猴头菇菌丝体和发酵液中多糖的含量测定.doc

猴头菇菌丝体和发酵液中多糖的含量测定刘晓明1，闫云宇2，毕华3(1，3河北省食品药品检验院，2河北省医科大学第三医院，石家庄市 050000)猴头菌Hericium erinaceus( Bull. Ex Fr.)又名猬菌、刺猬菌、小刺猴头、猴菇、猴头菇，隶属于担子菌门, 齿菌科1，是著名的药食两用菌。猴头菇, 味甘，性平, 归脾、胃经。猴头菇多糖是猴头菌的主要活性成分之一, 具有免疫调节、 抗肿瘤、 抗衰老、 降血脂、 降血糖、 抗突变、 防辐射等作用2。猴头菇多糖制成的药物和保健品深受人们喜爱，开发前景广阔。目前，通过猴头菇子实体提取猴头菇多糖的方法研究较多，但猴头菇子实体的生长周期相对较长，本文研究的是发酵的方法获得的多糖，具有生长周期短，提取多糖速度快的特点。因此，液体深层发酵是开发猴头菇活性成分的有效手段。但是在发酵获得多糖的方法中，采用菌丝体提取多糖的研究较多，而积极利用发酵液提取多糖的方法较少报道，本实验通过对猴头菇菌丝体和发酵液提取的多糖含量进行比较，把发酵液也积极的利用起来，为猴头菇多糖更好的开发利用打下基础。1 仪器与试药紫外可见分光光度仪GBC Cintra 10（澳大利亚GBC公司），高效液相（美国Waters公司），旋涡混合振荡器(江苏海门其林医用仪器厂)，恒温水浴锅(北京靖卫科学仪器厂)。D无水葡萄糖（中国药品生物制品检定所），蒽酮（北京金龙化学试剂有限公司），浓硫酸、95%乙醇、氯仿均为分析纯，猴头菇菌种为本实验室保存。2 方法与结果2.1 多糖的提取与精制：2.1.1 猴头菇菌丝体的多糖提取3：取猴头菇成熟的菌丝体粉末20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批各5g，加入20倍的水在80水浴中提取3小时，5 000 r/min离心10 分钟2，取上清液。60下减压浓缩至30ml，过滤，滤液离心，取上清液，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇、丙酮洗涤，置干燥箱中60干燥，得粗多糖。2.1.2猴头菇菌丝体发酵液的多糖提取：取猴头菇成熟的菌丝体发酵液20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批，过滤，滤液离心，取上清液1000ml。60下减压浓缩至300ml，过滤，滤液离心，取上清液，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇、丙酮洗涤，置干燥箱中60干燥，得粗多糖。2.2 溶液的制备2.2.1 葡萄糖对照品溶液的配制：精密称取105干燥至恒重葡萄糖标准品25mg用蒸馏水定容于50ml容量瓶中，制成浓度为0.5mgmL-1的对照品溶液，备用。2.2.2 蒽酮硫酸溶液的配制：取98%硫酸和蒸馏水适量，配制成72%硫酸液，精密称取蒽酮适量，用72%的硫酸溶液配制成含蒽酮0.1%的蒽酮硫酸溶液。2.3 吸收波长选择：取对照品适量配制成浓度为30mgmL-1的溶液。再取样品猴头菇多糖适量配制成浓度约为30mgmL-1的溶液。对照品、样品溶液各取1ml分别加入4ml 0.1%蒽酮硫酸液，摇匀，置沸水中煮沸10分钟，取出迅速放冷，在黑暗中放置10分钟。显色后将葡萄糖对照品、猴头菇多糖样品在紫外分光光度仪中分别在450750nm波长范围内扫描，结果猴头菇多糖样品和葡萄糖对照品最大吸收波长分别在625.2nm和625.8nm，故选定625+1nm为测定波长。2.4 标准曲线的制备：精密称取葡萄糖对照品配成0.5mgmL-1的溶液，从中分别吸取0ml（空白），0.4ml，0.8ml，1.2ml，1.6ml,2.0ml置于10ml容量瓶中用蒸馏水定溶至刻度，配制成浓度为0mgmL-1,20mgmL-1，40mgmL-1，60mgmL-1，80mgmL-1, 100mgmL-1的溶液，作3组与此同样的平行样品。精密吸取每组中各个浓度对照品溶液1ml分别置于试管中，照2.3项下显色方法显色，在625nm波长处测定吸光度值，计算得回归方程：y=0.007x-0.0133,R20.999。结果表明，葡萄糖液在20100mgmL-1与吸光度值呈良好的线性关系。根据测定结果计算标准曲线方程。本方法适用于测定浓度在20100mgmL-1的猴头菇多糖。2.5 精密度试验：精密称取0. 1572g样品，定容于100ml容量瓶中，待溶解完全后，精密量取1ml定溶于10ml容量瓶中，再取1ml于试管中，共配制5份同样的稀释液，按标准曲线项下操作。结果RSD为0.13%（n=5），表明精密度良好。2.6 稳定性实验：取同一份供试品（A）和对照品（B）溶液，按标准曲线项下操作，进行紫外测定。每隔15分钟测定一次紫外吸收值，样品的RSD值为0.74%（n=8）,对照品的RSD值为0.50%（n=8）。由实验结果可知，此方法在2小时内稳定可行，超过2小时后样品和对照品均有较大变化，因此本实验在进行含量测定时，应该在2小时内完成。2.7 回收率实验：取猴头菇多糖的干燥粉末，精密加入葡萄糖对照品适量，照2.4项下方法操作，计算回收率。结果平均回收率为96.0%，RSD为1.12（n=6）。表1 猴头菇多糖加样回收率实验结果（n=6）Tab 1 The recoveries of Polysaccharide form Hericium erinaceus (n=6)样 品（mgmL-1）对照品（mgmL-1）测得多糖含量（mgmL-1）回收率（%）平均回收率（%）35.3340.0073.9996.6535.3340.0074.0296.7235.3340.0074.6898.3897.1235.3340.0074.7698.5835.3340.0073.7496.0235.3340.0073.8996.402.8 猴头菇多糖样品溶液的含量测定精密称取20100505、20100506、20100507、20100508、20100509批猴头菇菌丝体提取的粗多糖和猴头菇菌丝体发酵液提取的粗多糖约0.16g用蒸馏水定溶于100ml，精密量取1ml该溶液分别稀释至10ml，将稀释液分别按2.4项下操作测定吸光度。含量测定得样品中多糖含量见下表。表2 样品含量测定结果（%，n=3）Tab 2 Results of content determination of samples （%，n=3）样品批号猴头菇菌丝体猴头菇发酵液含量均值(%) RSD含量均值(%) RSD2010050539.7 1.537.2 1.72010050638.2 1.937.4 1.02010050738.5 1.5 36.5 1.52010050838.7 1.2 36.6 1.32010050937.9 1.8 36.4 1.6目前对猴头菇菌丝体提取多糖的报道较多，而对其发酵液的多糖提取及利用较少。实验中我们采用蒽酮硫酸比色法分别对猴头菇菌丝体和发酵液提取的粗多糖进行含量测定。结果表明两者提取的粗多糖含量相差较小，均在30%以上，因此通过发酵生产猴头菇多糖时，菌丝体和发酵液均可获得可利用的多糖。积极利用起发酵液提取粗多糖，可以有效的提高猴头菇粗多糖的产量，从而更好的开发其产品。参考文献1国家中医药管理局中华本草编委会，中华本草M.上海:上海科学技术出版社，1999:1522-5242胡斌杰,师兆忠. 超声法提取猴头菇多糖最佳工艺优化研究J.化学世界.2009,9：5573吴志明，李公斌，新秀兰，刘玮.猴头菇多糖的提取工艺J.食品研究与开发，2011,32(7):36（2）摘 要 目的：分别测定猴头菇菌丝体、猴头菇发酵液提取的粗多糖中的多糖含量。方法：采用蒽酮-硫酸比色法，利用紫外分光光度计测定多糖含量，样品与对照品分别在450750nm波长范围内扫描。最大吸收波长为625+1nm，猴头菇多糖检测浓度在20100mgmL-1（R2=0.999）范围内与吸光度线性关系良好；加样回收率为96.0%。结论：猴头菇菌丝体与发酵液提取的粗多糖中多糖含量均能达到30%以上。关键词 猴头菇 多糖 含量测定LIU Xiao-ming1,YAN Yun-yu2,BI Hua3(1,3 Hebei Institute for Food and Drug Control,2 Third Hospital Hebei Medical University Shijiazhuang 050000,China)Content Determination of Polysaccharide form Hericium erinaceus in mycelium and Fermentation Broth.ABSTRACT OBJECTIVE：Content Determination of crude Polysaccharide form Hericium erinaceus from mycelium and Fermentation Broth. METHODS：Determination of Polysaccharide by Anthrone-sulphuric Acid colrimetry, the sample and the control was scanning, respectively in 450750nm. maximum absorption wavelength at 625+1nm, The linear ranges of Polysaccharide form Hericium erinaceus were in the range of 20100mgmL-1（R2=0.999），The recoveries of active ingredients were 96.0%. CONCLUSION：Determination of crude Polysaccharide form Hericium erinaceus in mycelium and Fermentation Broth reached top of 30%.KEY WORDS Hericium erinaceus(