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药品中防腐剂的抗菌效力测定与评价为了保证药品的安全性和有效性,药品必须符合相应的卫生学要求。但有些药品的有效组分没有足够的抗菌防腐能力,在这些成品制剂中则往往需要加入适当的防腐剂以有效控制微生物的生长。然而,防腐剂的抑菌效果往往会受到多个因素的干扰,如防腐剂的化学结构及其浓度、药品有效组分的物理和化学特性、制剂形式、包装材料(容器及其密封件)以及存贮条件等;并且所有的防腐剂都是有毒物质,因此就临床用药的安全性而言,在药品制剂的质量标准中制订防腐剂的含量测定和效力测定是非常重要的。13本文结合美国和欧洲药典最新版,详细介绍了药品抗菌防腐效力试验的试验方法,包括检测对象的细致分类和试验用菌悬液的制备,并分析了两部药典中对防腐剂抗菌防腐效力的合格标准的异同点。1进行抗菌防腐效力测试的药品分类药品的微生物学质量控制要求主要是依据给药途径而确定的。同样,药品的防腐效力要求也取决于其给药途径。表1综合了美国药典和欧洲药典对抗菌防腐效力试验的药品分类。表1抗菌防腐效力测试的药品分类4,5药品类别品种概述注射剂,其它以水溶液为介质或载体的肠外用药品(乳化剂、耳科用药、无菌鼻科用药和眼科用药等)局部用水性制剂、非无菌鼻科药品、非无菌乳剂类产品,还包括黏膜用药品。水性口服制剂(抗酸剂除外)水性抗酸剂注:欧洲药典将III类和IV类合并为III类。2试验用菌株的种类、保存及制备方法用于防腐效力测试的菌株应涵盖微生物的各个类别,如细菌、酵母菌和霉菌等,所选用的菌株应是常见致病菌的代表。表2列举了美国药典和欧洲药典推荐用于药品防腐剂抗菌防腐效力测试的菌株及其主要制备条件。表2抗菌防腐效力测试用菌株及其制备条件4,5菌株名称/编号培养基培养温度制备培养时间检测培养时间大肠埃希氏杆菌1EscherichiacoliATCC8739TSA/TSB232152151824小时35天铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaATCC9027TSA/TSB232152151824小时35天金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538TSA/TSB232152151824小时35天白色假丝酵母CandidaalbicansATCC10231SDA/SDB322152154452小时35天黑曲霉AspergillusnigerATCC16404SDA/SDB32215215610天37天注:11欧洲药典未将大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)列为防腐剂效力测定的常规试验用菌种,但建议对口服产品的防腐效力检测增加该菌种;并建议增加Zygosaccharomycesrouxii(IP2021192)对含糖量高的口服产品的检测。21TSA/TSB分别指大豆胰蛋白胨琼脂(Soybean-CaseinDigestAgar)和大豆胰蛋白胨肉汤(Soybean-CaseinDigestBroth)。基准配方,一升培养基内含消化性胰酪蛋白1710克、消化性大豆酪蛋白310克、氯化钠510克、磷酸氢二钾215克、葡萄糖(C6H12O61H2O)215克、纯水加至1000毫升,用1N的氢氧化钠调节pH值,使灭菌后培养基pH=713012。向TSB配方中再加入1510克琼脂后,即成TSA。31SDA/SDB分别指萨布罗氏葡萄糖琼脂(SabouraudDextroseAgar)和萨布罗氏葡萄糖肉汤(SabouraudDextroseBroth)。基准配方,一升培养基内含葡萄糖4010克、动物组织消化水解液和胰蛋白胨等比混合物1010克、加纯化水至1000毫升,用1N的盐酸调节pH值,使灭菌后培养基pH=516012。向SDB配方中再加入1510克琼脂后,即成SDA。菌株的生理条件是影响试验结果的关键因素。所有试验用菌株自菌种中心购买后的转种次数不得超过五代;菌种应于低温冷冻(宜在-30以下的冰箱或液氮内)保存。如果该菌种是用液体培养基培养的,保存前应将菌种的新鲜培养物(1824小时培养物)进行离心(离心速度通常约为4000转/分钟),然后用约二十分之一体积的无菌肉汤(TSB)将沉降的细胞悬浮于其中,最后向其中加入等体积的无菌甘油(浓度为20%),混匀后即予冷冻保藏。如果该菌株是用固体培养基培养,则将295中国药事2005年第19卷第10期生长在琼脂表面的菌落(或菌苔)刮下来并收集于含10%甘油的无菌肉汤培养基(TSB)内,然后分装至若干支无菌小试管(115210毫升,带螺旋盖帽)内,于低温下冷冻保存备用。使用时,取出一支小试管,并接种于相应的固体或液体培养基内培养并制备实验菌悬液。表2列出了制备实验菌悬液时各菌种的要求。如该菌种系采用固体培养法培养,制备菌液时应用少量无菌生理盐水(35毫升)将琼脂培养基表面的细菌细胞和白色念珠球菌细胞洗下来并收集于适当的容器中,再用无菌生理盐水将收集到的微生物细胞稀释至适当浓度(通常为1108CFUml-1);但黑曲霉菌则需延长培养时间直至产生孢子,用少量含0105%聚山梨酯(吐温)80的生理盐水溶液(35毫升)将孢子淋洗下来并收集于一无菌容器内,再用无菌生理盐水将收集的孢子液稀释至适当浓度(通常为1108CFUml-1)。用液体培养基培养的菌种于培养结束后(黑曲霉菌只能采用固体培养基培养),先用离心法将细胞沉降后,再用适量的无菌生理盐水溶液将细胞稀释至1108CFUml-1。细菌、酵母细胞和霉菌孢子的浓度通常都可采用比浊法来进行估测,但同时还采用平皿菌落计数法进行对照检查以确认比浊法的可靠性。制备好的细菌和酵母细胞悬液宜在低温(28)下保存并于24小时内使用,但霉菌孢子悬液可于一周内使用。超过保存时间,则需重新制备。43测定方法4,5测定时,可直接将制备好的新鲜(24小时之内)实验菌悬液无菌操作加入样品,如:采用无菌注射器刺入弹性胶塞内;如果直接接种不方便或是原容器内的样品量不足,也可无菌操作将足够量的样品加入一适当的无菌带帽小试管内,然后再向小试管中接入菌种。每个样品容器内只接一种试验菌悬液,并且菌悬液的加入量不得超过样品体积的110%,即如果容器内的样品量为100毫升,则加入的菌悬液体积不得超过110毫升。菌悬液与样品溶液经充分混匀后,实验菌株的细胞或孢子浓度应控制在1105CFUml-1至1106CFUml-1之间。实验菌悬液与样品溶液一经混匀后,将其置于2025下培养,在起始和指定的时间间隔内分别对每个容器取样(每次取110毫升或1克)并参照表2中的培养条件对菌液浓度进行计数检查,也可参照药典的微生物限度检查法进行计数检查。计数时,既可采用平皿菌落计数法,也可采用薄膜过滤法。微生物细胞或孢子的浓度单位均以CFUml-1表示,然后将每个浓度数据换算为标准对数值,最后计算各时间间隔下的对数下降值。在微生物计数过程中,采取适当措施消除或中和样品中防腐剂的抑菌性是计数成功和准确的关键。防腐剂的中和方法通常有以下三种:加入化学中和剂、稀释样品和薄膜过滤。根据样品特性,可将这三种方法组合使用。表3列举了部分药品用防腐剂及其对应的有效中和剂(亦称为钝化剂)。中和剂使用要得当,过量使用也会产生抑菌作用;稀释时所用的稀释倍数应保证菌落计数结果的有效性和可靠性(如每个平皿中的有效菌落数应在30300个之间,直径为47毫米的薄膜上的有效菌落数宜在100个以下)。因此,效力测试实验前应先对防腐剂的中和方法进行验证,以保证检测结果有效、可靠。表3药品用防腐剂及其对应的中和剂(钝化剂)6防腐剂的类别中和剂戊二醛、汞制剂硫酸氢盐酚类、酒精、乙醛、山梨酸酯常规稀释液乙醛甘氨酸季铵盐类化合物、对羟基苯甲酸酯类、双缩胍类卵磷脂EDTAMg2+或Ca2+离子季铵盐类化合物、碘、对羟基苯甲酸酯类聚山梨酯汞制剂硫基醋酸盐汞制剂、卤化物、乙醛硫代硫酸盐4防腐效力测定方法的验证4,6防腐效力测定方法的验证试验是为了证明样品预处理方法能将样品的抑菌性有效中和或消除,同时也证明所采取预处理方式及整个检测过程及检测条件等均不会影响样品中残存的试验菌的生长。验证时,试验菌株的制备方法须与上述防腐剂防腐效力测定用试验菌株的制备方法和接种量均相同;同时,对每个试验用菌株准备以下三组样品:样品组、蛋白胨对照组和和阳性对照组。样品组:按既定方法中和或稀释或过滤样品(或采用组合方法),再向其中接入试验用菌株,接种后菌液浓度与上述防腐试验相同,按照常规检测程序和培养条件检查试验用微生物的恢复生长情况;蛋白胨对照组:除了用A溶液(0.1%蛋白胨溶液)替代实际样品外,中和方式、检测程序和培养条件等均与样品组相同;阳性对照组:不经中和处理,将试验菌株稀释395中国药事2005年第19卷第10期并直接接种于固体琼脂培养基培养(稀释倍数与前两组试验相同)。如果样品组与蛋白胨对照组的微生物生长数量相似(无论采用平皿菌落计数法还是采用薄膜过滤法,二者检测结果之间不超过30%),则表明中和剂具有足够的中和效力,即该中和方式有效消除了样品的抑菌性;如果蛋白胨对照组与阳性对照组的微生物生长数量相似(二者检测结果之间不超过30%),则表明样品预处理用中和剂的毒性、检测程序和培养条件等均未对试验用微生物的生长有不良影响。需对试验用每个菌株均进行上述验证试验。为考察检验方法的稳定性和重现性,验证时,至少需考查三个不同批号的同类产品,分别进行三次验证试验。5合格标准4,5美国药典和欧洲药典对防腐剂的防腐效力标准有一些差异。但总的说来,欧洲药典对防腐剂的防腐效力标准比美国药典的相关要求更加严格。为了充分理解和把握美国药典和欧洲药典对防腐效力标准制定的特点及标准间的差异性,特将这两国药典的防腐效力标准列于表4和表5。表4美国药典对防腐剂防腐效力的合格标准4药品类别微生物对数下降值7天14天28天细菌110310无增加酵母菌、霉菌无增加无增加无增加细菌-210无增加酵母菌、霉菌-无增加无增加细菌-110无增加酵母菌、霉菌-无增加无增加细菌-无增加无增加酵母菌、霉菌-无增加无增加注:“无增加”是指微生物浓度对数值与前次检测结果的对数值之差不得超过015个对数单位。表5欧洲药典对防腐剂防腐效力的建议性合格标准5药品类别微生物对数下降值6小时24小时2天7天14天28天细