卵黄抗体在水产中的应用.doc

精品文档卵黄抗体在水产上的使用状况卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白（IgY），一般以鸡作为供体，经一种或多种特定抗原免疫诱导后在卵黄中蓄积，机体所产生的特异性抗体，具有类似哺乳动物IgG的免疫活性，可有效防治特定疾病。近年来，在畜禽疾病的诊断与防治方面卵黄抗体的运用已非常广泛，可将其作为抗生素替代品或饲料添加剂等进行使用，在动物养殖业中具有广阔的应用前景。目前，用卵黄抗体防治水产动物疾病的研究报道较少，但因其具有疗效确切、使用安全、无毒副作用、制备工艺简单、生产成本低等优点，使得以其防治水产动物疾病逐渐受到重视。1. IgY的发展以及研究状况1893年，著名德国医生莱比锡通过免疫蛋鸡的试验发现其所产鸡蛋的蛋黄中具有能中和免疫原的特异性蛋白质，即卵黄抗体IgY。自此，各国学者相继对其分子结构、理化性质、制备工艺、检测方法及应用等领域进行了广泛而深入的研究。20世纪80年代以来，归因于商品试剂的推广，IgY抗体开始进入商品应用。1996年，IgY抗体的生产和应用被定义为IgY技术。如今，它己是一个世界性的标准化技术。1996年，欧洲实验方法替换确认中心推荐使用IgY来代替哺乳动物IgG，以减少由于抗体采集而造成对动物的伤害。1999年，基于对动物权益的保护，IgY技术被瑞士联邦政府兽医办公室接受为可行的替代办法。美国的FDA己将特异性卵黄免疫球蛋白视为替代抗生素的首要候选药物，日本政府投入巨资扶持“禽源抗体产业”。美国、韩国、台湾等发达国家和地区利用卵黄抗体成功研制了各种功能性食品、饲料添加剂和防制动物疫病的生物制品。目前，在人类医学、动物医学、动物科学和其他诸多生命科学领域，有关卵黄抗体产品的研发与应用呈逐年上升趋势，尤其是卵黄抗体代替抗生素在动物生产中的应用被广泛认可。2. IgY的理化性质IgY是一种7S免疫球蛋白，分子量约180kD，由两条重链(分子量67-70kDa)和两条轻链(分子量22-30kDa)组成，含氮量为14.8%。IgY的结构与哺乳动物的IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空间构象，也可与抗原结合。IgY的pH稳定性较好，在pH4.0-11.0时比较稳定，pH 3.0-3.5时活性迅速下降，pH 12.0时活性亦有所下降，在pH 12.0 时迅速失活。此外，IgY也具有良好的耐热能力。在低于75条件下，具有良好的热稳定性，高于80大部分IgY将失去活性。IgY制剂在4存贮5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，IgY对胃蛋白酶有较好的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。IgY具有耐巴氏消毒，而且耐反复冻融的特性。3. IgY的分离纯化鸡卵黄提供了一个大量的、廉价的、易纯化的抗体来源。一只蛋鸡每年可产200-300枚蛋，从一枚鸡蛋中可获得100-200 mg IgY。如何将大量的卵黄抗体提取出来，是决定IgY能否被广泛应用的一个重要前提。鸡卵黄中含有水48.0%、蛋白质17.8%和脂肪30.5%，其中几乎所有脂肪都与蛋白质相结合而以脂蛋白的形式存在。卵黄中不与脂肪结合的蛋白为水溶性蛋白，IgY则为水溶性蛋白，它以Y活性蛋白的形式与另外两种水溶性蛋白-活性蛋白(鸡血清蛋白)、活性蛋白以及其他各种脂蛋白一起存在于卵黄中。从卵黄中获得IgY的过程包括分离、提取、纯化。IgY分离纯化的原则是简便、高效、经济。目前常用的分离方法主要有：有机物沉淀法、有机溶剂抽提法、水稀释法、超临界气体提取法、去污剂分离法等（表1）。为了将IgY提取出来，主要通过超滤法或沉淀法来完成。沉淀法所用的沉淀剂可以是无机物、有机物或有机溶剂，也可以采用多种方法联合沉淀，或沉淀法和超滤法相结合提取。其中水稀释法最为简单和经济，利用卵黄抗体可溶于水的特性，除去不溶的脂蛋白。Akita等使用此法，每毫升卵黄中获得9.8mg的抗体，回收率达到了91%。有机物沉淀法使用的有机溶剂主要有PEG6000、硫酸葡聚糖等，有机溶剂如氯仿，生物制剂如角叉藻胶等也都能够较好地去除脂蛋白，获得卵黄抗体。为满足不同的使用目的，多数情况下需对提取得到的卵黄抗体进一步纯化，纯化时常用的方法有：凝胶层析、离子交换层析以及亲和层析。目前使用的提取、纯化方法各有优缺点：沉淀法简单、经济，但其提取的物质纯度低；亲和层析能得到高纯度的特异性卵黄抗体，但因产率低、费用高而不能得到大规模应用，仅适用于科研。从工艺路线上看，水稀释法具有工艺简便、生产成本较低、采用适当的方法进行纯化，产品纯度和回收率高等优点，比较适合大规模工业化生产。4. IgY的稳定性的保护对于幼龄动物，消化系统尚未发育完全，IgY可抵抗其消化酶的消化，故可将一定量的针对某些疾病的IgY添加到饲料或饮用水中，使幼龄动物获得被动免疫保护。对于成年动物，为了减少添加的IgY的损失，可采用一定的措施，如IgY的优化和设计。Shimizu等(1992)用蛋黄中提取的卵磷脂和胆固醇为壁材，用脱水-复水法对 IgY进行包埋制成脂质体，试验发现脂质体包埋的IgY在酸性条件下稳定性显著提高！在pH2.8条件下处理1h后，稳定性变化不大。此外，柠檬酸盐、磷酸盐、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖等对IgY的热稳定性均有一定保护作用。Li等(2009)研究了以壳聚糖-海藻酸钠微囊为载体对卵黄抗体的口服保护效果。5. IgY在水产上的应用5.1 IgY在细菌性水产疾病中的应用在126种病害中，细菌性疾病有61种，约占48%。水产养殖细菌性疾病主要有弧菌病、爱德华氏菌病、出血病、烂鳃病、赤皮病、腐皮病、腹水病、细菌性败血症和细菌性肾病等。引起这些疾病的病原主要有：鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、鳗败血假单胞菌和鲑鱼肾杆菌等。目前，使用卵黄抗体技术防治水产动物细菌性疾病已有诸多研究报道且防治效果良好（见表1）。表1卵黄抗体在细菌性水产疾病中的应用物种疾病病原菌效果鲍鱼弧菌病溶藻弧菌饲喂提高存活率75%对虾弧菌病鳗弧菌口服后死亡率15%，低于对照组的60%虹鳟鲁氏耶尔森氏菌病鲁氏耶尔森氏菌饲喂后死亡率13%，低于对照组的40%虹鳟弧菌病鳗弧菌注射后死亡率最低11%，低于对照组的71%大菱鲆迟缓爱德华氏菌病迟缓爱德华氏菌口服后免疫保护率100%鳗鲡迟缓爱德华氏菌病迟缓爱德华氏菌口服后死亡率显著降低鳗鲡嗜水气单胞菌病嗜水气单胞菌投喂后存活率77.8%，高于对照组的44.4%银鲫嗜水气单胞菌病嗜水气单胞菌注射组的保护率为60%，对照组全部死亡银鲫败血症嗜水气单胞菌浸浴治疗组死亡率仅30%，低于对照组的80%锦鲤溃烂病杀鲑气单胞菌卵黄抗体组预防了溃烂病发作，保护率100%香鱼鳗利斯顿氏菌病鳗利斯顿氏菌灌胃后存活率80%，高于对照组的15%中华鳖嗜水气单胞菌病嗜水气单胞菌浸泡组存活率75%，口服组65%，对照组30%中华鳖出血性败血症嗜水气单胞菌饲喂组死亡率比对照组降低66.7%棘胸蛙红腿病嗜水气单胞菌卵黄抗体组保护率达100%5.2 IgY在病毒性水产疾病中的应用白斑综合症病毒是一种传播速度快，传染范围广的强感染力病毒，使对虾养殖业经济受损严重。雷勇等用提纯的白斑综合征病毒( WSSV) 接种蛋鸡后制备卵黄干粉，将其按照0.1%和0.2%比例添加到螯虾的基础饲料中，连续投喂7d后进行攻毒试验，攻毒后恢复相应的饲料投喂。结果表明: 低剂量组在攻毒后螯虾死亡率虽然达到100%，但死亡时间得到延迟；而高剂量对螯虾有明显的保护作用，使其死亡率不到30%。5.3 IgY在水产品保鲜中的应用Xu等制备冷藏牙鲆的特定腐败菌腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌的特异性卵黄抗体。在4条件下，将试验组鱼片浸于100mg/mL的特异性卵黄抗体溶液中后无菌包装，4冷藏，每3d取样进行微生物分析、化学分析和感官评定。结果表明，特异性卵黄抗体处理后，试验组鱼片的细菌总数明显降低；货架期从89d延长至1215d；化学分析结果证明，挥发性盐基氮值和硫代巴比妥酸值均明显低于对照组；感官评定中，评分低于4分（判定为不新鲜）的时间!也延长了36d。微生物、化学及感官指标保持很好的一致性。5.4 IgY在水产寄生虫诊断中的应用Young等制备了抗太平洋鲑鱼微孢子虫的特异性卵黄抗体。间接免疫荧光抗体试验结果显示，检测固定化的Loma salmonae孢子，有特异性荧光反应。免疫组化试验结果显示L. salmonae孢子孢子在鲑鱼各组织中染色程度强，最早可在接触感染4周后，在鳃和心脏感染组织切片中，检测出生长阶段的寄生虫寄主复合体。交叉反应试验中，卵黄抗体与其他微孢子虫如Pseudoloma neurophilia 和Glugea anomala无交叉反应，表明其具有良好的特异性，适于其他水产动物的病原诊断。6. IgY在水产上的应用方式用卵黄抗体控制水产动物疾病的方式主要有注射、口服和浸浴。理论上认为，注射方式效果最为直接，血清中的抗体水平更高。用腹腔注射、口服和加入饲料中等方式研究抗鳗弧菌特异性卵黄抗体对虹鳟的被动免疫保护作用发现，这3种方式均能明显提高虹鳟的抗病能力，其中注射效果最好，死亡率明显低于口服组和饲喂组。卵黄抗体的使用方式不同，保护效果也不同。饲喂方式延长了卵黄抗体在胃酸和消化酶环境中的时间使卵黄抗体极容易被破坏，影响了其免疫保护效果。但是，注射对鱼体刺激较大，腹腔注射卵黄抗体很容易引起鱼体的免疫应答，使其产生相应抗体与之结合，调动其他免疫机制清除进入鱼体的卵黄抗体。口服特异性卵黄抗体，能够直接有效地抑制肠道病原菌的黏附、聚集和增殖，调节肠道菌群平衡。卵黄抗体使用方式不同、保护效果不同，其原因可能是不同病原菌对鱼的感染方式不同。7. 问题与展望卵黄抗体高效、低成本、收集抗体无需采血符合动物权益，且对环境友好，无毒副作用，无残留，作为抗生素类药物和化学保鲜剂的替代品，在水产疾病防治、水产保鲜及病害诊断中具有巨大学术意义和应用价值!虽然卵黄抗体有很多优点，但是目前生产的卵黄抗体也存在着一定的缺