螺旋藻汁加工技术研究毕业论文.doc

目录1 前言71.1 螺旋藻营养价值及保健功能71.1.1 蛋白质71.1.2 螺旋藻多糖（PSP）91.1.3 脂肪酸91.1.4 维生素91.1.5 矿物质101.2 螺旋藻加工利用现状及发展趋势101.3 本试验研究的目的、内容和意义122 材料与方法132.1 材料、试剂及仪器132.1.1 材料及试剂132.1.2 仪器及设备132.2 螺旋藻的破壁132.2.1 自溶132.2.2 研磨法132.2.3 冻融温差法142.3 螺旋藻汁的脱腥142.3.1 螺旋藻清液制备142.3.2 脱腥处理142.4 蛋白质稳定性研究142.4.1 pH对蛋白质稳定性影响152.4.2 温度和加热时间对蛋白质稳定性影响152.5 评定及分析方法152.5.1 脱腥效果评价：感官评价152.5.2 蛋白质的测定152.5.3 藻蓝蛋白浓度测定152.6 计算方法153 结果与讨论173.1 破壁结果173.1.1 自溶破壁173.1.2 研磨破壁173.1.3 冻融温差破壁183.2 脱腥结果193.2.1 加热法脱腥193.2.2 -环状糊精脱腥193.2.3 -环状糊精与加热法交互试验脱腥193.3 螺旋藻蛋白质稳定性研究结果213.3.1 pH对蛋白质稳定性影响213.3.2 温度和加热时间对蛋白质稳定性影响214 结论23参考文献24致谢26 Contents1 Introduction71.1 Nutritional value and health function71.1.1 Protein71.1.2 PSP91.1.3 Fatty acid91.1.4 Vitamin91.1.5 Mineral substance101.2 The utilization and prospects of spirulina101.3 The purpose， content and meaning of this study122 Materials and methods132.1 Materials， reagents and equipments132.1.1 Materials and reagents132.1.2 Instruments and equipments132.2 The disruption of cellwall132.2.1 Autolysis132.2.2 Grinding132.2.3 Freezing and thawing142.3 Spirulina deodorization142.3.1 Preparation of Spirulina solution142.3.2 Deodorization treatment142.4 Protein stability142.4.1 Effects of pH on protein stability152.4.2 Effects of temperature and heating time on protein stability152.5 Evaluation methods152.5.1 Deodorization evaluation152.5.2 Determination of protein152.5.3 Determination of PC152.6 formula153 Results173.1 The results of the disruption of cellwall173.1.1 Autolysis173.1.2 Grinding173.1.3 Freezing and thawing183.2 The results of deodorization193.2.1 Heating193.2.2 Addition of -cyclodextrin193.2.3 -cyclodextrin interaction with the heating deodorization193.3 The results of protein stability213.3.1 Effects of pH on protein stability213.3.2 Effects of the temperature and heating time on protein stability214 Conclusion23References 24Acknowledgements 26螺旋藻汁加工技术研究（山东农业大学 食品科学与工程学院 271018）指导教师 张锦丽摘要：本文以极大螺旋藻为原料，研究了螺旋藻的破壁、脱腥方法及螺旋藻汁中蛋白质的稳定条件。采用自溶、研磨及冻融温差对螺旋藻进行破壁；以-环糊精添加量、加热温度、时间为因素进行正交试验设计，确定螺旋藻汁脱腥的最佳方案；研究不同pH、加热温度、时间对蛋白质稳定性的影响。结果表明，冻融温差法即在-20冻2h后于25下融化破壁效果最好，添加4.5%的-环糊精于40下加热20min脱腥效果较好，蛋白质在pH=8，40下加热60min时稳定性最好。关键词：极大螺旋藻;破壁;脱腥;稳定The Research on Spiral Juice Processing Technology(College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, 271018)Advisor Zhang JinliAbstract：Based on the spirulina maximum as raw materials, this article studied the disruption of its cellwall, deodorization technology and protein stability conditions. Autolysis, grinding and freezing and thawing were used to disrupt the cellwall ,-cyclodextrins, heating temperature and time for factors of orthogonal experimental design for deodorization .Different pH, heating temperature and time on the stability of the protein were also studied. The results were as follows: the freezing and thawing method is better, heated at 40,20min with 4.5% -cyclodextrine, the fishiness was weaker. And the protein was stable when pH is 8 or be heated at 40 for 60min.Keywords： Spirulina maximum, disruption of cellwall, deodorization, stability1 前言1.1 螺旋藻营养价值及保健功能螺旋藻（Spirulina）是一种单细胞水生植物，形如钟表发条，呈螺旋状，蓝绿色，所以又称为蓝绿藻，隶属蓝藻门、蓝藻纲、段殖体目、颤藻科、螺旋藻属。它主要生长在纬度35S和35N之间的非洲、亚洲和南北美洲，太阳辐射600-800 kJ/c年，总日照为3000-4000 h/年的地区，生长速度比高等植物要快得多，可以全年捕集1 杨志雷,林奇,等.新型饮料螺旋藻保健饮料的研制.云南农业大学学报,1998,13(2):183-1871。目前在我国研究最多的有两个种:钝顶螺旋藻、极大螺旋藻2 许宝青.钝顶螺旋藻中荧光藻蓝蛋白的分离纯化.浙江大学硕士论文,2003:3-52。螺旋藻是地球上最早出现的产氧光合原核生物，其超微结构和生化特性很像细菌和高等植物的叶绿体。其细胞壁较厚，有内壁、外壁和胶质鞘多层结构，其中内层含有肽聚糖，外壁含有脂蛋白和脂多糖以及胶质鞘，溶解性差3 崔永舶,陈庆森,等.碱性蛋白酶对螺旋藻活性蛋白的酶解研究.农产品加工刊,2008,142(7):22-263。藻细胞中含有不成堆的光合片层(类囊体)，光合作用的电子传递反应和呼吸作用均发生于类囊体内，它所含的光合色素有叶绿素A、水溶性的藻蓝蛋白色素、藻蓝蛋白、藻红蛋白及异蓝藻素，因此螺旋藻与其它植物一样能够利用阳光、二氧化碳等合成有机物，同时放出氧气4 张忠义.螺旋藻的生物学评价.食品科技,1999(5):52-534。大多数螺旋藻喜欢高温(25-36)、高碱(pH 9-11)，在这样的环境下，许多其它生物都难以生存，螺旋藻却能迅速生长繁殖，而且它亦可在盐湖、碱地及沿海盐地的海水中生长5 王翠燕.螺旋藻的开发与研究.食品研究与开发,2000,21(3):31-345。螺旋藻中含有多种营养成分，含人体所必需的几乎全部营养，是目前所知食物中营养成分最充分、最全面、最均衡的、任何一种天然食物都无法比拟的最佳营养食品6 王梦弈.螺旋藻的研究概况.黑龙江医药,2009,22(1):636。螺旋藻应用范围也十分广泛，特别是在功能食品、高效饲料、医药制品和精细化工等领域都有广泛应用。作为一种天然的保健食品，它对某些疾病还有独特的功效。据测算，1g螺旋藻所含的营养成分相当于1kg多种蔬菜的营养总和。正因如此，1972年第二次国际微生物蛋白质会议上螺旋藻被认定为“未来的超级营养食品”；1974年联合国世界粮食会议上公认为“超级营养食品”；1981年美国粮食及药物管理局（FDA）确定为“人类21世纪最佳保健品”；我国卫生部认定为“新资源营养食品”。1.1.1 蛋白质螺旋藻中蛋白质含量约为60%-70%，其蛋白质效价也十分高，且氨基酸种类齐全，其中8种必需氨基酸的含量与FAO所设计的人类食品理想特性标准十分接近，其中亮氨酸（5.8%）、苯丙氨酸（3.4%）、苏氨酸（4.2%）及缬氨酸（6%）含量已超出FAO标准（分别为4.8%、2.8%、2.8%、4.2%）。蓝藻中的一种重要蛋白质为藻胆蛋白（phycobiliproteins，PBP）。PBP是一种古老的蛋白质，在原始海洋出现蓝藻时就有这种蛋白质。在叶绿素出现以前，PBP是主要的捕光色素蛋白。在长期的生物进化过程中，这种蛋白质并没有消失，在一些藻类中大量存在。螺旋藻中PBP的含量可达细胞干重的25%-28%。1928年Lemberg首次证明藻胆蛋白是由脱辅基蛋白和四吡咯结构的色基组成。在藻胆蛋白中总共发现4种色基，分别为藻蓝胆素(PCB)、藻红胆素(PEB)、藻尿胆素(PUB)和PXB2。PBP根据其藻胆素光谱性质及PBP来源分为藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）和别藻蓝蛋白（APC，又称异藻蓝蛋白）。蓝藻中含有的藻红蛋白和藻蓝蛋白又分别称为C-藻红蛋白（CPE)和C-藻蓝蛋白（CPC）。实验证明，PBP是一类寡聚体蛋白，基本构建单位是-和-亚基，亚基的分子质量在17-22kDa之间。一般说来，PBP的-亚基和-亚基形成稳定的单体（），再由单体聚合为多聚体（）n。有关螺旋藻蛋白的研究现在多集中在藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白方面，经过分离纯化测得这两种蛋白的分子质量分别为28.0-38.0kDa和28.5-44.0kDa7。对粗提的藻胆蛋白溶液进行全波段扫描， 得出藻蓝蛋白的特征吸收在615nm，别藻蓝蛋白的特征吸收在652nm处（见图1）7 谭仁祥.功能海洋生物分子发现与应用.北京：科学出版社,2007：225-4737。图1 藻胆色素的吸光特性藻蓝蛋白以何种聚集态存在受多种因素影响，pH值、蛋白质浓度、离子强度、辐射以及光照强度和光照时间等都能使藻蓝蛋白聚集度发生改变。当藻胆蛋白从机体中分离纯化出来后，由于已经没有邻近的受体来转化收集过来的能量，这种水溶性的亮颜色的蛋白就变得具有高度的荧光性。藻胆蛋白的光谱学和结构特性使得它具有独特的定性和定量特征，从而在作为荧光标记时大有前途。自从20世纪80年代将蛋白应用到免疫测定、单细胞分析和流式细胞仪的分离，将蛋白作为荧光探针在生物的各领域都显示了很大的前景，如将多色流式细胞技术用于细胞分析和分类等。同时，一些新的藻胆蛋白探针或共轭物的发展提高了在稀释状态下藻胆蛋白的稳定性8 卓素珍,张虹.螺旋藻中藻蓝蛋白的生理功能及其提取纯化研究进展.食品科技,2008(1):150-1528。造血干细胞的损伤或修复在造血功能型辐射疾病中有至关重要的作用，藻蓝蛋白可提高机体抗辐射能力，能够有效抵抗紫外线和其他电离射线辐射，显著抑制血细胞的减少，还能降低造血干细胞的光敏感性，防止干细胞减少，促使细胞进入增殖状态，有助于造血功能的恢复9 章申峰.C-藻蓝蛋白及其亚基的分离纯化和体外抗肿瘤研究D.浙江:浙江大学,20059。APC在日光照射下，透射光为亮丽的天蓝色，而反射光则为红色荧光，由APC 产生的荧光强而稳定，因此可用于藻荧光探针的研究与开发。另外，将PC、APC作为一种天然的食用色素添加到食品、饮料中，不仅可以改变它们的颜色，而且可以提高其营养价值10 张少斌,张英娇,等.螺旋藻别藻蓝蛋白稳定性研究.食品研究与开发,2007,28(2):21-2310。1.1.2 螺旋藻多糖（PSP）螺旋藻多糖具有显著的抗辐射、抗衰老、抗突变、抗病毒、抗氧化、抗疲劳、增强机体免疫等功能，还降血糖降血脂，可作为保健食品的重要功能因子。它能提高内切酶活性，促进DNA的修复合成，能显著提高机体非特异性细胞免疫功能和特异性的体液免疫功能，并且通过增强机体免疫力的作用，间接地抑制癌细胞的生长。目前对螺旋藻多糖成分的报道不一，这可能是因为藻种和培养条件及分离提纯方法有所差异。有人分离提纯了螺旋藻多糖，并测定了理化性质，认为螺旋藻多糖是水溶性多糖，分子质量为12590Da，组成为D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和葡萄糖醛酸，相对含量分别为30.9%，29.8%，22.7%和16.5%。后来又有人认为，其单糖组分为D-葡萄糖（95.1%）、D-木糖（7.1%）、L-鼠李糖（1.8%）和一种未知单糖，以（1-3），（1-6）-糖苷键相连，分子质量为15000Da11 李八方.海洋保健食品.北京：化学工业出版社,2009：175-17911。另外，人们对螺旋藻多糖进行修饰改性研究，利用多种手段筛选出对硒富集力强、温度适应范围较广、繁殖快并便于工业化生产、细胞壁薄且容易被人体吸收的螺旋藻，在人为加硒胁迫条件下，使硒在单细胞藻体内形成含硒多糖，并通过提取分离获得硒多糖7。硒多糖兼有多糖与硒的功能，表现出更强的活性，如具有调节免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化及降血糖等生理功能，而且由于其毒性低、活性强、利于机体吸收等特点，已成为国内外研究热点12 崔叶洁,胡滨.螺旋藻多糖的生理功能及其修饰改性研究.食品工业科技,2010,31(4):405-40712。1.1.3 脂肪酸螺旋藻所含的类脂几乎全都是重要的不饱和脂肪酸亚油酸、-亚麻酸，胆固醇含量极微。螺旋藻是迄今发现的自养生物中唯一含有丰富-亚麻酸的生物，藻粉中含量高达11970mgkg，占脂肪酸类的20-30。亚油酸是人体必需脂肪酸，也可在人体内通过代谢生成-亚麻酸，参与调节人体的各种基本生理过程，包括调节血压、胆固醇合成等，可防止糖尿病、癌症、肥胖症及皮肤老化等13 王文博,高俊莲,等.螺旋藻的营养保健价值及其在预防医学中的应用.中国食物与营养,2009(1):48-5113。1.1.4 维生素螺旋藻中维生素十分齐全，其中有被称为“抗癌之神”的-胡萝卜素。它在体内转化为Va,并同Va一样可保护视力，对青光眼、白内障具有一定疗效，它还是抗氧化剂，能有效清除体内自由基，防止人体组织细胞的破坏，延缓机体衰老14 李志勇.螺旋藻功能性因子及保健作用的探讨.中国食品工业,1999(5):1214，但是食用-胡萝卜素后的患病率比直接摄取源于动物性食物的Va要低。1.1.5 矿物质螺旋藻中矿物质含量丰富。含钾15000mg/kg-20000mg/kg，钾能促进体内钠的排泄、降低血压；含镁2000mg/kg-3000mg/kg，镁能保持循环器官健康，预防心脏病的，而且能防止钙在血管壁上沉淀；含铁500-1000mg/kg，且螺旋藻中的铁与藻蓝素共存，其利用率高；含硒量也很大，有助于改善老年人生理平衡失调，起到防衰老作用15 吴文龙,杨志娟.螺旋藻保健食品的功能因子与研究开发进展.食品研究与开发, 2006,27(2):129-13115。1.2 螺旋藻加工利用现状及发展趋势经常食用螺旋藻，不仅能提高人们对蛋白质和氨基酸的摄食量，而且还可以减肥，对贫血、溃疡病、糖尿病、肝脏疾患以及视觉不良等疾病均具有良好的治疗效果，是一种难得的多功能食品16 詹嘉红.食用蛋白资源螺旋藻的开发利用.生物技术,1995,5(4):42-4416。螺旋藻食品的加工利用，基本上有两种途径：一是以螺旋藻粉作为组分研制产品，如螺旋藻胶囊、片剂。很早以前，生活在非洲乍得湖及墨西哥特斯科科湖附近的居民，便从湖里捞取螺旋藻晒干并制成藻饼食用。二是首先把螺旋藻中的功效成分如多糖、藻蓝蛋白提取出来，以此功效成分作为食品组分研制功能性食品，是深加工螺旋藻食品。目前我国的螺旋藻食品基本上是第一种途径产品，第二种途径尚处于功效成分提取的研究阶段17 侯建设.我国螺旋藻食品的研制与开发现状.食品研究与开发,2000,21(4):23-2617。在胶囊、片剂等产品中，螺旋藻添加量大，因此具有显著的抗疲劳、抗辐射等功能，这类产品被批准为保健食品，但由于螺旋藻带有很大的藻腥味，不具备食品所要求的色、香、味等良好的感官性质。而螺旋藻饼干、饮料等食品，为保证其感官性质良好，螺旋藻只能少量添加，活性成分难以达到发挥保健功能的含量，这类食品不具备动物实验所确认的保健功能。所以螺旋藻新食品的深加工研制应向营养(一次功能)、感官(二次功能)、生理调节功能(三次功能)皆备的第三代功能食品方向发展。加工螺旋藻食品时将腥味脱除是一重要任务，也是一大难点18 孙向军,姚晓敏,等.螺旋藻饮料脱腥工艺的探讨.食品研究与开发,2001,22(2):38-4018。有人认为形成藻腥味的主要成分为：吡啶类物质、胺类物质、萜类物质5，但也有人认为是藻蓝蛋白形成了螺旋藻的腥味。阳晖等19 阳晖,方遂,等.螺旋藻脱腥工艺的筛选.食品研究与开发,2009,30(7):106-11019曾用发酵法来脱腥，效果较好，但藻液呈现了淡黄色，可能是藻蓝素减少，说明藻蓝蛋白被破坏，也就失去了营养价值。孙向军等18曾尝试采用-环糊精包埋的办法来脱腥，取得较为理想的效果。环糊精(cyclodextrin，CD)是由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉而制得的一系列环聚糖的总称，1891年由Villiers发现。1904年，Schardinger确定了CD的结构， 并命名为环状低聚糖20 董川,李俊芬.环糊精包合物的形成及光谱表征J.Chinese Journal ofSpectroscopy Laboratory,2004,4(9):56-58 20。环糊精的外形象一个内空去顶的圆锥体，腔内是非极性的，腔外有羟基，具有亲水性，这种特殊的分子洞结构，使得许多分子可在其空腔中被包结，形成主客体包结物。CD通常是由6-12个D-葡萄糖分子以1，4-糖苷键连接的环状低聚糖化合物，常见的有、-CD 3种，但-环糊精生产成本低，空腔尺寸适中，是最常用的一种。其内径为0.60-0.65nm，空腔高度为0.79nm，25时在水中的溶解度为18.5/100g 21 宋乐新.环糊精化学进展.苏州大学学报自然科学,1996,5(6):26-2721。-CD立体结构见图2。图2 -CD的立体结构示意图螺旋藻除了作为人类食品之外，还可作为动物优质精饲饵料。一方面，由于螺旋藻富含蛋白质，用以喂养鱼虾，可使鱼虾生长速度明显加快，而且繁殖能力及成活率也明显增强，这已为大量的试验所证实。另一方面，螺旋藻中较多的-胡萝卜素可能是某种以螺旋藻为主要食物的火烈鸟羽毛颜色形成的原因，因此，用其配制饵料、饲料，可使鱼、鸡等观赏动物光彩夺人。另外有试验表明，螺旋藻可在污水、发酵沼液或粪肥等配制的培养液中生长，通过吸收利用其中的碳源、氮源和其他矿质营养，可达到降低生产成本、防治环境污染等目的。还有资料报道，螺旋藻在黑暗和无氧条件下，能将光合作用积累的产物，通过降解过程和氢酸的作用释放出氢气，若把氢气收集起来，有可能作为能源氢源获取的新途径。最近几年，我国有部分省市将螺旋藻食品进行工厂化生产，但产量不大。我们认为，凭着我国辽阔的地域，丰富的自然资源，大范围、多渠道地开展螺旋藻的综合开发利用，其结果将可产生巨大的经济效益和社会效益。在国外，螺旋藻干品已渗入其它食物原料而制成巧克力、高蛋白奶酪、营养面包、精品蛋糕、馅心糖果和加餐汤料，而且还用于运动员的滋补食品。在我国螺旋藻的应用范围在不断扩大，其市场已由南方向北方，从沿海到内地边陲延伸16。目前螺旋藻加工成的食品主要有螺旋藻饼干、面包、面条、螺旋藻沱茶、凝胶双歧酸奶、乳酸菌冰激凌、固体饮料、液体饮料等。螺旋藻加工成饮料后，其有效成分含量比较大，而且作为液体更易被人体吸收，从而更能起到应有的作用。但目前在加工成饮料时多是向螺旋藻清汁中加入白砂糖、柠檬酸、香精等来调配，掩盖其腥味1，而且在杀菌后和储藏过程中，容易产生由蛋白变性沉淀引起的分层现象，严重影响产品的外观和内在品质，所以多数情况下要在饮料中加入稳定剂来减少沉淀的产生。也有人在清汁饮料制作过程中用木瓜蛋白酶来酶解蛋白质22 魏振承,张雁,等.螺旋藻清汁饮料工艺配方优化研究.广东农业科学,2006(11):94-9522，从而减少蛋白质的沉淀。当蛋白质被水解为小肽和游离氨基酸后，其吸收利用率将大为增加23 Boonvisut S. Effect of heat amylase and disulfide bond cleavage on the in vitro digestibility of soybean J.Agric.Food Chem,1997,24:1130-113723，有些生物活性肽是以非活性状态存在于蛋白质的氨基酸多肽链中的，这些活性肽一旦通过蛋白酶的作用被释放出来，就可能发挥出更多生物活性24 Guerard F,Dufosse L,Broise D L,et al. Enzymatichydrolysis of proteins from yellow fintuna (Thunnusalbacares) wastes using Alcalase J.Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2001,11:1051-105924，所以在加工螺旋藻汁时可以用木瓜蛋白酶处理破壁液，并研究使用适当的稳定剂以提高产品的稳定性和营养价值。螺旋藻在食品添加剂的开发方面也有着很重要的作用。藻蓝素广泛用于雪糕、香口胶、糖果和糕点等食品生产的着色上。从螺旋藻中提取的-胡萝卜素比化学合成的有许多优点，如顺式异体含量高达50%左右，而化学合成的顺式异体只占20%左右，它的生物和保健功能是化学合成的无法比拟的。为了提高螺旋藻生产-胡萝卜素的效率，科技人员还研究螺旋藻在培养过程中的营养，应用了各种反应器来提高其生产效率、降低成本15。螺旋藻作为营养最全面的食品，有着广阔的开发前景。1.3 本试验研究的目的、内容和意义在本实验中，我们选择自溶破壁、研磨破壁和冻融温差破壁，破壁后经离心测定上清液中蛋白质含量，得出蛋白质溶出率，来衡量破壁效果。采用-环糊精、加热以及二者交互作用对螺旋藻汁脱腥，用感官评价来衡量脱腥效果。另外，我们要研究pH、加热温度及时间对蛋白质稳定性的影响。通过本实验，我们旨在提出较好的螺旋藻破壁、脱腥方法以及确定蛋白质稳定条件。本实验的研究结果对螺旋藻汁的加工有一定的指导意义。2 材料与方法2.1 材料、试剂及仪器2.1.1 材料及试剂极大螺旋藻山东省无棣县德大农业有限公司盐酸淄博化学试剂厂有限公司分析纯硼酸天津凯通化学试剂有限公司分析纯硫酸莱阳市康德化工有限公司分析纯硫酸钾天津市百世化工有限公司分析纯硫酸铜天津巴斯夫化工有限公司分析纯石英砂天津市科密欧化学试剂开发中心分析纯-环状糊精上海山浦化工有限公司氢氧化钠（粒）天津市永大化学试剂开发中心分析纯2.1.2 仪器及设备冰箱合肥美菱股份有限公司BCD-249CF定氮仪上海瑞正仪器设备有限公司KDY-08C消化炉上海瑞正仪器设备有限公司KDY-12C电子天平上海精天电子仪器有限公司JA1003A数显恒温水浴锅国华电器有限公司HH-2紫外可见分光光度计岛津公司UV24502.2 螺旋藻的破壁2.2.1 自溶称取5.0g螺旋藻干粉置于烧杯中，加入100ml水，搅拌均匀后立即取10ml悬液于3000r/min离心15min，取上清液适当稀释后测蛋白质含量。此后，每5min搅拌一次，每隔1h取10ml悬液离心(3000r/min，15min)，分别测上清液中蛋白质含量。2.2.2 研磨法 石英砂用量的确定称取2.5g螺旋藻干粉放入研钵内，加入40%石英砂，以相同力度顺时针研磨300圈，后加入50ml水，搅拌均匀后立即取10ml悬液于3000r/min离心15min，取上清液适当稀释后测定蛋白质含量。将石英砂的量改为50%、60%、70%，其余操作同上。 研磨力度的确定称取2.5g螺旋藻干粉放入研钵内，加入60%石英砂，以相同力度顺时针研磨400圈，后加入50ml水，搅拌均匀后立即取10ml悬液于3000r/min离心15min，取上清液适当稀释后测定蛋白质含量。逐渐增加研磨力度，分别至500圈、600圈、700圈，其余操作同上。2.2.3 冻融温差法向五支试管中分别加入0.5g螺旋藻干粉，各加入10ml水，搅拌均匀，竖直放入冰箱在-20冷冻2h，后取出在25下融化，再次冷冻。冻融3次后取出一支试管，将悬液离心（3000r/min，15min），取上清液适当稀释后测定蛋白质含量。按照此步骤，在冻融4、5、6次时分别取出一支试管进行上述操作。2.3 螺旋藻汁的脱腥2.3.1 螺旋藻清液制备称取5g螺旋藻干粉置于烧杯中，加入100ml水，根据上述破壁试验结果，采取能产生较好效果的方法对其进行破壁处理，后将悬液离心（3000r/min，15min），测其蛋白质含量为40%，备用。2.3.2 脱腥处理 加热法取离心液5ml加入四支试管中，分别在20、30、40、50条件下加热30min，感官评价脱腥效果。 -环状糊精脱腥取离心液5ml加入五支试管中，分别加入1%、2%、3%、4%、5%的-环状糊精，振荡，放置30min后，感官评价脱腥效果。 -环状糊精与加热法交互试验脱腥取9个试管，分别装入5ml螺旋藻离心液，分别以-环状糊精添加量、加热温度、加热时间3个因素，按L9（34）正交表进行试验。2.4 蛋白质稳定性研究称取5g螺旋藻干粉置于烧杯中，加入100ml水，根据上述破壁试验结果，采取能产生较好效果的方法对其进行破壁处理，离心（3000r/min，15min），取上清液，测定蛋白质含量为42%，备用。2.4.1 pH对蛋白质稳定性影响分别取10ml离心液置于4只小烧杯中，用NaOH溶液或HCl溶液调pH至不同值，静置10min,然后取适量上清液测定蛋白质含量。2.4.2 温度和加热时间对蛋白质稳定性影响分别取5ml离心液置于9支试管中，在不同温度下加热不同时间，冷却后取适量上清液测定蛋白质含量。2.5 评定及分析方法2.5.1 脱腥效果评价：感官评价选20人作为评价员，采用打分制。脱腥效果分值具体为：很浓腥味12.5，较浓腥味2.55，轻微腥味57.5，无腥味7.510。2.5.2 蛋白质的测定凯氏定氮法。2.5.3 藻蓝蛋白浓度测定吸光光度法。2.6 计算方法 蛋白质溶出率=100% 式中：上清液中蛋白质含量；藻粉中蛋白质含量，60%。 c(PC)25 曲文娟,马海乐.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术J.食品科技, 2007(5):135- 138致谢本文是在张锦丽老师的精心指导下完成的，论文的选题、研究方案的确定以及最终的实施都凝聚了老师的心血。张老师严谨的治学态度给我留下了深刻的印象。在此，我对张老师表示衷心的感谢！在试验的进行和论文的写作过程中，还得到了食品学院其他老师们的精心指导和大力帮助，他们在研究方面严肃的科学态度，严谨的治学精神，在工作上精益求精的工作作风，深深地激励了我，使我受益匪浅。在此也向他们表示衷心的感谢！另外，感谢师哥师姐们对我的帮助和指导。最后，再次向所有给予我支持和帮助的老师、同学以及朋友们致以最诚挚的谢意!25= 式中：c（PC）藻蓝蛋白的质量浓度，mg/ml； 藻蓝蛋白的特征吸光值； 别藻蓝蛋白的特征吸光值。 藻蓝蛋白溶出率=100%式中：c上清液中藻蓝蛋白浓度，mg/ml； V上清液体积，ml； n稀释倍数； m所取藻粉质量。3 结果与讨论3.1 破壁结果 3.1.1 自溶破壁由于螺旋藻细胞中营养成分含量较大，藻粉浸在水中后细胞内外形成很大的渗透压差，细胞会吸水膨胀，自行破裂。在自溶0h、1h、2h、3h时分别测定上清液中蛋白质溶出率及藻蓝蛋白溶出率，结果如图3、图4所示。 图3 自溶破壁过程中蛋白质溶出率变化 图4 自溶破壁过程中藻蓝蛋白溶出率变化 由图3、图4可知，随着溶解时间的延长，藻蓝蛋白溶出率及蛋白质溶出率逐渐增加，但在1h后增加缓慢。可能是由于自溶过程中细胞外渗透压迅速增大导致渗透压差减小，吸水能力下降所致。3.1.2 研磨破壁研磨法是通过剪切力使螺旋藻细胞壁破坏，添加不同用量的石英砂研磨，经离心后分别测定所得上清液中蛋白溶出率及藻蓝蛋白溶出率，结果如图5、图6所示。 图5 不同石英砂用量对蛋白质 图6 不同石英砂用量对藻蓝蛋白溶出率的影响 溶出率的影响由图5、图6可知，研磨时，在石英砂用量小于60%范围内，随着石英砂量的增大，蛋白溶出率也迅速增大，说明破壁效果在逐渐增强。当石英砂量大于60%后，破壁效果增强不显著。经不同力度研磨后测定上清液中蛋白质溶出率及藻蓝蛋白溶出率，结果如图7、图8所示。图7 不同力度研磨对蛋白质 图8 不同力度研磨对藻蓝蛋白溶出率影响 溶出率影响由图7、图8可知，随着研磨力度的增大，蛋白质溶出率增大，说明增大研磨力度也可显著增强破壁效果。3.1.3 冻融温差破壁冻融法破碎细胞主要是因为藻体在冻结过程中，细胞内外的液态水形成冰晶体，造成体积膨大，对藻体细胞壁和细胞膜产生破坏作用，使其通透性加大，内容物流出。藻体冻结过程中首先是从最容易生成细小冰晶体的地方开始，然后冰晶体逐渐变大，向四周扩展，将距这些地方比较近的细胞壁和细胞膜胀破，压破。在冻融3、4、5、6次后经离心分别测定上清液中蛋白溶出率及藻蓝蛋白溶出率，结果如图9、图10所示。 图9 冻融次数对蛋白质溶出率影响 图10 冻融次数对藻蓝蛋白溶出率影响由图9、图10可知，冻融温差法处理第4次之后蛋白质溶出率才出现明显增长，而且增长幅度较大。3.2 脱腥结果3.2.1 加热法脱腥螺旋藻汁在20、30、40、50下加热后，我们对其进行感官评价并打分，结果见下表。表1 加热法脱腥结果温度/20304050感官评分1.57.546由表1可知，在30时加热脱腥效果很明显。可能是由于某些腥味物质在此温度下失活或是与其他物质发生反应，从而使腥味变淡，然而当温度上升时腥味反而增重,可能是由于某些物质发生反应使体系pH改变，进而其他物质反应产生异味。3.2.2 -环状糊精脱腥在螺旋藻汁中分别添加1%、2%、3%、4%、5%的-环状糊精进行脱腥处理后，进行感官评价，结果如见下表。表2 -环状糊精脱腥结果-环状糊精用量/%12345感官评分235.567由表2所知，当-环状糊精的添加量为4%时，脱腥效果最好，但是感官评分不是特别高，可能是因为-环状糊精不能包埋所有腥味物质。3.2.3 -环状糊精与加热法交互试验脱腥-环状糊精与加热交互作用对螺旋藻汁进行处理，其因素水平如表3所示。表3 -环状糊精与加热混合脱腥正交试验因素水平表水平A -环状糊精添加量/%B 加热温度/C 加热时间/min13.5302024403034.55040-环状糊精与加热交互作用对螺旋藻汁脱腥的正交试验结果如表4所示。表4 -环状糊精与加热混合脱腥正交试验结果实验号因素感官评价分数ABC空列(-环状糊精添加量)(加热温度)(加热时间)11（3.5%）1（30）1（20）11.521（3.5%）2（40）2（30）23.031（3.5%）3（50）3（40）33.542（4%）1（30）2（30）32.052（4%）2（40）3（40）16.062（4%）3（50）1（20）24.073（4.5%）1（30）3（40）27.083（4.5%）2（40）1（20）38.093（4.5%）3（50）2（30）17.5K18.010.513.515.0K212.017.012.514.0K322.515.016.513.52.73.54.55.04.05.74.24.77.55.05.54.5R4.82.21.30.5对实验中3个因素进行直观分析，作出因素指标关系图，如下所示。图12 因素与指标关系图由关系图可知，3个因素间主次关系为ABC，即-环状糊精用量加热温度加热时间。对上述实验结果进行方差分析，结果如下表。表5 实验结果方差分析变异来源SSdfMSFPA因素37.3889218.694496.14290.0103B因素7.388923.694419.00000.0500C因素2.888921.44447.42860.1186根据上述方差分析的结果，-环糊精用量有显著性差异，加热温度有差异，加热时间无显著性差异。对3个因素进行多重比较，最终选择脱腥条件为A3B2C1，即最终选择添加4.5%的-环糊精，加热温度40，加热时间20min。3.3 螺旋藻蛋白质稳定性研究结果3.3.1 pH对蛋白质稳定性影响备用螺旋藻破壁液中蛋白质含量为42%，用酸碱溶液将螺旋藻汁的pH分别调至6、7、8、9，后测定溶液中蛋白质含量，从而得出蛋白质损失率。图13 pH对蛋白质稳定性影响由图13可知，在实验中的四个pH值中，螺旋藻中的蛋白质在pH为8时损失率最小，最稳定。3.3.2 温度和加热时间对蛋白质稳定性影响备用螺旋藻破壁液中蛋白质含量为42%，将溶液分别在30、40、50条件下加热30min、60min、90min，后测定溶液中蛋白含量，得出蛋白质损失率。表6 加热温度和时间对蛋白稳定性影响温度/时间/min溶液中蛋白含量/%蛋白损失率/%3038.378.65306037.1811.489035.4015.723036.5912.89406039.565.829035.0416.573028.3932.41506032.4322.799014.6165.21由表6可知，当处理条件为40加热60min时，蛋白质最稳定，损失率最小。4 结论在三种破壁方法中，冻融温差法效果较好，其中在冻融6次时效果最好，藻蓝蛋白溶出率为9.01%，蛋白质溶出率为42.05%。在试验的脱腥方法中，加热与-环状糊精交互脱腥效果较好，当添加4.5%的-环状糊精，并在40加热20min时，腥味最淡，感官评分为8分。在蛋白质稳定性试验的四个pH中，当pH为8时最稳定，损失率为6.16%；当螺旋藻汁在40下加热60min时最稳定，损失率为5.82%。参考文献袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄