要立即放入56中，因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶破裂，应该放在室温逐渐溶解，然后，再进行灭活处理。 生长培养基的配制：90 mL IMDM中加入大约10 mL的胎牛血清（10% 左右），双抗可以不加。(有资料表明双抗对细胞有一定的毒副作用) Hanks 和D-Hanks液，以及胰酶的配制Hanks液是一种常用的平衡盐溶液，D-hanks液是不含钙镁的Hanks液。它们与细胞的生长状况下的pH值和渗透压一致，细胞在Hanks液中可生存几个小时，Hanks液主要用于清洗细胞。D-Hanks液主要用于配制胰酶。配制Hanks液需将CaCl2溶于蒸馏水，再将其它试剂配制成溶液，将两次配制的溶液混合，定容。胰酶是一种常用的细胞消化液，在原代培养时，用胰酶消化，使细胞从组织块中游离出来。传代培养时，用胰酶消化贴壁的细胞，并分散成单个细胞。胰酶分离细胞的能力与不仅与胰酶作用的温度、时间、浓度和pH有关，还与细胞的类型和特性有关。用于原代培养消化组织块采用的浓度为：0.1% 或 0.125%；用于传代培养采用的胰酶浓度为：0.25%或者0.2%。胰酶的配制：1）由于胰蛋白酶的作用主要机制是通过螯合钙镁离子，而钙镁离子是保持细胞和细胞之间相互连接所必需的，所以，胰酶的配制用无钙镁的D-Hank液，避免钙镁离子干扰胰酶的活性。2）胰酶在pH8.0时活性最强，在过滤除菌前，须用NaHCO3干粉调溶液的pH值。3）胰酶受热容易分解，所以避免盛夏配制，在配制过程中，温度保持在4，最后-20冻存。反复冻溶会影响胰酶的活性，要分装冻存。4）血清能降低胰酶的活性，所以，在终止胰酶的消化反应时，可加入含有血清的培养基。实验步骤配制Hanks液，高压灭菌，4保存。称取胰酶，在冰浴上进行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊状，最后用D-Hanks定容，过滤除菌。分装后，-20保存。 实验三、细胞传代培养 实验步骤1、准备工作：1）肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75% 的酒精擦拭双手，注意指间，和指甲周围。同时，用酒精棉球擦拭超净台。2）将培养液放置室温，备用。3）打开超净台内的紫外灯，照射20 min。同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。2、关闭超净台的紫外灯，打开风机。3、点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。4、在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。5、将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶。记住不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉。7、加入含有10%血清的培养基，用吹打管吹打，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养。以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法，对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000 rpm，5 min,然后，换入新的培养基即可。再分装到不同的培养瓶中进行培养。 不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点。4. 是否污染：传代或换液24 48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。 实验四、细胞冻存与复苏 实验步骤1. 为了保证细胞良好的状态，在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期，同时将细胞换液，次日，按照细胞传代培养方法，用胰酶消化贴壁细胞，将细胞用培养基冲下来，然后，用50 mL尖底离心管离心，1000 rpm，4min，弃上清，收集细胞。2. 加入适量的冻存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培养基）3. 分装到冻存管中，做好标记，标明细胞名称，保存时间，所用培养基等。4. 4放置30 min；-20放置1.5 h； -70放置12 h；最后移到液氮罐中。 细胞的复苏：细胞的复苏原则是快速溶化，因为如果缓慢的溶化，会使进入细胞的水分形成冰晶，对细胞造成伤害，因此，在复苏细胞时，将冻存细胞直接放到37的水浴中，使其迅速溶解。在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内，然后，加入3 mL的培养液。次日，观察细胞生长情况，并更换细胞培养液。细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出，模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件，在体外进行培养，使其能够继续生存、生长和繁殖。一. 传代前准备：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。2.用75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。二.胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37。2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养