荞麦内转录间隔区的扩增及序列分析-四川农业大学.doc

荞麦内转录间隔区（ITS）的扩增及序列分析生物科学2002级 曾子贤指导老师 吴 琦 副教授摘 要：本研究以野生金荞麦、栽培苦荞为材料，采用改进的CTAB法提取荞麦总DNA。设计一对特异性引物，对三份荞麦ITS区序列进行PCR扩增，均获得长约700bp的单一条带。PCR产物测序结果表明，野生金荞麦1号测序片段为699bp，包含ITS区序列为660bp；野生金荞麦2号测序片段为678bp，包含ITS序列为646bp；苦荞测序片段为640bp，包括ITS序列为599bp。将所得到的三份荞麦ITS区序列分别与GenBank中登录的荞麦ITS序列进行比较。结果表明，野生金荞麦1号与已知金荞麦ITS区同源率为90.8%，野生金荞麦2号与已知的金荞麦ITS区序列同源率达到91.6%。供试苦荞与已知苦荞ITS区同源率为99.8%。关键词：野生金荞麦；苦荞；内转录间隔区（ITS）序列；5.8S rDNA；PCR；序列分析Amplification and Sequences analysis of Internal Transcribed Spacer of BuckwheatZENG Zi-xian Biological Science, Grade 2002 Directed by WU Qi (Associate Prof. Ph. D)Abstract：Wildness F. cymosum and cultivated F. tataricum were investigated in this article. By the improving method of CTAB DNA extraction, total DNA from three buckwheat was obtained. A pair of specific primers was designed. The ITS regions of three buckwheat were amplified. The amplified fragments, about 700bp in length, were sequenced directly. The results show that the sequencing fragments are 699bp, 678bp and 640bp in length, including ITS regions of F. cymosum and F. tataricum are 660bp, 646bp and 599bp in length. Comparing F. cymosum and F. tataricum with sequences reported, it suggests that the homology rate of ITS sequence of F. cymosum, NO. 1 is 91.6% and NO. 2 is 90.8% and the homology rate of the ITS sequence of F. tararicum is 99.8%.Keywords: Wildness F. cymosum; F. tataricum; ITS sequences; 5.8S rDNA; Sequence Analysis荞麦属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）植物。荞麦不仅是营养丰富的粮食作物，也是有较好药用价值的药用植物。因此开展荞麦属植物的系统发育和分子进化研究，进一步完善荞麦属植物的分类和新种、野生种的鉴定，对丰富的荞麦遗传资源保护和利用以及荞麦属植物的开发和改良提供系统学资料。KweonHeo等1对荞麦属的野生种进行了分类，将其划分为3大类（表1）。 表1 荞麦属的分类第1类F. esculentum F. homotropicum F. esculentum. Ancestralis第2类F. cymosum F. tataricum F. tataricum. potanini第3类F. callianthumF. capillatumF. gilesiiF. gracilipesF. leptopodumF. urophyllumF. lineareF. macrocarpumF .pleioramosumF. rubifoliumF. statice近年来，分子生物学研究技术如RFLP分析、AFLP分析、SSR分析、RAPD分析、DNA序列分析为分子系统学的研究提供了重要的分子标记资料。其中核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列分析已被广泛的用于植物属内、近缘属间的系统发育分析2。对于荞麦种间亲缘关系，国际上多从传统的形态学、种间可杂交性、同功酶、cpDNA、rDNA、rbcL、accD、RAPD和ITS等方面进行研究。植物基因组因其结构和功能上的差异，进化速率有所不同。核基因组(nDNA)进化最快，约为叶绿体基因组(cpDNA)的2倍，线粒体基因组(mtDNA)进化最慢，还不到叶绿体基因组的1/33。由于cpDNA的进化速率远远低于nDNA，限制了其在较低分类阶元（如属、亚属）中的应用。因此，众多的研究者将注意力集中到nDNA中进化较快的DNA序列上，18S-26S核核糖体DNA（nrDNA）的内转录间隔区ITS(Internal transcribed spacer）正是符合要求的序列之一。植物细胞核中，编码rRNA的基因是一些高度重复序列组成的多基因家族，其中，编码核糖体小亚基rRNA的18S基因与5.8S、26S基因共同构成一转录单位（图1所示）。其中，18S与5.8S、26S间的基因间区分别为内转录间隔区（ITS）1和2。也就是说，ITS区被5.8S分隔成ITS1和ITS2两个区域。ITS1和ITS2的转录物在rRNA加工的过程中被切掉，但这两部分在nrRNA成熟过程中具有重要作用4。18s Nuclear rDNAITS15.8s rDNAITS226s Nuclear rDNAITS Region图 1 ITS区域结构（仿刘金姐 2000）本实验通过GenBank中发表的荞麦ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比对，根据White等（1990）5所报道的4条经典ITS序列的引物,设计一对特异性引物，以三份荞麦总DNA为模板进行PCR扩增，用扩增产物直接测序（包括ITS1、5.8s rDNA和ITS2），将这三份荞麦的ITS序列与GenBank中登录的荞麦ITS序列进行同源性比较和序列分析，为荞麦的系统演化以及荞麦的分类鉴定提供分子遗传学证据。1材料与方法1.1材料三份实验植物中，野生金荞麦（F. cymosum）1号采集于四川农业大学老板山，野生金荞麦（F. cymosum）2号和苦荞（F. tataricum）栽培种由成都高等烹饪专科技术学校唐宇教授提供。1.2试剂和仪器DNA提取液(50mmol/L Tris-Cl，25mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl，1%SDS，1%PVP)，无水乙醇，70%乙醇，氯仿和异戊醇（24：1），5 mol/L KAc，TE（10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，H2O），RNaseA，ddH2O，10PCR buffer，25 mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs，Taq酶（PCR扩增试剂均购自上海生工），GoldView（购自赛百盛），0.8%琼脂糖凝胶。 Bio-Rad凝胶成像系统，Eppendorf PCR仪，水平电泳仪，-20冰箱，制冰机，Thermo冷冻离心机，普通离心机，Unico UV-2102C型紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，灭菌锅，研钵，离心管，冰盘。1.3方法1.3.1三份荞麦总DNA的提取采用在CTAB法6以及王莉花等7提取方法基础上改进的SDS微量快速提取DNA。将100mg荞麦嫩叶放入置于冰上已灭菌的研钵中，再加入300L DNA提取液充分研磨；将磨细的样品转移到置于冰上的已灭菌的1.5mL离心管中，再向研钵中加入300L DNA提取液并转入同一离心管中；将离心管置于65水浴1小时，并不时轻轻上下颠倒离心管；再加入125L 5M KAc冰浴30分钟，再向离心管中加入400L氯仿/异戊醇（24：1），冰浴20min；将样品于4下，4000rpm离心15min，取上清液并转入另一灭菌的离心管中，并加入2.5倍体积的无水乙醇，上下轻轻颠倒；在4下，8000rpm离心4min，而后弃上清液；用70%乙醇漂洗沉淀1-2次，放入50烘箱干燥15min；用50L TE溶解DNA，用含GoldenView的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，测定OD260及OD280,确定DNA的纯度及含量。置于-20冰箱中保存备用。1.3.2 ITS序列引物的设计根据GenBank里已登陆的荞麦ITS序列AB000325-AB000329，AB000339，AB000340和Yasuo Yasui等8、White等5报道的引物序列，设计、选取出一对特异引物：Primer1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3Primer2: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3这对引物的扩增区包含了ITS1、5.8S和ITS2完整区域。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。1.3.3 三份荞麦ITS序列的PCR扩增在赵晖等9报道的雪腐核盘菌ITS序列扩增体系及循环程序基础上，改进反应体系以及退火温度和延伸时间。采用PCR总体积50L，反应体系如下：ddH2O 38.5 L10Buffer 5L25mmol/L MgCl2 2LdNTP mixture 1L20umol/L Primer1 1L20umol/L Primer2 1L模板DNA 1LTaq DNA聚合酶 0.5L（5U）总体积 50L按照上述顺序分别加入，反应循环程序：95 3min30个循环 94 30sec 52.5 1min72 55sec72 10min4 保存1.3.4 PCR扩增产物的检测取5L PCR产物与1L 6Loading buffer混匀，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.3.5 PCR产物直接测序将PCR产物直接送上海英骏生物技术有限公司纯化和测序。本实验选取的一对引物均位于ITS序列以外（图2），ITS1位于18s rDNA，ITS4位于26s rDNA5。因此直接采用下游引物进行单向测序，另一条链则以互补配对原则得出序列。 图2 ITS序列引物所在位置1.3.6 ITS序列分析将三份荞麦rDNA的ITS序列的测序结果与已登陆的荞麦ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比较，确定ITS1和ITS2的范围。用生物信息学分析软件DNASTAR 5.0对本实验序列及GenBank核酸数据库中荞麦属ITS序列进行比对和分析。 2结果与分析2.1荞麦总DNA的提取实验所提取的野生金荞麦1号、野生金荞麦2号和苦荞总DNA经Unico UV-2102C型紫外可见分光光度检测，三个样品的OD260/OD280分别为：1.9、1.8和1.8。野生金荞麦1号DNA有明显的RNA的污染，可通过电泳图分析，但已满足PCR反应对模板DNA纯度的要求。三份荞麦总DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，条带较为清晰，完整性较好，可以用于PCR反应。15kb10Kb7.5kb5kb2.5kb1kbMarker 1 2 3 图3 荞麦总DNA电泳检测1.野生金荞麦1号；2.苦荞；3.野生金荞麦2号2.2三份荞麦ITS区的PCR扩增以总DNA为模板，利用所设计的引物Primer1和Primer2（图2 所示ITS1和ITS4） PCR扩增出野生金荞麦1号、2号和苦荞ITS区的特异性条带。野生金荞麦1号、2号扩增片段大小约700bp左右，苦荞扩增片段略小于700bp与Yasuo Yasui（1998）8报道的荞麦属ITS区序列长度相近，结果见图4。4500bp3000bp2000bp1200bp800bp500bp200bpMarker 1 2 3图4 三份荞麦ITS区PCR扩增图谱1.野生金荞麦1号；2.苦荞；3.野生金荞麦2号2.3三份荞麦ITS区序列所获得三份荞麦ITS区序列由于测序的原因，在ITS1上游可能有14bp-26bp处未能测出，ITS区全序列下游有55bp-58bp在ITS区以外，测序结果如下。2.3.1野生金荞麦ITS区序列*GAGAGACCCGCGTACCCGTTCTCAAACACCCCCGCGGGGCGCCTTCCCCGACCCCGGGAGAGATCCCGGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGGTGCCTGTGGGGCAAGCTCTCCCGAAACGCCAAGTACGGTGGGGGGACCCTTCCCGGCTCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAGCCGCGTCCCGCCCCTCCCGGGCCCCGGGAGGGGCGGATACCTCACGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGCAACTGATATCTCGGCTCTCACATCAATGAAAAACGTAACTAAATGCGATACTTGGAGTGAATTGCACAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGGCTTCGGCTGAGGGGACGCCTGTCTGGGCGTCACCCATCCCGTCTCCCCCTCTCCCTCCTCCGTTCCTCGGAAGGAGGCGGGCGGCTAGGGCCCGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCGCCTCGCGGCCGACCTAAAGGCCGACCCCGTGGCCGCCAACGGCCGCTACAATTGATGGTGTACTGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCAGACAACCGGATAGCCACGGTCTTCAGAACCGATGCGACCGCACATCACACTGAACTACACGCTGATTTAAGCATATCATTAAAGCGGAAA扩增片段为699bp，包含ITS区序列为660bp。由于测序原因序列上游可能有18bp未能测出，用*标记；下游有57bp位于26S rDNA上。全序列包括开端到箭头处。2.3.2苦荞ITS区序列*AGCAGACAGACCCGCGCACCCGTTCTCAAACACCCCTGCCGGCGGGGCGAGCTCTCCCGAAACACCAAGTACGGAGGGCGGACCCTTCCCGGCCCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAAGCGCGTCCCGCCCCTCCCGGTCCCCGGGAGGGGCGGCGGCGCCGCGTCGTTTCTAAGAAACAGAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCCCGGCTGAGGGCACGCCTGTCTGGGCGTCACGCACCGCGTCGCCCCCCTCCCCCTCCTCCCTCCGCGGAAGGCGGGCGGTAAGGGGCGGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCCTCGCGCGGCCGGCCTAAACGCAGACCCCGTGGCCGCGAACGGCCGCGACGATTGGTGGTGTACCGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGAGCCGCGGGAGCTCAACCCGTGAAACCGGAGGGCCCCGGCCCTCCGAACCGTTGCGACCCCAGATCAGACGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCATAAGCGGAA扩增片段为640bp，包含ITS区序列为599bp。由于测序原因序列上游可能有14bp未能测出，用*标记；下游有55bp位于26S rDNA上。全序列包括开端到箭头处。2.3.3野生金荞麦2号ITS区序列*CGCGTACCCGTTCTCAACACCCCCGCGGGGCACCTTCCCCGACCCTAGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGATGCCGGTGGGGCGAGCTCTCGCGAAAGCCAAGTACGGTGGGCGGACCCTTCCCGGGTCCCACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCGCGGACCACGAACAGAACCGCGTCCCGAGCCTCCCGGTCCCCGGGAGGGGCGGCGACATCGCGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGAAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAACGTAACGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGTGGAATCCCTTGAACCATCCAGTCTTTGAACGCAACTTGCACCCGAGGCCTTCGGCTAAGGCTACGCCTGTCTGGGCGTCAGGCATCGCGTCGCCCCCTCCCCCTCCTCCCTTCCTCGGAAGGATGCGGGCGGCTAGGGGCGGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCCCCCCGCGGCCGGCCTAAACGCAGACCCCGTGGCCGACAACGGGCGCGACAATTGGTGGTGTACTAGACTACGCATCGCGTCACGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCACAAAACCGGAGAGCCCCGGCCTTCCGAACCGTTGTGACACCCGATCAGACGGCACTACCCGCTGAGTTTAACGATATCTTTAAACAGAACA扩增片段为678bp，包含ITS区序列为646bp。由于测序原因序列上游可能有26bp未能测出，用*标记；下游有58bp位于26S rDNA上。全序列包括开端到箭头处。2.4三份荞麦ITS区序列相似性比较野生金荞麦1号野生金荞麦2号苦荞图 5 三份荞麦ITS区序列相似性比较将序列测定的三条ITS区序列均去掉位于26S rDNA上的序列进行比对。ITS区变化主要集中在ITS1，而5.8S rDNA和ITS2序列比较保守。苦荞ITS1序列中缺失了一段59bp（37bp-96bp）富含CG的片断。由图5 可以看出野生金荞麦1号和野生金荞麦2号ITS序列之间的相似性较高，达到了86.6%，而两份野生金荞麦与苦荞ITS序列之间的相似性则要低一些，但也能达到81.0-82.4%。表明，在同一荞麦属中不同种的荞麦ITS序列之间存在一定的差异。2.5三份荞麦ITS序列长度及CG含量将所测三份荞麦ITS序列与已发表的金荞麦和苦荞ITS序列进行比较，确定ITS1和ITS2范围，结果见表2。表2 三份荞麦ITS1、ITS2和5.8S rDNA长度供试荞麦ITS-15.8sITS-2(C+G)%野生金荞麦1号野生金荞麦2号苦荞254bp232bp195bp162bp163bp160bp226bp226bp230bp65.26%66.18%68.72%（注：ITS1中未包含由于测序原因可能未测出的14bp-26bp）GenBank中登录的金荞麦序列ITS1序列长度变化较大60bp（212bp-272bp），ITS2长度变化仅为4bp（221bp-225bp），5.8s rDNA序列长度变化仅为3bp。野生金荞麦1号与已知金荞麦序列对比，ITS区序列单核苷酸多态性位点为80个，其中ITS1单核苷酸多态性位点为28个；ITS2单核苷酸多态性位点为37个；5.8S rDNA单核苷酸多态性位点为15个；缺失2个。野生金荞麦2号与已知金荞麦序列对比，ITS区序列单核苷酸多态性位点为66个，其中ITS1单核苷酸多态性位点为28个；ITS2单核苷酸多态性位点为23个；5.8S rDNA单核苷酸多态性位点为15个；缺失3个。将已知两条苦荞ITS序列对比，其序列完全相同，ITS1长度为213bp，ITS2长度为222bp，5.8S rDNA长度为164bp，与实验所测苦荞ITS序列相比，ITS区序列单核苷酸多态性位点为33个，其中ITS1单核苷酸多态性位点为10个；ITS2单核苷酸多态性位点为14个；5.8S rDNA单核苷酸多态性位点为9个；缺失14个。从表2可以看出两份野生金荞麦的ITS区序列长度是相当保守的，CG含量接近，而苦荞与两份野生金荞麦的ITS区序列差异稍大一些。但是三条ITS区的5.8S rDNA和ITS2长度都很保守，长度和碱基位点的变异主要在ITS1。2.6三份荞麦ITS区的种内相似性比较将野生金荞麦1号、2号和苦荞的ITS序列分别与GenBank上登录的荞麦ITS序列作种内相似性的比较，结果见图6和图7。金荞麦3号金荞麦4号金荞麦5号金荞麦6号金荞麦7号野生金荞麦1号野生金荞麦2号图 6 野生金荞麦1号和野生金荞麦2号ITS区序列相似性比较（野生金荞麦1号和野生金荞麦2号为供试材料；金荞麦3号-7号为GenBanBank登录序列）野生金荞麦1号ITS序列在种内的相似性为70.6%-90.8%；野生金荞麦2号ITS序列在种内的相似性为82.6%-91.1%。结果表明野生金荞麦2号与已知的金荞麦ITS区序列很接近，比野生金荞麦1号与已知金荞麦ITS区同源性高。苦荞1号苦荞2号实验苦荞图 7 苦麦ITS区序列相似性比较（苦荞1号、2号为GenBank登录序列；实验苦荞为供试材料）供试苦荞与已知苦荞ITS区序列种内相似性为99.0%-99.8%。表明苦荞ITS区序列在种内相似性很高。3讨论与结论3.1荞麦总DNA的提取本文采用了三种总DNA提取方法，均为小量DNA提取。方法一6是将与DNA提取液共同被研磨成匀浆的样品加入一定量的氯仿，离心后取上清液用无水乙醇沉淀DNA；方法二9则是将研磨成匀浆的样品于65水浴10min，离心之后加入氯仿/异戊醇（24：1），离心后取上清用无水乙醇沉淀DNA；方法三(/biolab)先让研磨成匀浆的样品65水浴1h后加入5mol/L醋酸钾冰浴30min，再向离心管中加入氯仿/异戊醇（24：1），离心后取上清用无水乙醇沉淀DNA。方法一未使用氯仿/异戊醇提取的DNA受蛋白质的污染较为严重，并且DNA提取量较少，小片段增多；方法二所提取的总DNA几乎没有蛋白质的污染，但是小片段DNA仍然存在，DNA总量较少；方法三提取的DNA基本满足本实验的要求。因此，异戊醇在去除已被分离的蛋白质的作用上影响很大。在提取DNA的过程中让荞麦破碎的细胞匀浆与提取液在65充分时间水浴，对于DNA在提取液中溶解至关重要。同时，冰浴中KAc对于已溶解在提取液中的DNA有固定的作用，使DNA不易断裂降解。受蛋白质污染的DNA模板在PCR扩增中，DNA不能充分的暴露使引物很少能与模板结合，甚至无法扩增。小片段较多的DNA样品在PCR扩增中可能导致目的基因不能完整地被扩增出来。3.2 ITS序列PCR扩增的引物设计ITS成为系统和进化等研究中重要的分子标记，它具有两个基础：第一，作为18S和26SrDNA的组成部分，ITS在核基因组中高度重复，而且通过不等交换和基因转换，这些重复单位间已经发生了位点内和位点间的同步进化11，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致，这就为对PCR产物直接进行测序奠定了理论基础12,13。第二，DNA测序工作的难易程度与DNA片段长度有密切关系，被子植物的ITS区长度比较稳定，包括5.8S rDNA在内，总长度只有565-700bp，测序方便。同时，ITS1、ITS2分别位于18S-5.8S rDNA、5.8S-26S rDNA之间，而18S、5.8S、26SrDNA的序列非常保守，这样就可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序14。本实验中的上游引物（Primer1）位于18S rDNA下游，上游引物位于26S rDNA上游。因此，能够扩增到完全的ITS区序列。3.3荞麦ITS序列的PCR扩增对于PCR反应中出现的非特异性条带，通常可能有3个原因：1.模板DNA由于引物同源性高的非特位异性位点；2.退火温度太低；3.过量的酶、引物和dNTP造成PCR反应混乱。本实验扩增的目的片断约为700bp，Tm值分别为62和58，根据Tm=4(C+G)+2(A+T)计算，一般退火温度比理论Tm值低5。因此最初将退火温度设定为52，72延伸1min，但扩增结果出现大于1200bp和约500bp的非特异性条带。将退火温度调高0.5至52.5，延伸时间相应减少5s，扩增得到特异性很好的单一条带。由于PCR扩增产物的特异性受Mg2+浓度的影响较大，因此筛选了Mg2+浓度。固定PCR反应体系的其他条件，使Mg2+终浓度分别为0.75mmol/L、1mmol/L、1.25mmol/L和1.5mmol/L。结果表明，Mg2+终浓度为0.75mmol/L的特异扩增条带几乎不可见；Mg2+终浓度为1mmol/L的特异扩增条带单一，亮度最佳；Mg2+终浓度为1.25mmol/L特异扩增条带亮度与Mg2+终浓度1mmol/L特异扩增条带相当，但是1200bp和500bp左右出现非特异性条带；Mg2+终浓度为1.5mmol/L的特异扩增条带亮度有所减弱，而非特异条带亮度逐渐增加。一般认为PCR反应的Mg2+浓度为1.5-4mmol/L之间15，由于Mg2+浓度与酶的工作效率有关，过低的Mg2+浓度大造成扩增不出特异性的条带；Mg2+浓度过高可能会产生非特异性条带，甚至可能由于Mg2+与PCR混合物中DNA模板、引物和dNTP的磷酸基结合，降低了游离dNTP的浓度，从而抑制特异性扩增16。本实验Mg2+的最佳工作浓度为1mmol/L。3.4荞麦ITS序列及5.8S rDNA序列的分析日本研究者于1998年对20种荞麦属的植物ITS区序列进行过较为完善的分析。ITS1和ITS2的长度比较保守。据统计，被子植物ITS1的长度为187-298bp，ITS2的长度为187-252bp。在目前所研究过的被子植物中，大多数类群中这两个片段所提供的信息量相近，虽然单独根据ITS1或ITS2均可得出重要的系统学结论17，但考虑到这两个片段的长度有限，各自的信息量并不充足。因此，大多数情况下都是将这两个片段综合起来考虑。关系密切的物种间ITS长度非常接近，而序列有一定程度的变异。 被子植物核rDNA的ITS区中，5.8SrDNA的长度非常保守，一般为163bp或164bp，仅在大豆属中发现其长度为168bp18，而且它的序列也很保守，在有些类群中根本没有变异19。因此，5.8SrDNA提供的信息有限，在研究中可不必测该片段的序列20。但近几年也有研究表明，高度保守的5.8SrRNA基因序列对揭示远缘属间的系统发育关系能提供一定的信息量，在研究中可将5.8S与ITS序列结合起来14。本研究将ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列结合起来对实验中野生金荞麦和苦荞进行同源性分析。结果发现，本研究中的野生金荞麦1号和2号ITS序列与GenBank登录的金荞麦序列比对，野生金荞麦2号与已知的金荞麦ITS区序列很接近，比野生金荞麦1号与已知金荞麦ITS区同源性高。苦荞与已知苦荞ITS区序列对比，种内相似性很高，同源率为99.8%。不同种的荞麦在ITS区序列上存在一定的差异。由于种的不同，ITS区序列长度和碱基有较大的差异，这正符合了利用ITS区序列分析对荞麦属的分类。在种间，ITS区序列存在的较小差异，可能由于实验材料采集地的不同，生活环境使荞麦的进化不同，同时丰富了荞麦的遗传多样性。本研究由于供试材料样本和时间限制，仅将野生金荞麦1号、2号和苦荞这三种荞麦分别与已知的金荞麦和苦荞ITS序列进行比对，难以构建荞麦属的系统发育树，不足以对荞麦属进行系统分类和遗传评价。因此需要对更多的荞麦属材料进行分子遗传分析，这对荞麦种质资源的保护和利用具有重要意义。参考文献1Kweon Heo, Ki Cheol Lee, Ohmi Ohnish. Pericarp Anatomy and character evolution of fagopyrumA. Seung Shi Ham Yong Soon Choi, Nam Soo Kim Cheal Ho Park. Advances in buckwheat research, Proceedings of the 8th international symposium on buckwheatC. Chunchon Korea: published by the Organization Committee of the 8th international symposium under the auspices of the International Buckwheat Research Association, 2001. 256-260.2宋葆华，陈之端，旺小全，李法曾. 中国苋属nrDNA的ITS序列分析及其系统学意义J. 植物学报，2000，42（11）：1184-11893 Wolfe K H, Li W-H, Sharp P M. Rates of nucleotide substitution Vary greatly among plant mitochondrial, chloroplast, and nuclear DNAsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:9054-9058.4Baldwin B G, Sanderson M J, Porter J M, et al.,. The ITS region of nuclear ribosomal DNA：A val able source of evidence on angiosperm phylogenyJ. Ann Missouri Bot Gand, 1995, 82：247-27.5White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J.(1990) Amplification and direct sequencing of Fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. 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