环糊精通过巨噬细胞的重组促进动脉粥样硬化的消退.doc

环糊精通过巨噬细胞的重组促进动脉粥样硬化的消退Sebastian Zimmer，Alena Grebe，Siril S. Bakke，Niklas Bode，BenteHalvorsen，Thomas Ulas，Mona Skjelland，Dominic De Nardo，Larisa I. Labzin，Anja Kerksiek，Chris Hempel，Michael T. Heneka，Victoria Hawxhurst，Michael L. Fitzgerald，Jonel Trebicka，Ingemar Bjrkhem，Jan-ke Gustafsson，Marit Westerterp，Alan R. Tall，Samuel D. Wright，Terje Espevik，Joachim L. Schultze，Georg Nickenig，Dieter Ltjohann，和Eicke Latz/content/8/333/333ra50Science Translational Medicine06 Apr 2016:Vol. 8, Issue 333, pp. 333ra50DOI: 10.1126/scitranslmed.aad6100qinglanhe 译动脉粥样硬化，是一种与血液胆固醇浓度升高有关联的炎症性疾病。尽管动脉粥样硬化的预防和治疗正在不断地取得进展，心血管疾病仍然是全世界人类死亡最重要的原因。血管的内皮下空间中，含有脂蛋白的载脂蛋白B的持续滞留，导致游离胆固醇的过多存在。因为，胆固醇的积累和晶体胆固醇（CCs）的沉积，触发了一种复杂的炎症反应，所以，我们测试了环状低聚糖2-羟丙基-环糊精（CD）的效能，CD是一种在预防和消退动脉粥样硬化中提高胆固醇溶解性的化合物。我们的研究表明，即使是在持续给予高胆固醇饮食的情况下，小鼠动脉粥样硬化经CD治疗，减少了动脉粥样硬化斑块的体积和CC的负载量，并促进了斑块的消退。其机制，CD提高了巨噬细胞和人动脉粥样硬化斑块二者中的氧化胆固醇产量，和促进了肝X受体（LXR）介导的转录重组，改善了胆固醇的外排和起到抗炎作用。活体内，这种CD介导的LXR激动作用，对CD的抗动脉粥样硬化和抗炎症作用，以及增强胆固醇的逆向输送，是需要的。由于CD用于人类疾病的治疗是安全的，以及CD对动脉粥样硬化具有有益影响的关键机制，所以，它可能在临床上用于预防或治疗人类的动脉粥样硬化。引言动脉粥样硬化是一种基础性病变，它引起心脏病发作、卒中和外周血管疾病。总的来说，这些疾病代表着一个常见健康问题，而当前的治疗不足以充分地降低疾病发展的风险。高胆固醇浓度的药理性下降（1-3），是降低发生心血管疾病和卒中风险最成功的疗法，但低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度的充分降低在所有患者中是不可能的。动脉粥样硬化是以动脉壁重构为特征的，它是由不同类型的脂质在血管内皮下层滞留和累积开始的。血管壁中的脂类沉积和胆固醇晶体（CCs）的显现，导致血管壁中炎性反应而发生病理改变。系统性炎症增强的患者，其心血管疾病死亡的风险提高，所以，正在进行着一些测试抗炎治疗是否可降低心血管事件发生率的研究。CCs是由动脉粥样硬化病变中胆固醇过多沉积所形成的，是动脉粥样硬化发生期中促炎性反应的触发剂。CCs可触发补体激活和嗜中性粒细胞细胞外诱捕（网）的形成，以及诱导固有免疫通路（4,5,8-10）。因此，治疗策略的目的在于预防胆固醇相变或消除CCs，以降低组织炎症程度和疾病进展速度。用基因方法来提高巨噬细胞移除动脉粥样硬化病变中游离胆固醇的能力，已证明在一些临床前的试验中获得了高度的成功。这促使我们测试药物是否可以提高胆固醇的溶解性、清除和分解代谢，而利用于动脉粥样硬化的预防或治疗。2-羟丙基-环糊精（CD）是美国食品药品管理局（FDA）批准在人体中用于溶解和包载递送尤其是治疗性的亲脂性药物（12-13）。虽然，以前曾显示CD提高了胆固醇的溶解性，在体内促进泡沫细胞中胆固醇的清除，和启动抗炎机制（14-16），但CD是否在体内能发挥抗动脉粥样硬化的作用，仍然是未知的。这里，我们发现在小鼠模型中，经皮下给予CD极大地减少了动脉粥样硬化的形成，和诱导了已形成动脉粥样硬化的消退。 CD增强了CCs的溶解，减少了CCs在病变中的出现。此外，CD增强了胆固醇代谢和肝脏X受体（LXR）依赖的细胞重新编程，这导致了胆固醇更有效地逆向运输（RCT），和降低了促炎基因的表达。低密度脂蛋白受体（LDLR）缺陷小鼠中，CD的抗动脉粥样硬化作用，取决于所移植骨髓细胞中LXR的表达。这些研究表明，CD通过提高氧化型胆固醇产生、LXR依赖的细胞重新编程，来发挥抗动脉粥样硬化作用，而且所提供的临床前证据表明，CD可被开发作为人动脉粥样硬化有效的治疗药物。结果CD治疗动脉粥样硬化形成的病变 为了研究CD治疗小鼠动脉粥样硬化的效能，给载脂蛋白E（ApoE-/-）缺陷小鼠喂以高胆固醇日粮，同时皮下注射CD治疗或载体物作对照，历时8周。虽然，动脉粥样硬化的主要驱动物血浆胆固醇仍然不受影响（图.1A），不过，CD治疗鼠主动脉根部内极大地减少了动脉粥样硬化病变（图.1B）。此外，我们发现当用激光反射显微镜评估时，CD治疗小鼠动脉粥样硬化斑块中减少了大量的CCs（图.1，C和D）。CD不影响鼠的增重、血压、心率和骨髓细胞诱导或循环的scal/flk-阳性细胞的数量（图.S1,A-E）。此外，植物固醇、胆固烷醇和胆固醇前体的血浆浓度不受CD治疗的影响，这就间接地表明，CD不改变肠道胆固醇吸收和整体内源性生物合成（图.S1F）。CD也不改变斑块的相关成分，包括细胞结构和巨噬细胞含量（图.1，E和F）。然而，通过CD治疗，减少了主动脉反应的氧族（图.1G）和促炎细胞因子的血浆浓度（图.1，H-J），表明CD可以减少动脉粥样硬化形成期间的炎症反应。CD治疗促使动脉粥样硬化斑块的消退虽然，与西式饮食饲喂的同时，连续地给予药物治疗，是研究可能的抗动脉粥样硬化物质的标准程序，不过动脉粥样硬化形成早期阶段的患者一般未进行治疗。因此，我们测试了CD治疗消除动脉粥样硬化的效果。载脂蛋白E-/-小鼠即使以正常或减脂食物饲喂也是患高胆固醇血症的，因此，大多数小鼠动脉粥样硬化消退模型，是依赖于使血脂正常化干预策略的，例如，病毒基因的转移、移植、或高密度脂蛋白（HDL）颗粒的输注。我们对载脂蛋白E-/-小鼠采用了较少侵入性的消退方案，首先，喂饲高胆固醇食物8周，以诱使动脉粥样硬化病变的发展，然后，切换为正常食物饲喂4周，在此期间给予CD或对照的载体（图.2A）。正如所料，两个组里与基线相比，血浆胆固醇浓度都下降了，但在对照与CD治疗之间没有观察到差异（图.2B和图.S2A）。虽然，切换为正常食物饲喂载体处理鼠，对其动脉粥样硬化的体积没有产生影响，而CD治疗鼠中导致其动脉粥样硬化斑块消退了45%（图.2C）。虽然，载体处理鼠病变中的CC负载与处理前相比已有减少，不过，CD治疗组的CC数量则更进一步地减少（图.2D）。由于心血管病患者通常不能坚持推荐的生活方式改变，包括饮食方面的调整，所以，我们接着研究，CD治疗是否能影响在肠道胆固醇持续危害期间的动脉粥样硬化斑块的消退。CD或载体处理，高胆固醇食物开始饲喂8周后，并再持续至整个12周（图.2E）。持续饲喂高胆固醇食物的CD处理鼠，虽然，血浆胆固醇和总胆固醇代谢没有改变（图.2F和图.S2B），而其动脉粥样硬化斑块的体积和CC负载都减少了（图.2，G和H）。这些数据证明，CD处理对缩小已形成斑块是有效的。CD溶解细胞内外的CCs有几种可能性来解释CD在动脉粥样硬化的发生和形成方面的保护作用。因为，我们已测试了CD是否能提高CCs的溶解性，知道了CD与胆固醇能形成可溶性包合物，从而增强胆固醇的水溶性约15000倍。荧光标记CD与CCs结合（图.3，A和B），CD以剂量依赖性方式促使CCs提高溶解性（图.3C）。为了使CD在动脉粥样硬化斑块中有效地发生作用，CD也必须作用于细胞内的CCs。巨噬细胞快速地内化荧光CD（图.3D）和将其浓集于细胞内的隔室（图.3E）。此外，CCs与一个亚毒性剂量的10 mM CD共孵育，与时俱进地提高了细胞内CCs的溶解性（图.3F和图.S4）。CD提高了结晶胆固醇的代谢动脉壁内的巨噬细胞把过量的胆固醇转化为泡沫细胞，这一过程可损害巨噬细胞功能和促进动脉粥样硬化的发生（21）。这个过程，可在体外通过给巨噬细胞加载CCs进行模拟（图.S5）。CCs被摄入吞噬体后，胆固醇通过C1型尼曼氏集运器被移送至内质网，在此经乙酰辅酶A（CoA）乙酰转移酶催化形成胆固醇酯。这种机制，把过量的胆固醇转化成晶体，该晶体具有细胞毒性，并进入胆固醇酯贮存于脂滴内。第二个途径，是游离的胆固醇经代谢形成水溶性氧化胆固醇。氧化胆固醇能跨细胞膜扩散，并已知通过激活LXR（肝X受体），促使巨噬细胞重新编程，转而调节炎症反应和支持HDL逆向转运胆固醇（RCT）（22-24）。为了研究CD如何影响巨噬细胞减少源自CCs的胆固醇数量的能力，我们把制备自D6-胆固醇（D6-CCs）的CCs一起孵育，接着对细胞和细胞的上清液中的D6-胆固醇代谢产物，通过气相色谱-质谱选择性离子监测（GC-MS-SIM）（图.4A）。该分析显示，CD治疗促进了源自D6-胆固醇晶体的酯化反应（图.4B）。此外，CD提高了上清液中D6-胆固醇的浓度，而减少了整个细胞库内的D6-胆固醇（图.4C）。因此，CD治疗提高了巨噬细胞排出胆固醇的能力，标志着这是冠状动脉病患者中的一个重要保护因子（25,26）。活跃的胆固醇运输，主要是通过腺苷5-三磷酸盐-结合盒式转运蛋白A1和G1（ABCA1和ABCG1）介导的，ABCA1转移游离胆固醇给载脂蛋白A1（ApoA1），ABCG1转移成熟的HDL粒子（27）。巨噬细胞与CCs共孵育，与观察到提高巨噬细胞排出胆固醇能力相一致的是，增强了ABCA1和ABCG1二者的表达，这还可由CD的治疗得到更进一步地加强（图.4，D-F）。涉及驱动胆固醇排出的基因包括Abca1和Abcg1,是受LXR/类视黄醇X受体（RXR）转录器控制的（22,28）。因为LXRs的转录活性是受氧化胆固醇正调节的，我们接着分析了CD是否能增强胆固醇的氧化。我们发现了D6-CC-负载巨噬细胞的CD治疗，虽然，Cyp27al的表达没有改变（图.S6），而导致D6-胆固醇中衍生的27-羟化胆固醇（D5-27羟化胆固醇）增加了15倍（图.4G）。出乎意料地，CD在正常胆固醇血条件下，也增加了27-羟化胆固醇的产生和来自巨噬细胞的分泌，这意味着，巨噬细胞没有受到D6-CCs的影响（图.4H）。因此，CD增强了游离胆固醇的代谢，并也许从而降低了胆固醇相变为晶体的可能性。CD诱导巨噬细胞中LXR靶基因的表达在D6-CC负载情况下，CD介导了氧化胆固醇产生的急剧增加，以及意外地发现在正常胆固醇血巨噬细胞中CD可提高氧化胆固醇含量，这促使我们综合地研究CD是否影响LXR调节基因的表达谱。野型或LXR-/-/-巨噬细胞暴露于CD、CC或CC和CD和基因的表达，通过汇集全基因组mRNA资料作了评估。为了研究CD是否改变了巨噬细胞中LXR靶基因的表达，我们用先前鉴定的一批533个LXR靶基因，进行了基因集的富集分析（GSEA）（29）。当野型巨噬细胞与CCs孵育时（图.5B），鉴定了富集的一些LXR靶基因集，可能是因为巨噬细胞胆固醇过负载的缘故。这与CC衍生的27-羟基胆固醇的强烈诱导、和看到由于CD增加胆固醇的排出、当CD加入与CCs在一起时富集了一些LXR靶基因集是一致的（图.5B）。在正常胆固醇情况下，CD单独治疗也导致LXR基因集的富集，这与观察到细胞27-羟胆固醇的诱导是相对应的（图.4H）。在LXR-/-/-巨噬细胞中，没有那一种条件可导致LXR靶基因集的显著富集（图.5C）。此外，对野型中关键的LXR靶基因ABCA1和ABCG1以及在mRNA和蛋白质水平上的LXR-/-/-巨噬细胞（图.5D-F）（31）等发现有可能被确证。CD增强了活体中胆固醇的逆向运输（RCT）为了测试CD诱导巨噬细胞的LXR重新编程，是否改善了活体中巨噬细胞胆固醇的排出，给野型骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）或LXR-/-/-小鼠负载来自体内的D6-CCs和将其注入野型小鼠腹腔内。然后，巨噬细胞负载CCs的小鼠用CD或对照载体处理，通过GC-MS-SIM监测D胆固醇被从粪尿中排出（图.6A）。CD增强了野型小鼠CCs衍生的D6-胆固醇的逆向运输（RCT），和降低了在LXR-/-/-巨噬细胞中的含量（图.6B）。值得注意的是，CD处理不仅诱导了D6-胆固醇从粪便中排出，而且还促进了D6-胆固醇从尿中的排除（图.6C），这一过程，通常不在RCT期间观察到。之前，关于一种罕见的遗传病尼曼匹克症C型（NPC病）的工作中，其胆固醇不能从溶酶体逸出，并已表明CD可调动溶酶体胆固醇和激活LXR依赖的基因表达（32,33）。目的在于克服这种胆固醇的运输缺陷，给NPC1缺陷患者每周注射一次CD。为了研究CD是否也能剌激人从尿中排泄胆固醇，我们监测到了NPC1突变患者在CD注入后期间尿中胆固醇的排泄。CD，主要地是导致胆固醇从尿道排出，并存在一个时间依赖性（图.6D）。这些数据表明增强了体内胆固醇自巨噬细胞的逆向运输，部分地以LXR依赖方式，但也可直接地提取和运输胆固醇进行排泄。CD调节人斑块胆固醇的代谢和基因表达为了测试CD对鼠巨噬细胞是否具有保护功能，对人动脉粥样硬化斑块是否也发挥作用，我们接着对以颈动脉内膜切除术得到的活检标本，进行了脂质和基因组的分析（图.7A）。类似我们在鼠巨噬细胞中的研究结果，我们把人动脉粥样硬化斑块与CD一起孵育，导致了胆固醇从斑块向上清液的转移（图.7B）。此外，我们观察到27-羟化胆固醇产量的增加，这主要是由CD处理和斑块释放到上清液里去的（图.7C）。对静止或处理过的斑块组织中的一大组人免疫相关基因的基因表达谱和选择的LXR靶基因（表S3）进行了分析。运用几种生物信息学方法，分析了这些基因的表达数据。首先，我们在以CD或对照载体处理后，用基因差异表达（DE）对基因本体进行了富集分析（GOEA）。我们发现，结果是与我们的脂质分析相一致的，当一经与CD接触后，在脂质运输、存储、代谢和排出方面所涉及基因的表达，均被上调。反过来，这样一些述语表达的“基因调节免疫反应淋巴细胞中免疫反应的调节”、“白细胞介导的免疫调节”或“白介素反应、T细胞和自然杀伤细胞调节”，在CD处理后，这些免疫反应均被下调。基因本体富集分析（GOEA）的进一步探究，显示人斑块的CD处理影响GO术语“炎症反应调节”（GO：0050727）中的许多关键基因。这些包括固有免疫受体，例如Toll样受体（TLRs）2、3、4、7和9；TLR适配体MyD88；炎性体传感器NLRP3；和炎性体依赖促炎细胞因子白介素1b(IL-1b)和IL18(图.7E)。由于我们观察到CD增加了内源性LXR激动剂27-羟化胆固醇，所以接着我们分析了CD是否调节人动脉粥样斑块中LXR靶基因的表达。GSEA（基因富集分析）显示，当与对照处理斑块比较时，CD处理后，LXR靶基因得到富集（图.7F和表S2）。此外，在大多数差异表达的基因中发现了许多LXR靶基因（图.7G，标记红或蓝基因）。值得注意的是，炎性体传感器NLRP3和炎性体抑制器HSP90（34）是两个LXR靶基因（24），当与对照组比较时，CD处理导致NLRP3的下调和HSP90的上调（图.7H）。总之，这些数据表明，CD激活了人斑块中LXR依赖的转录程序，影响胆固醇运输和一些炎症过程，这些是和动脉粥样硬化的发病机制紧密相关的。CD的抗动脉粥样硬化作用是LXR依赖的我们接着测试是否CD介导了在体外分离的巨噬细胞中或处理采自人体内斑块材料中，反映CD在小鼠中的抗动脉粥硬化的作用。因为CD治疗降低了LXR调节的细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-（TNF-）（图.1，H-J）系统性浓度，并也导致饲喂高胆固醇日粮小鼠主动脉弓内ApoE-/-中Abca1和Abcg1的增加（图.S7），我们确定了活体内CD介导的抗动脉粥样硬化作用，是否需要LXR的激活和通过ABCA1和ABCG1使胆固醇从巨噬细胞排出。我们因此给辐照过的LDLR-/-小鼠移植野型LXR-/-/-骨髓，或剔除巨噬细胞特异的ABCA1和ABCG1的（MAC-ABCDKO）骨髓。移植骨髓后，给移植鼠喂饲高胆固醇日粮，同时给以CD或对照载体8周。不同的移植组经CD处理，未影响血浆胆固醇的浓度（图.8，A-C）。除CD处理的移植MAC-ABCDKO骨髓的LDLR-/-小鼠中的HDL有轻微减少外，其脂蛋白谱也仍不改变（图.S8）。携带野型骨髓的LDLR-/-小鼠显示其动脉粥样硬化斑块的体积缩小，证明CD对动脉粥样硬化的LDLR-/-模型也是有效的（图.8D）。值得注意的，CD对携带LXR-/-/-骨髓的LDLR-/-小鼠中的病变发展没有影响，这突出地表明LXR的激动作用，对CD介导的抗动脉粥样硬化是至关重要的（图.8E）。相比之下，巨噬细胞中的ABCA1和ABCG1缺陷，对CD处理的有效性不产生影响，这表明CD可绕过这些胆固醇排出通路。为了更好地了解CD依赖LXR激动剂如何可治疗动脉粥样硬化，我们对移植野型或LXR-/-/-骨髓的LDLR-/-小鼠的主动脉组织，进行了全基因组基因表达的分析。差异表达基因的基因本体富集分析证明，涉及动脉粥样硬化的重要通路包括脂质代谢和炎症，由CD处理以一种LXR依赖的方式所控制（图.8G）。类似于我们对人斑块的研究基于CD治疗在重要DE基因中发现了一些LXR靶基因（图.8H）。此外，我们对人斑块的观察确认，CD促进NLRP3抑制剂Hsp90aal的上调，和NLRP3炎性基因以一种LXR依赖方式得到了下调（图.8I）。总之，这些数据表明，在小鼠动脉粥样硬化中观察到CD介导的抗动脉粥样硬化作用，是依赖于LXR激活和CD在动脉粥样硬化斑块中发挥的多种抗炎作用。 讨论这里，我们测试了通过药理学方法提高胆固醇的溶解性，对食源性动脉粥样硬化产生了有益的影响，观察到的这种巨大作用和即使在高胆固醇日粮期间的极高胆固醇血情况下，CD具有促使已形成动脉粥样硬化消退的意外能力，不能单用简单的CD巨大作用来解释。由于脂质和基因组发现的路径，结合基因缺陷鼠活体中的研究，表明CD主要通过动脉粥样硬化斑块中的那些重编程细胞来发挥强有力的作用。CD的作用，是通过增加内源性LXR配体的数量，它类似于一种药物前体，虽然它自己不被代谢，而是促使胆固醇发生药理学的有效代谢。看来，胆固醇代谢的短暂改变，以及炎症通路与活化的LXR相连接，是这系统中的一个关键的变阻器。例如，固有免疫被微生物成分或急性时相反应所激活，可抑制如ABCA1和ABCG1等LXR靶基因的表达，导致胆固醇滞留，这可以各种方式增强炎症反应（35,36）。这种类型的固有免疫扩增，可能是一种在进化上保守的抗微生物防御机制的一部分（23）。胆固醇积累的结果增加了LXR激动剂，从而，可平衡炎症反应和增加胆固醇排出、恢复胆固醇和免疫内平衡。然而，由于促炎饮食因素过度丰裕和过量的胆固醇，这种平衡就可能转向慢性炎症和胆固醇滞留，驱使动脉粥样硬化的形成。通过提高胆固醇的溶解性和动员胆固醇排出，因此CD可以使血管系统中的胆固醇正常化和免疫内环境达到稳定。CD对巨噬细胞的作用，类似于抗动脉粥样硬化因子HDL。HDL通过ABC转运蛋白减少细胞的过多胆固醇；此外，HDL对巨噬细胞可有显著的抗炎作用（37）。然而，HDL不能激活LXR，不过可增加固有免疫通路的一个关键抑制因子转录活化因子的表达（37）。虽说CD具有提高HDL介导RCT的能力，而它也可动员胆固醇直接地分泌到尿和粪中去。这些数据表明，CD可绕过ABCA1和ABCG1介导激活胆固醇的排出。与这些观察相一致的，我们的骨髓移植研究表明，CD的抗动脉粥样硬化作用，是独立于ABCA1和ABCG1介导的激活胆固醇排出过程的。这是和最近研究结果的显示相一致的，合成的LXR激动剂介导的抗动脉粥样硬化作用是独立于巨噬细胞ABCA1和ABCG1的（38）。我们的研究有几个局限性。首先，虽然我们的数据证明，CD在斑块巨噬细胞中促进了LXR的活化，而LXR在髓细胞中由CD介导的抗动脉粥样硬化作用是需要的，但我们还不能排除其他的未鉴定通路。这是可能的，CD介导的抗动脉粥样硬化作用是多因子的，例如，在生理上增加胆固醇的溶解性、促进胆固醇代谢和从巨噬细胞中排出，以及它的抗炎症性能，这些是不能够轻易分开的。第二，虽然我们的数据鉴定了作为在CD处理时主要的LXR激动剂27-羟化胆固醇，不过，其他内源性氧化胆固醇也可能促成LXR的活化。在这种情况下，一些调控酶如Cyp27A1的功能活动以及其在特定类型细胞中的作用，将是有吸引力的。第三，虽然我们用颈动脉斑块所做的体外实验表明，CD在人类疾病中可诱导抗动脉粥样硬化通路，不过，用特定的临床试验来验证这些实验结果是必要的。临床前模型显示，LXR激动剂在预防小鼠动脉粥样硬化中的有效性（39）和促使动脉粥样硬化的消退（40），对LXR激动剂在动脉粥样硬化治疗中的临床应用，提供了一个有希望的前景，但是，临床中治疗分子学的进展，受到了其肝毒性和脂肪生成作用的阻碍（41）。另一方面，CD已在临床上用于人类亲脂性药物的递送，并没有显示有相关的毒性。因此，把CD再用于动脉粥样硬化的治疗或预防将是可行的。我们的研究为通过提高巨噬细胞胆固醇的溶解性和消除性的疗法，提供了一个重要的证明，这对动脉粥样硬化的治疗，可能是一个有效的策略。材料和方法研究和设计我们课题的主要目的是研究CD是否具有抗动脉粥样硬化的作用，和鉴定由CD介导的主要机制。为此，我们采用动脉粥样硬化小鼠模型，在体外研究巨噬细胞的生物学，和用采自人体的动脉粥样硬化斑块进行间接的体内试验。各个实验的细节说明如下。ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型12周龄ApoE-/-小鼠（查尔斯河实验室），以具有C57BL/6J遗传背景的小鼠被用于所有的研究。小鼠饲养于22房间内，执行12小时光照/黑暗周期和自由采食及饮水。CD预防方案-ApoE-/-小鼠喂以改进的高胆固醇日粮，其含有21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.255胆固醇，连续8周(Ssniff, Soest)。给小鼠皮下注射2g CD/kg体重，每周2次；给对照小鼠皮下注射200ul 0.9% NaCl(试验药物的载体),每周2次。CD消退斑块方案-首先给ApoE-/-小鼠饲以高胆固醇日粮8周，使小鼠形成动脉粥样硬化病变。然后，4周的日粮更换为正常食物。同时，如前所述，小鼠用CD或200ul 0.9% NaCl载体作对照。CD处理方案-ApoE-/-小鼠喂以高胆固醇日粮共12周。如前所述，在8周后开始CD或载体对照处理。每周测定体重1次。处理前后，用电脑控制的尾套法（CODA 6, Kent Scientific）测定动脉血压和心率。指定的处理完成后，小鼠以颈椎脱位法处死，并立即采取组织样本和血液。全部实验均遵照研究机构指南和德国动物保护法律进行。骨髓移植模型从14-18周龄供体鼠采得骨髓：WT C57BL/6J, LXR-/-/-（混合C57BL/6J 和129/Sv品系的遗传背景）和MAC-ABCDKO（有C57BL/6J遗传背景的LysmCreAbca1fl/flAbcg1fl/fl）小鼠。供体的骨髓以一个23G针头用DMEM培养液冲洗股骨和胫骨进行收集。细胞悬浮液用无菌的70um尼龙细胞过滤器过滤，随后用汉克氏酸性枸椽酸盐葡萄糖溶液洗涤2次，并再悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。为了完全移植供体的骨髓，受体有C57BL/6J遗传背景的LDLR-/-小鼠，接受由OB 29/4（Cs-137）发出的致死剂量66 戈瑞（Gy）幅照4小时，幅照后，将供体鼠的1107细胞经尾静脉注入受体鼠。所有鼠在嗜中性白血球减少症期间，为防止系统性感染，连续7天给予饮用加有0.1%/mL环丙沙星的饮水。动脉粥样硬化试验，于幅照后4周开始。如前所述，所有小鼠饲喂高胆固醇日粮，并同时以CD或载体对照处理8周。小鼠动脉粥样硬化斑块的组织学分析带主动脉的心脏埋入于组织泰克OCT包埋剂(Miles)、速冻并于-80储存。样品在徕卡恒低温器上切片（5um），切片开始于主动脉弓，向前通过主动脉瓣区域进入心脏，把切下的组织放置于载玻片上。为进行动脉粥样硬化病变的检查，冰冻切片用3.7%甲醛液固定1小时，以去离子水冲洗，用油红0工作溶液(0.5%)染色30分钟，再次用去离子水冲洗。遵照标准规程进行苏木精染色。所有切片于蔡司阿西韦特200M显微镜下以阿西韦森软件进行检查。为进行主动脉根中动脉粥样硬化斑块形成的定量，每只小鼠的病变区域和3-4张连续组织切片的总面积均被定量。动脉粥样硬化数据，以斑块面积占总血管面积的百分比表示。为进行负载胆固醇晶体斑块的分析，主动脉冰冻切片以4%多聚甲醛液于21固定30分钟。然后，切片以5%胎牛血清、5%牛血清白蛋白、10%常规山羊血清、0.1%皂苷于PBS在21阻断和渗透60分钟。原级大鼠抗小鼠CD68抗体(MCA1957, AbD Serotec)以2mg/mL稀释于10%常规山羊血清/PBS，把放有切片的载玻片在4于其中孵育过夜。二级山羊抗大鼠IgG Alexa647 共轭物(Invitrogen)以4ug/mL稀释于10%常规山羊血清/PBS，并把放有切片的载玻片于21黑暗中孵育60分钟。这些切片再次用10%常规山羊血清/PBS洗涤3次，随后用赫斯特33342 (Immunochemistry)以5ug/mL稀释于PBS，在21于黑暗中复染2分钟。上覆带着80%甘油的盖玻片，其边缘用速干的双组分环氧树脂粘合剂小心地密封。共聚焦激光影像和荧光显微镜使用徕卡TCS SP5 II AOBS共焦激光扫描显微镜进行观察和成像。用标准的成像技术对免疫荧光染色样本进行检测，CCs通过激光影像显微镜如先前叙述的方法被可视化。简言之，所安装的检测器声-光束分束器使反射的激光可用于检测。每鼠斑块的CC含量用3-4张切片以激光穿透速度来定量(PerkinElmer)，以及以全部晶体影像区对全部斑块区的比例来描述。对各处理小鼠的组织学分析进行的研究是全盲式的。活性氧族的测定整个主动脉段中的活性氧族，使用L-012化学发光法测定。降主动脉近段与左锁骨下动脉远端开口处之间的主动脉段，被小心地切取置入已冷却经改良的Krebs-HEPES缓冲液（pH7.4）(由99.01mM NaCl、4.69mM KCl、1.87mM CaCl2、1.20mM MgSO4、20.0mM Na-HEPES、1.03mM K2HPO4、25.0mM NaHCO3、11.1mM D(+)葡萄糖和另加抗坏血酸（0.28mM）和吲哚美辛（0.01mM）Wassmann:2001vn。主动脉在除去结缔组织后切成2mm节段。主动脉节段在含有改良Krebs-HEPES缓冲液100umol/l L-012闪烁管中以1分钟的间隔闪烁计数器（Lumat LB 9501, Berthold）计数15分钟。该血管段然后予以干燥测定干重。以每毫克主动脉组织相对的化学发光计算所释放的ROS（活性氧族）。血浆胆固醇、前体和植物固醇的定量胆固醇的血浆浓度，通过GC-火焰离子化检测器，用5-胆甾烷作为内部标准进行测定。胆固醇前体，例如烯胆甾烷醇、羊毛甾醇、二氢-羊毛甾醇和链甾醇，连同胆固醇5-饱和代谢物5-胆甾烷醇和植物固醇芸苔甾醇谷甾醇和豆甾醇，通过GC-MS-SIM用表粪烷醇作为内部标准进行测定（43,44）。胆固醇前体被用作胆固醇合成的替代标记物，5-胆甾烷醇和植物固醇指示固醇的吸收/同化。使用快速性液相色谱法（FPLC）分离血浆脂蛋白采用FPLC进行脂蛋白的分离，以无限胆固醇液相稳定试剂(Thermo Fisher Scientific, VA, USA)，首次确定了总的血浆胆固醇水平。然后，整50ul 血清预热至375分钟，接着通过PVDF 0.45um 膜过滤器过滤。经过滤的样本（20ul）在Superose 6 PC 3.2/30柱(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)于4通过FPLC凝胶过滤分离。洗脱部分用280nm吸光度进行监测，以每分钟40ul的恒定流速，在样本注入后18分钟开始收集40ul。每一部分胆固醇用酶促胆固醇试验测定，以及曲线下的VLDL（极低密度脂蛋白）、LDL和HDL的面积，与已知人VLDL、LDL和HDL的标准平行比较进行确定。流式细胞术小鼠的血液样本，如前所述的进行分析（45）。接着，红细胞裂解后，活淋巴细胞群体进行sca-1-FITC (Becton Dickinson)和flk-1-PE (Becton Dickinson)分析。同型完全相同的抗体和未染色的样本，在每个实验(Becton Dickinson)中用作对照。染色后，立即用FACS流式细胞仪(Becton Dickinson)测定荧光细胞。数据用CellQuest软件进行分析。所有被测定成分的组件，是在流式细胞仪分析期间，于特定化淋巴细胞门前测定20000个事件后获得的特定事件。相关的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞计数，使用预定义门确定。胆固醇晶体的制备使用在1-丙醇中的2mg/mL胆固醇溶液制备CCs。通过添加1.5倍体积的无水内毒素诱导结晶化。干燥后的CCs再悬浮于无菌PBS。细胞培养细胞培养于37含5% CO2 的湿润空气中。BMDMs派生于LXR-/-/-小鼠（具有C57BL/6J 和129/Sv品系的混合 混合传背景）和年龄及性别匹配的WT C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨分离的骨髓。骨髓细胞培养于加有10%FCS、10ug/mL环丙沙星和40ng/mL M-CSF (R&D Systems)的DMEM中6天。来自WT C57BL/6J小鼠(iMacs)的永生化巨噬细胞，被培养于加有10%胎牛血清（FCS）和10ug/mL环丙沙星-500(Bayer)。CD结合和摄取试验为评估CD与CCs结合，1mg CCs与0.5 mM RBITC-NH2-HPCD(rhodamine CD, Cyclolab, Hungary)在室温孵育6小时。晶体在共焦显微镜或流式细胞仪分析前用PBS洗涤5次。为研究细胞的CD摄取，iMacs巨噬细胞与20ug CCs孵育3小时。活细胞在添加1mM若丹明CD与未标记CD以1:10比例混合的混合物中6小时，进行活细胞成像的共焦显微镜分析。2小时后，摄取达饱和状态。巨噬细胞在1mM若丹明CD与未标记CD以1:10的混合物中孵育3小时，进行巨噬细胞CC-负载的流量细胞仪分析。接着，细胞用PBS洗涤并收获，用MACSQuant分析仪(MiltenyiBiotec)检测细胞内的若丹明荧光。数据用FlowJo分析。细胞生存能力分析细胞在荧光测定前，遵照制造商指示，细胞在CellTitre-Blue试剂(Promega)中于37孵育至2小时，进行细胞生存能力的测定。未处理的细胞用作阳性对照，70%酒精处理的细胞（死亡细胞）被用作阴性对照。放射性胆固醇晶体的溶解试验如前所述，由0.1 mCi1,2- 3 H-胆固醇(Perkin Elmer)以1:50（w/w）比例与未标记胆固醇(Sigma)组成2mg/mL的胆固醇溶液，制备放射性标记的CCs。结晶化后，晶体溶液经0.22um旋转过滤柱除去游离的1,2- 3 H-胆固醇。自过滤膜重新获得CCs，并在37标明浓度的CD溶液中震荡孵育过夜。通过0.22um滤板过滤，以确定滤液中溶解的1,2- 3 H-胆固醇数量。洗涤后的滞留物随后于乙醇中孵育2小时，以确定1,2- 3 H-胆固醇晶体的总量。细胞内胆固醇晶体溶解的偏光显微镜观察iMacs巨噬细胞与20ug CCs孵育4小时，PBS洗涤后，与10mM CD或对照用介质再孵育3小时。每60分钟获得一次细胞的偏振光图像。细胞的晶体区域，使用蔡司爱喜视觉软件进行自动图像的分析评估。数据以CC负载4小时（洗涤步骤的时间）后晶体区域所占百分比表示。脂滴染色iMacs巨噬细胞与20ug CCs孵育3小时，经PBS洗涤，用4%多聚甲醛液于室温固定30分钟。LD450染色细胞用1ug/mL荧光色素共轭霍乱毒素B亚基(Invitrogen)染色10分钟，LD450（46）于室温以PBS稀释至0.1ug/mL 30分钟。对经油红0染色的载玻片快速地用60%异丙醇冲洗，然后以0.4% 油红0工作溶液（60%异丙醇）于室温染色30分钟。按照标准规程用苏木精进行复染。巨噬细胞中晶体衍生胆固醇的分析如前所述，以7.27.27- 2 H 6 -胆固醇（D6-胆固醇，CDN isotopes, Quebec, Canada)制备同位素标记CCs。iMacs巨噬细胞以200ug D6-CCs/1106细胞孵育3小时。洗去细胞外的D6-CCs和收获对照样本，在进一步处理前评估D6-胆固醇的分布状况。所剩细胞用10mM CD处理24小时(胆固醇外流分析)或48小时（胆固醇酯和氧化甾醇测定）。分别收获上清液和细胞部分，提取游离甾醇和氧化甾醇类，并通过气相色谱-质谱-选择性离子监测（GC-MS-SIM）进行分析。气相色谱-质谱-选择性离子监测D6-CC被摄取进入巨噬细胞后，D6-胆固醇酯化的程度，通过对在细胞和上清液中存在（总D6-胆固醇）和没有（仅游离D6-胆固醇）碱水解水平的差异计算来获知。D6-胆固醇的抽提后，衍生为它的三甲基(TMSi)甲硅烷基醚，用表粪烷醇作为内部标准，在m/z 464M+对D6-胆固醇的TMSi醚和在m/z 370M+对表粪烷醇，进行GC-MS-SIM监测（47）。来自同一部分的氧化代谢物7.27-2H5 (25R)-26-羟胆固醇（D5-27-羟胆固醇），在m/z 461M+-90进行GC-MS-SIM监测。真实的胆固醇和它的氧化物27-羟胆固醇用GC-MS-SIM在m/s 458M+和m/s 456M+-90分别予以测定（48）。活体模型中由CC引起的逆向胆固醇运输16周龄C57BL/6J小鼠腹腔内注射WT或LXR-/-/-小鼠的15106BMDMs，这些BMDMs注射用前用100ug D6-CCs/1106细胞孵育3小时。然后，小鼠按2g CD/kg体重或作对照的载体200uL 0.9% NaCl液皮下注射。每3小时收集1次粪和尿，共收集30小时，用GC-MS-SIM分析收集样本中晶体衍生的D6-胆固醇。D6-胆固醇对5-胆甾烷的幅射区被用于粪D6-胆固醇的描述。每次注射CD后，排泄D6-胆固醇量曲线下的区域，即为所示的结果。定量逆转录酶PCR 为进行细胞基因表达分析，巨噬细胞与100ug CCs/1106细胞孵育3小时，用10mM CD处理细胞4小时，用10G针头破碎细胞。为进行血管基因表达的评估，切取小鼠主动脉，速冻于液氮中，以及在Trizol试剂中用机动均质器均质化。遵照制造商的方案，用peqGOLD RNA-纯化法(peqLAB Biotechnology)分离RNA，接着通过应用RNeasy MiniElute cleanup试剂盒(Qiagen)进行纯化步骤。通过260nm紫外光谱定量总RNA量。分离的RNA样本的质量通过测定A260/A280比例来确定，完整的核糖体28S和18S泳带由琼脂糖凝胶电泳来确定。然后，遵照制造商方案，使用Omniscript RT 试剂盒(Qiagen)，对分离的总RNA的1ug进行逆转录。使用商品Taqman探针( Abca1 Mm00442646_m1,Abcg1 Mm00437390_m1, Applied Biosystems)，以TaqMan系统通过实时定量逆转录PCR，扩增单链cDNA。Abca 1和Abcg 1 mRNA表达被标准化为18S(Mm03928990_g1, Taqman 探针, Applied Biosystems)。免疫印迹巨噬细胞与100ug CCs/1106细胞孵育3小时，再以10mM CD 处理24小时。LXR激动剂T0901317 (Sigma)被用作活化LXR的阳性对照。细胞在冰上用1x RIPA缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10%甘油 , 0.1% SDS, 0.5%脱氧胆酸盐, 0.1 M PMSF)加以完整蛋白酶抑制剂(Roche Biochemicals)溶解30分钟。通过BCA试验(Pierce)测定蛋白质浓度，等量的蛋白质与MOPS运行缓冲液(Novex, Invitrogen)被加载于4-12%预制SDS-PAGE凝胶(Novex, Invitrogen)上。把蛋白质转移到PVDF膜(Millipore)，膜在3%BSA、TBS与吐温20中被阻断，与小鼠单克隆ABCA1抗体(MAB10005, Millipore)和兔单克隆-肌动蛋白抗体(Li-Cor Biosciences)于4孵育过夜。这些些膜经洗涤与二级抗鼠和抗兔抗体(Li-Cor Biosciences)在黑暗中孵育45分钟。免疫反应通过红外线可视化检测(Odyssey, LICOR)。基本表达谱的Illumina珠芯片技术分析采用TargetAmp Nano-g Biotin-aRNA Labeling试剂盒得到了用于Illumina系统(Epicentre)分析的经生物素标记的cRNA。生物素标记的cRNA(750ng)与人HT-12v3珠芯片(Illumina)杂交，并在Illumina iScan 或 HiScanSQ系统上扫描。微阵列数据的主要数据和质量控制原始强度数据用基因组工作室V2011.1(Copyright 20032011 Illumina)进行处理和输出。全部阵列数据输入Partek基因组系列软件TM版6.6(PGS, Copyright 2012 PartekIncorporated)。质量控制评估包括主要成分分析，和应用箱须图（box-whisker plots）使表达成分可视化。微阵列数据的生物信息学分析非规范化数据(log2)进行分位数规范化，以及在数据集以可变的表达转录，使用双向方差分析模型，包括批校正sentrix条形码和适用性，计算不同条件之间的差异表达（DE）基因。对于源自WT或LXR-/-/-小鼠（GSE67013）BMDMs的微阵列数据分析，通过倍数变化（FC）大于2和P0.05来定义DE基因。应用基因集富集分析（GSEA）来确定一组基因在两种不同状态之间是否具有统计学上的显著性意义。一组基因，当在两种不同状态下比较时，显著性P0.05及错误发现率（FDR）0.25时，即判定其富集具有统计学显著性意义。GSEA是使用针对由Heinz等（30）（表S1）对来自LXR靶基因鉴定所得的LXR靶基因列表中的1000个排列进行的。为了对来自骨髓移植模型小鼠（GSE67011）降主动脉微阵列数据进行分析，通过倍数变化（FC）大于1.3和P0.05,确定差异表达（DE）基因。将DE基因与CD结合，与先前所列对照组比较，使用BiNGO (v2.44)软件的插件Cytoscape (/)，进行基因本体富集分析（GOEA）(49)。错误发现率（FDR）设定为0.05，只包括具有显著性意义的结果。Cytoscape插件富集图(V1.1)(50)和词云（51），被用于可视化GO网络。对杰卡德系数的截取值设置为0.51，FDR q-值设为0.1。对NLRP3炎性体通路相关基因的表达，在帕特克途径（Partek Pathway）中实现可视化。NPC1患者们尿液中胆固醇的定量NPC1缺陷患者每周1次于8小时内输注2000mg CD/kg体重(ClinicalTNCT01747135)。自3个NPC1患者个体采集尿样，从应用CD静注开始，尿液注明采集的时间点。如前所述，用GC-MS-SIM测定尿胆固醇浓度，并使排泄尿肌酸酐数据标准化。本研究方案遵照1975年的赫尔辛基公告和FDA批准的I-IND（个体的新药研究）规程。并得到所有受试者法定监护人所写的知情同意书。人颈动脉粥样硬化斑块的患者队列在国立奥斯陆大学医院神经科中，征募到具有高等级颈动脉内狭窄（70%）或最近月内发生缺血性卒中的患者。颈动脉狭窄的诊断和分类，通过脑前的彩色多普勒和CT血管造影，按统一标准确定。关于超声波检查，颈动脉的整个颅外部分，以B型和多谱勒分析。超声斑块外观遵照共识标准（52）按回声反射性分类。患者的排除标准是，心脏衰竭、肝病、肾病和严重的并发病如感染、结缔组织疾病和恶性肿瘤。挪威东南部和西部的地区卫生当局批准了这项研究方案(REK no: S-0923a 2009/6065)。本研究，符合赫尔辛基公告关于使用人体组织和受试者所述的原则，所有参与者，均递交了签署的知情同意书。人颈动脉粥样硬化斑块的培养 采自一个月内有症状或狭窄程度70%患者颈动脉斑块的活检样本（n=10），放置于杜尔贝科改良伊格尔氏培养基(D-MEM/F12; Gibco)中，以30mg/mL无内毒素和脂肪酸的牛血清蛋白(Sigma)富集。每个患者的含有动脉粥样硬化斑块的活检样本，以肉眼观察分为两等份，并以10mM CD或PBS孵育16小时。然后，把活检斑块再分成两等份，1份放在RNA Later试剂盒(Qiagen)中，用于RNA分析，另一份速冻用于脂质分析。收集斑块上清液，于速冻前离心(1700 g ,5分钟, 4C)，在进一步分析前于-80贮存。干燥斑块组织和其上清液的固醇和氧化植物固醇的分析按前述方法进行斑块组织的切取和收集，然后，把斑块组织放置于SavantTM SpeedVacTM浓缩器(Thermo Fisher Scient