丝氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造和ppt课件.ppt

产L 丝氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造和代谢流分析 1 L 丝氨酸 L 丝氨酸在生物体生理和代谢过程中具有不可替代的作用 1 它可以为哺乳动物中枢神经系统的生长和发育提供营养2 它还是胞内多种重要生物物质合成所需的一碳单位 C1units 的直接供体 参与氨基酸 嘌呤 嘧啶 磷脂等的合成 2 本研究采用系统代谢工程策略 构建了基因工程菌CorynebacteriumglutamicumSER 8 连续补料发酵实验显示 SER 8的比生长速率降低 L 丝氨酸的积累量在不同的生长时期呈现变化 代谢流分析证明 过表达3 磷酸甘油酸激酶使糖酵解途径和三羧酸循环增强 过表达脱敏型3 磷酸甘油酸脱氢酶加强了L 丝氨酸合成途径 敲除激活蛋白GlyR部分减弱了L 丝氨酸向甘氨酸的转化 代谢流比率仍有38 2 3 首先 糖酵解的代谢中间产物3 磷酸甘油酸在3 磷酸甘油酸脱氢酶 PGDH serA编码 的作用下氧化为3 磷酸羟基丙酮酸 然后在转氨酶 PSAT serC编码 的作用下3 磷酸羟基丙酮酸与谷氨酸之间进行氨基的转移 形成3 磷酸丝氨酸 最后在磷酸丝氨酸磷酸酶 PSP serB编码 的作用下3 磷酸丝氨酸水解生成L 丝氨酸 L 丝氨酸在C glutamicum中通过磷酸化途径合成过程 4 实验过程 1 质粒和菌株构建2 摇瓶和发酵罐发酵3 胞内代谢物测定 样品预处理 淬取和抽提4 分析 5 基因敲除 使用含sacB反筛标记的自杀载体进行基因组上目的基因的无痕敲除 2 基因过表达 为增加L 丝氨酸合成的体供应量 构建了分别含有pgk和serAr的单基因表达载体 6 种子摇瓶培养 将BHI斜面活化的菌体接入含有50mL种子培养基CGIII的三角瓶中 在30 200r min下振荡培养到对数生长期 菌体密度达到12 发酵摇瓶培养 接种量为1mL 500mL挡板三角瓶装液量为30mL 添加2 碳酸钙 发酵在30 120r min下培养72h 补加浓氨水调节发酵液的pH在7 0 7 2之间 7 5L罐发酵培养 接种量为3 装液量为2L 温度控制在30 自动流加浓氨水控制pH在7 2 溶氧维持在30 以上 初始葡萄糖为20g L 当残糖低于10g L时 流加400g L的葡萄糖 发酵连续进行60h 当A600 2时 加入0 8mmol LIPTG诱导重组质粒携带的基因表达 7 7 5L发酵罐发酵培养至菌体生长的对数生长期中期抽取5mL发酵液 注入20mL淬取剂中 60 甲醇 70mmol LHepes 80 预冷 于20 5200 g离心10min 倒掉上清 菌体保存 80 采用高温煮沸释放内含物的方法抽提胞内代谢物 将菌体在90 加热5min 连续进行3次抽提 抽提后放置室温 用真空泵风干 加入500 L无菌蒸馏水溶解内含物 5500 g离心10min 上清保存于 80 为了减少菌株SER 8与对照SER 0之间取样的差异提高数据准确度 选用在CGX基本培养基 初始葡萄糖浓度为40g L的批次发酵的样品进行胞内代谢物的测定 8 生物量测定 葡萄糖浓度测定 L 丝氨酸含量测定 9 结果讨论 本实验结果显示敲除激活蛋白GlyR 在一定程度上可以降低L 丝氨酸转化为甘氨酸 但该通路代谢流比率分配仍有38 2 进一步印证了SHMT催化的L 丝氨酸转化为甘氨酸是限制L 丝氨酸积累的关键节点 本研究进一步证明增加前体物供给有助于提高L 丝氨酸的生物合成 本实验结果表明胞内L 丝氨酸的代谢对维持C glutamicum的生长至关重要 10 展望 本研究结果不仅为未来L 丝氨酸代谢工程改造提供了新的