野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长作用

序号 编码 第九届 挑战杯 广东大学生课外学术科技作品竞赛 作品申报书 作品名称 作品名称 野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长长作用作用 学校全称 学校全称 华华南南农业农业大学大学 申申报报者姓名者姓名 集体名称 集体名称 罗罗慧芬慧芬 谢红谢红薇薇 赖伟赖伟豪豪 类别 自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作 A 类 科技发明制作 B 类 报送方式 省级报送作品 高校直送作品 2 说 明 1 申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写 2 申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体 项目填写 A1 或 A2 表 根据作品类别 自然科学类学术论文 哲 学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作 分别填 写 B1 B2 或 B3 表 所有申报者可根据情况填写 C 表 3 表内项目填写时一律用钢笔或打印 字迹要端正 清楚 此申报书可复制 4 序号 编码由第九届 挑战杯 广东大学生课外学术科技作 品竞赛组委会填写 5 学术论文 社会调查报告及所附的有关材料必须是中文 若是外文 请附中文本 请以 4 号楷体打印在 A4纸上 附于申 报书后 字数在 8000 字左右 文章版面尺寸 14 5 22cm 6 作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送 7 其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询 3 A2 申报者情况 集体项目 说明 1 必须由申报者本人按要求填写 2 申报者代表必须是作者中学历最高者 其余作者按学 历高低排列 3 本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认 姓 名罗慧芬性 别女出生年月1985 03 学 校华南农业大学系别 专业 年级农学院 2004 级农学 学 历本 科学 制全日制 入学时间2004 09 作品名称野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长作用 毕业论文题目 绿色荧光蛋白 GFP 标记水稻内生固氮菌 邮政编码510642 通讯地址华南农业大学五山公寓 9 栋 617 办公电邮政编码510642 申 报 者 情 况 常住地 通讯地址 华南农业大学五山公寓 9 栋 617 住宅电话61307576 姓 名性别年龄学历所在单位 谢红薇女19本科 华南农业大学资源环境学院 赖伟豪男21本科 华南农业大学农学院 其 他 作 者 情 况 资 格 认 定 学校学籍管理 部门意见 以上作者是否为 2006 年 7 月 1 日前正式注册在校的全 日制非成人教育 非在职的高等学校中国籍专科生 本科生 硕士研究生或博士研究生 是 否 部门签章 2007 年 3 月 1 日 4 院 系负责人 或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果 是 否 负责人签名 2007 年 3 月 1 日 5 B1 申报作品情况 自然科学类学术论文 说明 1 必须由申报者本人填写 2 本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认 3 作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写 4 硕士研究生 博士研究生作品不在此列 作品全称 作 品 分 类 D A 机械与控制 包括机械 仪器仪表 自动化控 制 工程 交通 建筑等 B 信息技术 包括计算机 电信 通讯 电子等 C 数理 包括数学 物理 地球与空间科学等 D 生命科学 包括生物 农学 药学 医学 健 康 卫生 食品等 E 能源化工 包括能源 材料 石油 化学 化 工 生态 环保等 作品撰写 的目的和 基本思路 目的 目的 内生固氮菌是近年来从植物组织中发现的一类 重要的固氮微生物资源 将宽叶野生稻中的内生固氮菌 资源进行分离 对发现的新类群进行科学描述及促水稻 生长作用研究 思路 思路 宽叶野生稻是栽培稻的近缘 其中的内生固氮 菌资源还未见研究报道 尝试从宽叶野生稻 Oryza latifolia 分离内生固氮菌新资源 经 SDS 蛋白电泳 DNA 指纹图谱聚类 脂肪酸成份分析 FAME 16S rRNA 基因 序列测定 初步确定是否为新类群 通过 Biolog 板 API 20E 测定其生理生化特性 DNA DNA 杂交等进一步描述 新种 并测定其促水稻生长作用 6 作品的科 学性 先 进性及独 特之处 科学性 科学性 内生固氮菌能固定空气中的氮 它的主要宿 主是非豆科作物 内生固氮菌定殖于植物体内而不使植 物产生病害 植物为细菌生长和固氮提供能源 低氧分压 的微环境 还避免了化合态氮的抑制和土著微生物的竞 争 因而内生固氮菌表现出较高的固氮效率 由于野生稻 长期自然生长和繁殖 存在着新的高效的内生固氮菌的 几率较大 在老师指导下 对宽叶野生稻中的内生固氮菌 资源进行分离 采用多相分类方法进行科学描述 并观察 其促水稻生长作用 先先进进性 性 首次从宽叶野生稻 O latifolia 中分离的内生 固氮菌株 经过细胞形态 DNA 和蛋白质指纹图谱 脂肪 酸成分分析 DNA DNA 杂交和 16S rRNA 基因序列测定 等分子技术 可以在国际上发表一个新种 充实内生固氮 菌资源种质库 研究其促水稻生长作用 获得自主知识产 权的应用材料 让水稻等非豆科植物具有固氮能力 不再 施用或少施用化肥 减少环境污染 其经济效益 社会效 益是十分明显的 独特之独特之处处 国内外对于内生固氮菌的研究才 10 多年 关于内生固氮菌促水稻生长的研究不多 还未见对宽叶 野生稻 O latifolia 内生固氮菌的分离和描述的报道 我 们的研究表明宽叶野生稻中存在着内生固氮菌新类群 并具有较高的固氮效率和促水稻生长作用 作品的实 际应用价 值和现实 意义 通过内生固氮菌新种的描述 了解内生固氮菌新种 的生理生化特性和系统进化地位 充实内生固氮菌种质 资源库 为新种应用于农业生产实际奠定基础 新种菌株 具有较高的固氮酶活性和促进水稻生长特性 说明让水 稻等非豆科植物具有固氮能力 不再施用或减少施用化 肥 避免因过多使用化肥而引起的土壤结构变化 减少环 境污染 在理论及实际上都具有极重要的意义 7 学 术 论 文 文 摘 氮元素是水稻生长发育的必需元素 也是影响水稻 产量的重要因素 首次对宽叶野生稻 O latifolia 内生固 氮菌资源进行分离纯化 经形态鉴定 SDS 蛋白电泳 DNA 指纹图谱聚类 脂肪酸成份分析 16S rRNA 基因序 列测定 初步确定为新类群 通过 Biolog 板 API 20E 测 定其生理生化特性 G C mol 测定 DNA DNA 杂交等 方法进一步确定为新种 可在国际刊物上发表 用乙炔还 原法检测到该菌株具较高的固氮酶活性 并明显促进水 稻生长 研究结果进一步充实了内生固氮菌种质资源 为 内生固氮菌应用于农业生产实际奠定了基础 作品在 何时 何 地 何种 机构举行 的会议上 或报刊上 发表及所 获奖励 鉴定结果 细胞形态显微观察 蛋白质电泳技术 IS PCR 指纹 图谱技术 脂肪酸甲脂分析 FAME G C mol 测定 DNA DNA 液相杂交技术 菌株碳 氮源利用及产酶等生 化测定 序列测定技术等 8 请提供对 于理解 审查 评 价所申报 作品具有 参考价值 的现有技 术及技术 文献的检 索目录 1 Ausubel F M Brent R Kingston R E Moore D D Seidman J G Smith J A et al Current protocols in molecular biology 1987 New York John Wiley 孔庆科等 2001 杨海莲等 1999 Buchenauer 1995 促进寄主植 物生长 Adhikari et al 2002 Varma et al 1999 有的能抑制使水稻种子 腐烂的异丝绵霉 Achlya klebsiana 和刺腐霉 Pythium spinosum 生长 Adhikari et al 2002 有的能固定大气中的氮供寄主植物利用 Chaintreuil et al 2000 Baldani et al 1997 有的具有固氮和溶磷双重 10 作用 张国霞等 2006 有的在促植物 糖蜜草 生长时 还能增强植物的 抗酸能力 如我们分离的糖蜜草内生固氮菌已申请专利和作为新种在国 际上发表 试验条件下能明显增强糖蜜草植株的耐酸能力 使糖蜜草能 在 pH4 0 的土壤中生长 王华荣等 2006 由于内生固氮菌定殖于植物 体内部 不仅可满足细菌生长和固氮所需的足够能源 低氧分压以及交 换代谢产物的微环境 还避免了化合态氮的抑制和土著微生物的竞争 因而表现出较高的固氮效率 安千里 李久蒂 1999 在禾本科植物的根 皮层到导管的广大区域定殖着大量内生菌 Coombs et al 2003 Elbeltagy et al 2001 冯永君 宋未 et al 2001 安千里 李久蒂 1999 如从耐盐 碱先锋植物卡拉尔草中分离到 Azoarcus sp A indigens A communis Azovibrio restrictus Azospira oryzae 等 3 属 4 种 Reinhold Hurek and Hurek 2000 甘蔗中能检测到 Azospirillum brasilense A lipoferum A amazonense Herbaspirillum seropedicae H rubrisubalbicans Acetobacter diazotrophicus Burkholderia spp 等 4 属 7 种内生固氮菌 Robert et al 2003 表现出较大的多样性 Tan et al 2003 的研究表明 施用氮肥能显减少水稻中内生固氮菌 的多样性和固氮酶基因表达 宽叶野生稻长期生长在未施肥的自然条件 下 存在多样性的 高固氮酶活性的内生固氮菌几率较大 关于宽叶野 生稻内生固氮菌的分离描述未见报道 且宽叶野生稻是栽培稻的近缘 从其中分离到的内生固氮菌易于转化应用到栽培稻的生产实际中 如果 让水稻等作物都具有固氮能力 那就等于为水稻建造了许许多多这样的 天然氮肥厂 将来可不施氮肥或少施氮肥 其经济效益 社会效益是十 11 分明显的 这也正是生物固氮成为热门研究课题的主要原因 D 推荐者情况及对作品的说明 说明 1 由推荐者本人填写 2 推荐者必须具有高级专业技术职称 并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员 教研组 集体推荐亦可 3 推荐者填写此部分 即视为同意推荐 12 4 推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认 姓 名张桂权性别男年龄50职称教授 院长 工作单位华南农业大学农学院 通讯地址 广州市华南农业大学农学 院 邮政编 码 510642 推荐 者情 况 单位电话020 85281175 住宅电 话 020 85282305 推荐者所在 单位签章 张桂权老师是华南农业大学农学院教授 博士生导师 情况属 实 签章 2007 年 3 月 12 日 请对申报者申报 情况的真实性作 出阐述 本作品是由罗慧芬 谢红薇 赖伟豪三位同学在农学院分 子遗传研究室老师指导下完成 作品内容真实 数据可靠 结 论正确 请对作品的意 义 技术水平 适 用范围及推广前 景作出您的评价 首次对宽叶野生稻 O latifolia 内生固氮菌进行分离纯化 采用科学的方法进行测定 在国际刊物上发表一个内生固氮 菌新种 充实了内生固氮菌的种质资源 并对其促水稻生长作 用进行研究 具有重要的理论意义和实际意义 试验设计合理 思路严谨 条理清晰 方法科学可行 其它说明 姓 名刘向东性别男年龄41职称教授 系主任 推 荐 者 情 况 工作单位华南农业大学农学院 13 通讯地址广州市华南农业大学农学院邮编510642 单位电话020 85280205住宅电话020 85283351 推荐者所在 单位签章 刘向东老师是华南农业大学农学院教授 博士生导师 情况 属实 签章 2007 年 3 月 12 日 请对申报者申 报情况的真实性 作出阐述 本作品是华南农业大学课外科技创新论文 在华南农业大 学分子遗传实验室完成 选题具有实践指导意义 内容真实 数 据可靠 结论正确 请对作品的意 义 技术水平 适用范围及推广 前景作出您的评 价 作品选题新颖且具有实践指导意义 从未研究过的宽叶野 生稻 O latifolia 中分离出内生固氮菌 对它进行科学鉴定 确定 其为内生固氮菌新种 并具有较高的固氮酶活性 这一系列的探 索对本科生来说是很高水平的 其它说明 14 学校组织协调机 构确认并盖章 团委代章 年 月 日 校主管领导或 校主管部门确认 盖章 年 月 日 15 E 全国组织委员会秘书处资格和形式审查意见 组委会秘书处资格审查意见 审查人 签名 年 月 日 组委会秘书处形式审查意见 审查人 签名 年 月 日 组委会秘书处审查结果 合格 不合格 负责人 签名 年 月 日 16 17 F 参赛作品打印处 野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长长作用作用 作者 罗慧芬 1 谢红薇2 赖伟豪1 指导老师 谭志远 1 教授 彭桂香2 讲师 华南农业大学 农学院 1 资源环境学院2 广州 510642 摘要 摘要 氮元素是水稻生长发育的必需元素 也是影响水稻产量的重要因素 首 次对宽叶野生稻 O latifolia 内生固氮菌资源进行分离纯化 经形态鉴定 SDS 蛋白电泳 DNA 指纹图谱聚类 脂肪酸成分分析 16S rRNA 基因序列测定 初步确定为新类群 通过 Biolog 板 API 20E 测定其生理生化特性 G C mol 测定 DNA DNA 杂交等方法进一步确定为新种 可在国际刊物上发表 命名为 Enterobacter guangdongense sp nov 用乙炔还原法检测到该菌株具较高的固氮 酶活性 并明显促进水稻生长 研究结果进一步充实了内生固氮菌种质资源 为内生固氮菌应用于农业生产实际奠定了基础 关键词关键词 宽叶野生稻 内生固氮菌 新种描述 中图分类号中图分类号 S334 Description of a novel species of endophytic diazotrophs isolated from wild rice and the promotion of the rice growth Authors LUO Huifen1 XIE Hongwei2 LAI Weihao1 Tutors TAN Zhiyuan1 PENG Guixiang2 College of Agriculture1 College of Resources and Environment2 South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstracts Nitrogen is one of the necessary elements of the rice growth and the strong impact on rice yields Endophytic diazotrophs isolated from wild rice Oryza latifolia were identified by cell morphology SDS PAGE protein patterns DNA fingerprinting patterns fatty acid methyl esters FAME and 16S rRNR gene sequence 18 analysis Further tests of Biolog microplates and API 20 E strips G C mol contents DNA DNA hybridization indicated that these isolates represent a novel species within the genus of Enterobacter described as E guangdongense sp nov Isolates also showed high nitrogen activity by acetylene reduction activity ARA tests and remarkably promote the rice growth These results indicated that endophytic diazotrophs may serve as valuable bioresource of microorganisms and potentially apply to agricultural production Keywords Oryza latifolia endophytic diazotrophs Enterobacter guangdongense sp nov 1 前言前言 内生固氮菌能够有效地侵染和寄生在植物的组织体内 而不使植物产生病 害症状 根瘤菌是从豆科植物中发现较早的内生固氮菌之一 而对于非豆科植 物内生固氮菌的研究起步较晚 1986 年 D bereiner 实验室首先从巴西甘蔗中分 离到内生固氮菌 Baldani et al 1986 1993 年 Reinhold Hurek 实验室从巴基斯 坦盐碱地先锋植物卡拉尔草 Kallar grass 的根 茎 叶中分离到内生固氮菌 并对它们的特性进行了研究 证明内生固氮菌与宿主之间形成了高效固氮系统 在 1993 年召开的第 9 次国际固氮大会总结报告中 赞誉了内生固氮菌的发现 它代表了一个新的 不同于经典联合固氮的共生固氮系统 开拓了一条新的扩 展生物固氮到其它作物的途径 随后国内外更多学者展开了内生固氮菌的研究 研究结果表明有些内生菌能帮助植物吸收营养 提高光合作用 增强植物抗病能 力 Reiter et al 2002 孔庆科等 2001 杨海莲等 1999 Buchenauer 1995 促 进寄主植物生长 Adhikari et al 2002 Varma et al 1999 有的能抑制使水稻种 子腐烂的异丝绵霉 Achlya klebsiana 和刺腐霉 Pythium spinosum 生长 Adhikari et al 2002 有的能固定大气中的氮供寄主植物利用 Chaintreuil et al 2000 Baldani et al 1997 有的具有固氮和溶磷双重作用 张国霞等 2006 有的在 促植物 糖蜜草 生长时 还能增强植物的抗酸能力 如我们分离的糖蜜草内生固 氮菌已申请专利和作为新种在国际上发表 试验条件下能明显增强糖蜜草植株 的耐酸能力 使糖蜜草能在 pH4 0 的土壤中生长 王华荣等 2006 由于内生 19 固氮菌定殖于植物体内部 不仅可满足细菌生长和固氮所需的足够能源 低氧 分压以及交换代谢产物的微环境 还避免了化合态氮的抑制和土著微生物的竞 争 因而表现出较高的固氮效率 安千里 李久蒂 1999 在禾本科植物的根 皮层到导管的广大区域定殖着大量内生菌 Coombs et al 2003 Elbeltagy et al 2001 冯永君 宋未 et al 2001 安千里 李久蒂 1999 如从耐盐 碱先锋植 物卡拉尔草中分离到 Azoarcus sp A indigens A communis Azovibrio restrictus Azospira oryzae 等 3 属 4 种 Reinhold Hurek and Hurek 2000 甘蔗中 能检测到 Azospirillum brasilense A lipoferum A amazonense Herbaspirillum seropedicae H rubrisubalbicans Acetobacter diazotrophicus Burkholderia spp 等 4 属 7 种内生固氮菌 Robert et al 2003 各类新的内生固氮菌资源的发掘 已成为开发和利用内生固氮菌功能的前提条件 Tan et al 2003 的研究表明 施用氮肥能显减少水稻中内生固氮菌的多样 性和固氮酶基因表达 宽叶野生稻长期生长在未施肥的自然条件下 存在多样 性的 高固氮酶活性的内生固氮菌几率较大 关于宽叶野生稻内生固氮菌的分 离描述未见报道 本研究旨在利用栽培稻的近缘种 野生稻 从其中分离到的 内生固氮菌易于转化应用到栽培稻的生产实际中 为将来开发和利用这类固氮 菌资源服务 2 材料与方法材料与方法 2 1 材料材料 2 1 1 菌株的分离 纯化菌株的分离 纯化 宽叶野生稻采集于华南农业大学野生稻苗圃 取植株新鲜根 洗净后 切 成约 1cm 长的小段 用 75 酒精浸泡 5 s 再用 0 1 氯化汞消毒 7 min 无菌水 冲洗 7 次 每次 5 min 最后一次冲洗的无菌水涂布的培养基检查洗净否 研磨 后制成浓度 10 1 10 2 10 3菌悬液 涂布在 NFb 琼脂培养基上 28 C 生长 2 3 天后 挑单菌落 镜检纯度 若不纯 重复平板划线 挑单菌落 镜检 NFb 培养基的主要成分 malic acid 5 0 g L 1 K2HPO4 0 5 g L 1 MgSO4 7H2O 0 2 g L 1 NaCl 0 1 g L 1 CaCl2 0 02 g L 1 0 5 bromthymol blue 2 0 ml L 1 vitamin solution 1 0 ml L 1 micronutrient solution 2 0 ml L 1 1 64 Fe 3 EDTA solution 4 0 ml L 1 KOH 4 5 g L 1 pH 6 8 其中 vitamin solution biotin 100 0 mg L 1 pyridoxol HCl 200 0 mg L 1 micronutrient 20 solution CuSO4 0 4 g L 1 ZnSO4 7H2O 0 12 g L 1 H2BO3 1 4 g L 1 Na2MoO4 2H2O 1 0 g L 1 MnSO4 1 5 g L 1 2 2 方法方法 2 2 1 固氮酶活性固氮酶活性 将获得的纯菌株分别接种于盛有 5ml NFb 半固体培养基的试管中 试管规 格为 10 100 mm 反口胶塞密封 置于 28 培养箱内培养 24 h 后 向管内 注入 1 10 体积乙炔气体 再培养 24 h 后 取 0 5ml 样品在气相色谱仪 SP 2100 北京产 上测定乙烯峰值 工作条件设置为 柱温 50 C 进样器 120 检测器温度 180 气体流量分别为 N2 30ml min 1 H2 30 ml min 1 干燥空 气 60 ml min 1 计算方法参考文献 姚拓等 2004 即 N ths VChx 9 24 其中 hx 样品峰值 hs 标准 C2H4峰值 C 标准 C2H4浓度 nmol ml 1 V 培养容器体积 ml t 样品培养时间 h N 产生的 C2H4浓度 nmol ml 1 h 1 2 2 2 nifH 基因的扩增基因的扩增 小量 DNA 提取法提取菌株 DNA 彭桂香等 2005 以正向引物 Zehf TGY GAY CCN AAR GCN GA 反向引物 Zehr ND GCC ATC ATY TCN CC D A G 或 T N A C G 或 T Y C 或 T R A 或 G 扩增 nifH 基因 Zehr 等 1989 反应条件是 97 预变性 3 min 97 变性 1 min 55 退火 50 s 72 延伸 35 s 总共进行 35 个循环 72 延伸 5 min 2 2 3 SDS 全细胞蛋白电泳全细胞蛋白电泳 蛋白质的提取 用预称重的 Eppendorf 管离心收集菌体 对数生长期 称 其重量 并用样品缓冲液裂解细胞 使其浓度达到 150 mg ml 1 将样品在 95 C 下加热 10 min 8000 r min 1离心 2 min 放入 20 C 冰箱中待用 临用前 将样品在 95 C 下加热 10 min 上样 全细胞蛋白电泳 用 DYCZ 24D 双垂直电泳槽 10 的分离胶 5 的浓缩 胶 电泳视指示剂溴酚兰到达胶的底端 0 5cm 处时停止 溶液的配方及具体操 作见参考文献 谭志远等 1998 闫爱民等 1998 胶的染色 电泳结束后把胶取下放大小适合的盒子里 用考马斯亮蓝 甲 醇和乙酸配成的染色液染色 染色液的量以刚刚浸过胶为宜 在 37 C 摇床振荡 30 min 然后用乙酸和甲醇配成的脱色液脱色 遵循少量多次原则 直到背景 21 蓝色褪去 谭志远等 1998 2 2 4 插入序列插入序列 IS PCR 指纹图谱分析指纹图谱分析 采用引物 J3 5 GCT CAG GTC AGG TGG CCT GG 3 作为 IS PCR 引物 彭 桂香等 2005 PCR 反应体系为 50 0 l 10 PCR 缓冲液 5 0 l 10 mM dNTPs 1 0 l J3 引物 浓度 50 0 mol 0 5 l 去离子无菌水 41 5 l 模板 DNA 浓度 20 0 ng l 1 1 0 l Taq DNA 聚合酶 3 U l 1 1 0 l PCR 反应条件 97 C 预变性 3 min 35 个循环 97 C 变性 50 s 56 C 退火 50 s 72 C 延伸 60 s 循环反应完成后 72 C 延伸 5 min 反应完成后用 2 琼脂糖电泳检测 PCR 产物 4 C 保存备用 将保存的 IS PCR 产物进一步用高分辨率的 6 聚丙 烯酰胺凝胶电泳 得到指纹图谱 彭桂香等 2005 2 2 5 脂肪酸组成分析脂肪酸组成分析 提取方法 本文参考卢焱等 1997 的实验方法 对样品的处理方法做了一些 改进 先培养细菌至对数生长期 取大约 40 mg 湿重的菌体放在 5 ml 带螺旋盖 试管中 盖子内衬特弗龙 teflon 密封垫 向样品管中加入 15 NaOH 甲醇 V V 1 ml 100 C 水浴 30 min 然后加入 25 HCl 甲醇 V V 2 ml 80 C 水浴 10 min 冷却后加入正己烷 甲基叔丁基醚 V V 1 1 1 ml 提取 脂肪酸甲酯 将提取物移入另一试管中加 12 NaOH 溶液进行洗涤 毛细管柱气相色谱条件 SP 2100 型气相色谱仪 北京产 与 N2000 色谱软 件联用 计算机采集数据 30 m 0 22 mm 0 22 m SE 54 弹性石英毛细管色 谱柱 FID 检测器 进样口和检测器的温度分别是 250 C 和 270 C 程序升温 120 C 维持 2 min 以 20 C min 1速率上升至 180 C 维持 1 min 然后以 5 C min 1的速率上升至 240 C 维持 1 min 继续以 10 C min 1速率上升至 270 C 维持 2 min 载气 N2 30 ml min 1 H2 30 ml min 1 干燥空气 300 ml min 1 2 2 6 G C mol 含量测定和含量测定和 DNA 杂交杂交 菌体培养与收集 DNA 的提取按文献 Marmur 1961 DNA G C mol 测 定采用热变性法 DNA 同源性测定采用初始复性速率法在 2XSSC 溶液中进行 以 Escherichia coli K12 作为参考菌株 De Ley et al 1970 谭志远等 1995 2 2 7 生理生化鉴定生理生化鉴定 生理生化试验测定菌株对碳源利用和产酶情况 可直接由 Biolog Hayward CA USA 和 API 20E 系统 bioMerieux Montakieu Vercieu France 测定 主要根据测 22 定系统指导手册完成 将菌株在 NFb 固体培养基上 28 培养 24 h 用生理盐水 制成菌悬液 OD 0 25 加入微量测试板中 28 培养 1 3 5 7 天 观察各孔颜 色变化并记录 判断菌株的生长情况 并将结果数值化 能生长或是阳性反应 记录为 数值化为 1 反之为 数值化为 0 采用不加权算术 平均 UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean 方法聚类 用 TREECONW Van de Peer and Wachter 1994 软件完成 2 2 8 16S rRNA 基因扩增及序列测定基因扩增及序列测定 以少量提取的 DNA 为模板 正向引物 25f 5 AAC T G T A AGA GTT TGA TCC TGG CTC 3 和反向引物 1492r 5 TAC GG C T TAC CTT GTT ACG ACT T 3 PCR 扩增 16S rDNA Tan 等 2001 PCR 反应条件是 97 预变性 3 min 97 变性 50 s 56 退火 50 s 72 延伸 60 s 35 个循环 72 延伸 5 min 测序由华大基因研究中心完成 所用引物为 35fc 5 CTK AAG AGT TTG ATC MTG GCT CAG ATT GAA CG 3 342fc 5 CTC CTA CGG GAG GCA G 3 和 930fc 5 GGT TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GGG AC 3 引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成 序列分析采用软件 CLUSTALX 进行比对 alignment 后 再用软件 GeneDoc 进行人工比对和格式转换 最后用 TREECONW 进行邻近法 neighbor joining method 聚类分析并构建系统发育树 2 2 9 细胞形态观察细胞形态观察 细胞形态观察采用负染色 Cole M 为 DNA pstI DNA marker 3 3 菌株的全细胞蛋白电泳聚类菌株的全细胞蛋白电泳聚类 将分离到的 6 株内生固氮菌进行全细胞蛋白电泳初步聚类分析 结果见图 2 6 株菌具有高度相似的蛋白质图谱类型 初步归为同一个类群 选取菌株 Ola 50 Ola 51 和 Ola 01 进行 16S rDNA 测定后 它们与已知亲缘关系最近的 种为 Enterobacter cloacae 将 E cloacae 模式菌株 CGMCC 1 2021T和 E aerogense 模式菌株 CGMCC 1 2022T及新类群菌株进行蛋白质图谱类型比较 25 发现它们间存在有较大差异 图 2 MM12345768 KDa 116 0 66 2 45 0 35 0 25 0 18 4 14 4 图图 2 SDS 全细胞蛋白电泳聚类图谱 M 蛋白质 maeker 泳道 1 2 3 4 5 6 7 8 依次为菌株 Enterobacter aerogense CGMCC 1 2022T E cloacae CGMCC 1 2021T Ola 51 Ola 10 Ola 50 Ola 12 Ola 01 Ola 28 箭头指出新类群与已知种蛋白条带差异 3 3 插入序列插入序列 IS PCR 指指纹图谱纹图谱分析分析 采用 IS PCR 指纹图谱技术从 DNA 水平上对新类群固氮菌和已知种模式菌 株进行比较 结果见图 3 图中新类群菌株除 1 2 条指纹带不一致外 其余带型 一致 从 DNA 分子水平上确证 6 株菌为同一类群菌 并与亲缘关系较近的已 知种有较大的差异 IS PCR 指纹图谱结果与蛋白质图谱的聚类结果一致 图图 3 IS PCR 指纹图谱分析结果 M DNA maeker 泳道 1 2 3 4 5 6 7 8 依次为菌株 Enterobacter aerogense CGMCC 1 2022T E cloacae CGMCC 1 2021T Ola 51 Ola 10 Ola 100 200 300 550 400 bp MM12345768 26 50 Ola 12 Ola 01 Ola 28 3 4 脂肪酸脂肪酸组组成分析成分析 新分离的 6 株菌与亲缘关系较近的已知种 E cloacae 除蛋白质 DNA 指纹 图谱水平上有较大差异外 在细胞脂肪酸含量和组成成分也存在这差异 图 4 尤其是在分离时间 9 5 min 时 新类群代表菌株 Ola 51 多出一种含量达 11 3 的脂肪酸成分 各脂肪酸含量列如表 1 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 00 min 28272625242322212019181716151413121110987654321 mV E cloacae CGMCC 1 2021T 28272625242322212019181716151413121110987654321 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 4 7 12 6 1 4 33 1 5 4 13 4 11 5 10 4 1 3 1 5 1 4 3 3 tr trtrtr 2 6 3 9 11 3 0 8 21 8 5 3 2 1 10 7 2 1 13 7 7 1 0 8 1 7 2 5 4 1 9 5 min mV Ola 51 图图 4 新类群代表菌株 Ola 51 与 E cloacae CGMCC 1 2021T脂肪酸成分含量气相 色谱图 含量少于 0 2 为 tr 表表 1 新类群代表菌株 Ola 51 与 E cloacae CGMCC 1 2021T脂肪酸成分含量 脂肪酸含量 菌株 主要共同成分 总计 不同成分 总计 E cloacae4 7 12 61 433 15 413 4 11 5 10 41 31 51 43 3100trtrtrtr0 Ola 512 63 90 821 85 310 7 13 77 10 81 74 19 58211 32 12 12 518 时间 min 6 2 8 810 5 12 0 12 5 14 5 16 5 17 5 18 4 19 5 22 6 25 69 513 4 15 8 21 2 27 含量少于 0 2 为 tr 28 3 5 G C mol 含量和含量和 DNA DNA 杂交杂交 新类群代表菌株 Ola 51 的 G C mol 为 55 0 6 mol 处于 Enterobacter 属 的范围 53 60 mol 内 6 株菌间 DNA DNA 杂交同源性为 80 以上 说明这 6 株菌为同一个 DNA 同源群 新类群代表菌株 Ola 51 与 E cloacae CGMCC 1 2021T和 E aerogense CGMCC 1 2022T的同源性分别为 43 2 和 42 1 低于 70 说明新类群菌株与 E cloacae 和 E aerogense 为不同的 DNA 同源群 代 表 Enterobacter 属的一个新种 3 6 生理生化生理生化测测定定 新类群菌株与已知种 E cloacae 模式菌株 CGMCC 1 2021T的生理生化 Biolog 和 API 20E 测定的聚类结果表明 在 74 相似性水平以上 新类群菌 株与参比菌株分成两个独立的类群 85 相似性水平上 新类群菌株聚类成群 图 5 新类群菌株具有较高的固氮酶活性 而 E cloacae CGMCC 1 2021T和 E aerogense CGMCC 1 2022T模式菌株均没有固氮酶活性 新类群代表菌株 Ola 51 与参比的模式菌株具体的特征差异见表 2 E cloacae CGMCC 1 2021 Ola 51 Ola 01 Ola 50 Ola 28 Ola 10 Ola 12 9080100 T 图图 5 新类群菌株与参比模式菌株的生理生化数值聚类结果 29 表 2 生理生化测定结果 Biolog 和 API 20E 测定结果 特征Ola 51E cloacae aaaaa特征Ola 51E cloacae 糊精 乙酸钠 吐温 40 丙酸钙 吐温 80 葵二酸 葡萄糖酸钠 羟基苯乙酸 琥珀酸钠 苯甲酸钠 乳酸钠 羟甲基纤维素 衣康酸 丁二胺 L 果糖 N 乙酰葡萄糖胺 密二糖 L 谷胺酰氨 棉子糖 D 丙氨酸 苹果酸 甘氨酸 肌苷 赖氨酸 尿苷 脯氨酸 甘油 组胺酸 L 阿糖醇 天冬氨酸 己六醇 酪氨酸 测金盏花醇 苯丙氨酸 赖氨酸脱羧酶 L 阿拉伯糖 精氨酸双水解 酶 NO2产生还原到 N2 正反应 positive 负反应 negative 二者都呈阳性特征 positive 能利用 D 葡萄糖醛酸盐 D 纤维二糖 半乳糖醛酸盐 水杨酸钠 山梨糖醇 L 谷氨酸 L 丙氨酸 D 核糖 D 果糖 乌头酸 D 木糖 蔗糖 木糖 丙酮酸钠 甘露醇 麦芽糖 山梨醇 柠檬酸钠 龙胆二糖 D 半乳糖 半乳糖醇 D 葡萄糖 D 甘露糖 L 鼠李糖 海藻糖 精氨酸 丝氨酸 水杨苷作唯一碳源 产细胞色素氧化酶鸟氨酸脱羧酶 半乳 糖苷酶 发酵鼠李糖 苦杏仁糖 VP Voges Proskauer 反应阳性 二者都阴性特征 negative 不能利用 D 阿拉伯糖 苦杏仁苷 丙二酸钙 脱氧胆酸钠 酮戊二酸 马尿酸钠 氨基 乙醇 菊糖 缬氨酸 松三糖 松二糖 胱氨酸 甲酸钠 草酸钠 塔格糖 尿素 肌醇 木糖醇 鸟氨酸盐酸盐香草酸 山梨糖 赤藻糖醇 甲硫氨酸 D 阿糖醇 氨基丁酸 L 羟脯氨酸 L 白氨酸 酒石酸钾钠 淀粉 色氨酸 苏氨酸 D 乳糖作唯一碳源 不能 产色氨酸脱氨酶 细胞色素氧化酶 明胶酶 脲酶 不产吲哚乙酸和 H2S 30 3 7 系统发育分析系统发育分析 16S rRNA 基因全序列分析表明 新类群菌株 Ola 51T Ola 50 Ola 01 与 E cloacae 亲缘关系较近 相似性为 98 图 6 由于 DNA DNA 杂交已表明新 类群与 E cloacae 为不同的 DNA 同源群 且 SDS 蛋白质电泳 DNA 指纹图谱 生理生化测定均表明新类群于 E cloacae 存在较大差异 将新类群命名为肠杆 菌属的一个新种 固氮肠杆菌 Enterobacter guangdongense sp nov 模式菌株为 Ola 51 图图 6 新类群代表菌株与已知菌株系统发育树状图 长度为 1 碱基差异 Shigella boydii strain 3557 77 AY696660 K variicola F2R9 AJ783916 E rhapontici ATCC 29283 U80206 T Pa stewartii LMG 2632 Y13251 T Citrobacter murliniae CDC 2970 59 AF025369 T E amylovora DSM 30165 AJ233410 T Pa agglomerans DSM 3493 AJ233423 T Pantoea ananatis LMG 2665 Z96081 T Erwinia psidii LMG 7034 Z96085 T P diazotrophicus LS18 DQ821584 Phytobacter diazotrophicus LS8 DQ821583 T Salmonella bongori JEO 4162 AF029226 S subterranea FRC1 AY373829 T S enterica ATCC 13314 AF008580 T C youngae CECT 5335 AJ564736 T Morganella morganii AU 1491 AY043390 Kluyvera cryocrescens 27 AY946284 Klu georgiana ATCC 51603 AF047186 Klu ascorbata CDC 0556 74 AF176566 C gillenii CDC 4693 86 AF025367 T En asburiae JCM6051 AB004744 T En hormaechei DSMZ 16691 AJ853890 T En cancerogenus LMG 2693 Z96078 T Enterobacter aerogenes JCM1235 AB004750 T K pneumoniae DSM 30104 AJ233420 T K singaporensis LX3 AF250285 T K granulomatis KH 22 AF010251 T Klebsiella pneumoniae ATCC13884 AF130983 T K pneumoniae subsp ozaenae ATCC11296 AF130982 T Pectobacterium carotovora ATCC 15713 U80197 Serratia marcescens ATCC 13880 M59160 T C werkmanii CDC 0876 58 AF025373 T C braakii CDC 080 58 AF025368 T C freundii ATCC 29935 M59291 T T Klu intermedia ATCC 33110 AF310217 100 81 53 55 90 99 100 97 66 58 100 100 100 100 56 94 77 91 100 81 S enterica serovar typhi CT18 AL627279 97 95 C koseri CDC 8132 86 AF025366 T C farmeri ATCC 51112 AF025371 T C rodentium CDC 1843 73 AF025363 T Citrobacter sedlakii ATCC 51115 AF025364 T C amalonaticus CDC 9020 77 AF025370 T Enterobacter cloacae ATCC 13047 AJ251469 T E guangdongense Ola 51 EF488759 T E guangdongense Ola 50 EF488758 E guangdongense Ola 01 EF488760 31 3 8 Enterobacter guangdongense sp nov 新种描述新种描述 Enterobacter guangdongense guang dong en se N L adj guangdongense referring to its isolation from O latifolia grown in guangzdong provice in southern China 革兰氏阴性细菌 杆状 能运动 端生鞭毛 图 7 大小 0 8 1 1 m x 1