高效毛细管电泳指纹图谱在中药研究中的应用.doc

高效毛细管电泳指纹图谱在中药研究中的应用摘要：以中药指纹图谱质量控制特征为基础,综述了毛细管电泳在中药指纹图谱方面应用的基础理论和方法。介绍了毛细管电泳指纹图谱的优势,毛细管电泳指纹图谱的研究方法与评价方法及其在中药质量控制中的应用。关键词：毛细管电泳；指纹图谱；毛细管电泳-质谱联用；中药；应用The application of capillary electrophoresis fingerprints of traditional Chinese medicinesAbstract:To review the basic theories and methods of capillary electrophoresis fingerprint (CEFP) of traditional Chinese medicines based on quality controlled characteristics of traditional Chinese medicine fingerprint. The advantages of CEFP were introduced, and the research and appraisal method of CEFP for traditional Chinese medicine were also discussed.Key words: capillary electrophoresis (CE); chromatographic fingerprints; capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS); traditionalChinese medicines (TCMs); application任何药物都必须安全、有效。随着中药在世界各地的影响和应用日益广泛,人们对中药的安全性、有效性、稳定性提出了更高的要求,但中药的质量控制一直是制约中药现代化与出口的“瓶颈”。在我国,众多的科研工作者致力于中药质量控制方法的研究,其中色谱法的应用取得了可喜的成绩1,2。仅以中华人民共和国药典2005版一部3为例,用薄层色谱法(TLC)鉴别的品种达1523项,用于含量测定的45项;用高效液相色谱法(HPLC)测含量的品种达479种,涉及518项;用气相色谱法(GC)鉴别和进行含量测定的有47种。与2000版中国药典比较,采用TLC,HPLC及GC鉴别的品种分别大幅度增加了866,413及37项。可见色谱法在中药质量控制中应用之广泛。虽然中药的质量控制有了很大的进步,但由于中药的成分极其复杂,中成药则尤甚,更由于其疗效是基于中药物质群的整体作用,因此对少数成分的定性、定量,不足以代表中药质量的总体表征。在这种情况下,中药指纹图谱应运而生。1.高效毛细管电泳11高效毛细管电泳概述高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis,HPCE），是以高压电场为驱动力，以毛细管作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。CE仪器基本结构大致包括毛细管柱、进样系统、高压系统、检测系统和数据采集系统等。毛细管柱是CE的核心部件，石英毛细管是当今的首选材料。最常用的毛细管内径为（2075)cm，有效长度为(5075)cm。进样系统采用自动进样方式，主要有流体力学和电动方式，高压系统要能提供130 kV的直流电压。检测器目前最常用的是紫外可见光检测器和荧光检测器等。CE作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，自上世纪80年代问世以来，得到了迅速的发展，其研究和应用涉及环境分析、药物分离、生化分析等几乎所有的分析领域，引起学术届，尤其是色谱界的广泛关注。这与它独特的优点是密不可分的:(1)分离时间短。由于毛细管具有良好的散热功能，分离毛细管的纵向电场强度可达到400V/cm以上，因而分离操作可以在很短的时间内(最快可在几秒钟)完成。(2)具有很高的分离效率。理论塔板数达到400,000/m以上，最高达10,000,000/m数量级。(3)仪器结构简单，操作简便，运行成本低，且易实现自动化。(4)样品用量极少(仅为纳升级)，绝对检测限较低。1.2毛细管电泳法发展的历程毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),或称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是在毛细管中(内径100m,常用75m),在电场作用下带电质点(离子或胶粒)在电解质溶液中,向电荷相反的电极以不同速度迁移而分离的现象称为毛细管电泳法。1981年Jorgenson和Luckacs4首次使用内径75m的石英毛细管和30 kV的高电压,获得了高于40万理论塔板数的分离柱效,标志着CE技术的诞生,这就是目前广泛应用的毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE)。1984年Terabe, Otsuka和Ichikawa5等发展了基于组分疏水性差异而实现分离的毛细管胶束电动色谱(micellar elec-trokinetic capillary chromatography, MECC )。1969年,Vesterberg6合成了一种经随机聚合产生的多氨基和多羧基的混合物,即载体两性电解质,可用其分离等电点差异达0.01 pH的蛋白质。1985年Hjerten和Zhu7将该法引入毛细管电泳中,发展了基于等电点不同而分离的毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing, CIEF),它结合了常规等电聚焦电泳(IEF)的高分离能力和现代毛细管电泳的特点,使其成为分离蛋白质的重要方法之一。1987年Cohen和Karger8提出了基于分子量大小筛分机制的毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis, CGE)。1981年Jorgenson和Luckacs9在170m内径的毛细管中填充了10m的Partisil ODS-2,在电场作用下成功地分离了9-甲基蒽和芘，获得了31万理论塔板数的柱效,并指出在以电渗流作推动力的情况下,固定相的填充不规则性对样品区带展宽并不重要，这种技术被称为电色谱(capillary electrochroma tography, CEC)。电色谱在90年代得到了迅速发展,是毛细管电泳与色谱法相结合的产物,具有电场力与液压2种驱动力,是被认为最有前途的新分析方法。它是在毛细管中填充或毛细管壁涂布、键合色谱固定相，依靠电渗流及液压推动流动相，使中性的和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间分配系数不同而实现分离的一种电分离模式。1990年瑞士Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer首次提出微全分析系统( Miniaturized total chemical analysis system,-TAS )的概念和设计9-11,自此微型化、集成化和自动化的芯片毛细管电泳技术获得了重要发展。1.3 基本原理和分析特点HPCE是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。仪器装置通常包括高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器和记录系统5部分,其中毛细管柱是分离的核心部分。研究与实践表明,HPCE与高效液相色谱(HPLC)相比具有以下特点:(1)分离效率高,理论塔板数高达106107/m;(2)分析速度快,一般在2030 min内可完成一次电泳操作;(3)应用模式多样,已经发展了毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MECC)等分离模式,扩大了HPCE的应用范围;(4)样品用量少,仅为纳升级;(5)灵敏度高,用激光诱导荧光检测器可达10-24的超低检出限。2. 中药指纹图谱概述中药指纹图谱12,13是基于总体识别中药的观念,以系统的化学成分结合药理学研究为基础,采用一定的分析手段,将中药的药效和化学成分的相关性以图谱的形式描绘出来,以鉴别真伪,辨认优劣。以往分析工作者力求运用各种分析检测手段测定某种有效成分,以某一活性成分含量的多少来判断某种药材及制剂的质量。这样的分析方法有两个主要缺点:一是有效成分不一定是该种药材药效的专属成分;二是不符合中医理论,尤其在复方制剂中,任何一种活性成分均不能反映中医用药所体现的整体疗效,分析的越细,目标越缩小,离中药的整体疗效的距离越远。因此,凭借某一种化学成分定性和定量的中药质量评价方法的有效性和专属性逐渐受到质疑。在不可能将中药复杂成分完全搞清楚的情况下,指纹图谱是总体反映药材及其制剂内在质量和稳定性的可行手段。国际上,如美国食品药品管理局(FDA)、世界卫生组织(WHO)、欧洲共同体、印度和加拿大草药典等对草药产品的质量评价也提倡采用指纹图谱13,14。指纹图谱不要求呈现在图谱中的每一个组分的化学结构都清楚,也不要求对每个组分都精确定量,但要求图谱具备指纹特征,即专属、稳定、实用,凭借指纹图谱可确认产品的真伪,且能判断质量稳定与否15。现代分析仪器的发展已可提供用于指纹图谱分析的强有力技术,特别是色谱和毛细管电泳这样的分离分析方法及其与质谱的联用技术,可以提供多维的数据。比如采用毛细管柱GC或顶空气相色谱(HSGC)可以获得中药中可挥发性成分的谱图16;采用裂解气相色谱(Py-GC)可以获得药物成分降解产物的信息17;采用HPLC18,19则可以获得中药中难挥发和不挥发成分的谱图。毛细管电泳(CE)由于分离效率高,适用样品范围广,分析成本低而得到广泛的应用,在中药指纹图谱研究中已有不少报道20,比如,十大功劳药材21和栀子药材22的CE指纹图谱等。然而,必须承认,中药指纹图谱的研究才刚刚起步。由于指纹图谱分析是一项极为复杂的系统工程,原料药材和成药的组成和疗效又受许多因素的影响,故要将色谱或CE指纹图谱作为普适而有效的质量标准尚有很多必须解决的问题。如原料药材的质量稳定性和投料物的选择、用于不同药材和制剂的指纹图谱分析的技术确定和方法验证、数据处理的规范和图谱解析标准23、优良实验室规范(GLP)、优良制造规范(GMP)和整个分析方法的自动化问题等等,均需要做全面而系统的研究。3毛细管电泳指纹图谱的优势毛细管电泳以简捷的技术提供了较高的可靠性,样品不需要特殊处理;试剂消耗量极少,极大地降低购买和处理的费用;纳升级进样量可使有限的样品得以被充分利用;柱上检测可快速准确对中药水提液或醇提液成分进行检测,分离机制的单一性和可选择性使得CEFP分析方法的快速开发成为可能。高效毛细管电泳以其极高的柱效和极低的试剂消耗及污染小、分离方式多样,使其在CEFP应用领域越来越广泛,是一种极有发展前途的中药质量控制的绿色分析方法。由于电泳组分出峰先后顺序基本是阳离子、中性分子和阴离子并遵循按质荷比大小顺序出峰,在分离机制上与HPLC明显不同,这对谱效学研究可提供以迁移时间特性反映的有效组分的活性特征,能够弥补色谱中以分配机制描述的定量结构-保留相关(QSRR)机制的不足。通过改变BGE的条件可同时测定指纹峰所代表物质的pKa和pKb值,有利于理化常数和药效、药理相关联。利用CEFP可实现不同电泳指纹峰与蛋白作用常数以及与金属离子的配位常数的测定,得到化学指纹的体外作用的重要生物活性信息。中药成分,尤其是中药制剂的成分极其复杂,水溶性的极性成分占很大比例。这从常用中药方剂为汤剂,现代中药制剂注射剂近百种,以及中药成分的研究多采用水醇提取法等可得到印证。毛细管电泳非常适合水溶性或醇溶性成分的分离分析,是进行中药质量控制的绿色分析方法。其中毛细管区带电泳(CZE )及毛细管凝胶电泳(CGE)的分析对象为可解离的物质或带电荷的物质,适用于分离中药中的生物碱、黄酮及其苷、香豆素类、有机酸类、氨基酸类、核酸类、多肽类及蛋白质类等化合物。采用胶束电动毛细管色谱(MECC)除了能分析上述物质外,还能分析中性分子,因此它适用于各类物质的分析。孙毓庆与孙国祥等对冬虫夏草、银杏叶、地黄、牡丹皮、山茱萸、山药、射干、大青叶、连翘及金银花等药材,以及复方甘草片、苦碟子注射液及六味地黄丸等中药制剂进行了毛细管电泳分析或其指纹图谱研究。实验证明,这些药材及制剂的CE指纹图谱具有专属性的鉴定意义,某些化学成分的CE定量分析合乎要求。以冬虫夏草为例:冬虫夏草是滋补强壮的名贵中药材,价格昂贵,自然资源接近枯竭,因而其人工培育品、代用品及伪品充斥市场,鉴定冬虫夏草的真伪、优劣成为当务之急。孙毓庆等用毛细管电泳分析冬虫夏草的水提取液获44个峰,而蛹虫草、人工冬虫夏草、人工蛹虫草、亚香棒草等伪品及次品的CE图谱与冬虫夏草的CE图谱有着非常明显的区别,很容易用CE加以鉴别。而冬虫夏草的HPLC图谱,只有十几个色谱峰,因而较难鉴别。他们还同时进行了冬虫夏草主要成分的定量分析,精密度与准确度均符合要求。10个产地的冬虫夏草的CE指纹图谱的测定结果表明,其CE指纹图谱完全可用于冬虫夏草的鉴别与质量评价。4.CE与质谱联用技术及其在中药中的应用1987年Olivares24首次报道了毛细管电泳与质谱的联用技术,由于其在一次分析中可同时得到迁移时间、相对分子质量和碎片特征信息,为复杂样品的定性、定量分析提供了一种强有力的手段,已经被广泛应用于药物分析和生物大分子分析等领域25。CE-MS联用技术用于药物分析虽然已有不少的报道,但国内用于中药分析的数量还很有限。柳仁民等26以非水毛细管电泳对粉防己甲醇提取物中的生物碱进行分离,并利用在线电喷雾离子阱质谱得到的准分子离子及碎片信息对其进行鉴定;使用未涂层毛细管, 50 mmolL-1醋酸铵-4%HAc-甲醇溶液为运行缓冲液,分离电压为25kV,质谱接口为同轴鞘液接口;电喷雾电压为45 kV,铝毛细管温度为170;鞘液组成为60%异丙醇-39%水-1%HAc,鞘液流速为5Lmin-1。李奕等27建立了一种CE-ESI-MS分析中药中的粉防己碱和防己诺林碱含量的方法,并比较了熔融石英毛细管和PVA涂层毛细管在定量分析中的性质差异。在背景电解质0005 molL-1甲酸铵50%甲醇溶液的条件下,成功地对中药中的粉防己碱和防己诺林碱进行含量测定。台湾的Chen等28采用CE-MS分析中药中的麻黄碱,小檗碱和巴马亭,并以此对真假中成药进行鉴别,其结果的可靠性明显优于用紫外检测器。Unger等29用CE-MS分离分析了单萜吲哚生物碱、氢化小檗碱类生物碱、-咔啉生物碱和异喹啉生物碱4种类型的生物碱,并讨论了生物碱结构对电泳淌度的影响。尽管CE-MS技术还不如GC-MS和HPLC-MS发展的成熟,应用的范围也没有GC-MS和HPLC-MS广泛,但是有很大的应用潜力,随着CE技术的改进和MS接口技术的发展,将有更多的中药可用CE-MS联用法进行分析测定,并且建立CE-MS数字化谱具有更高的定性准确性和可靠性。在线CE-MS用的缓冲溶液与毛细管区带电泳(CZE)的缓冲溶液有很大的区别,在CZE中常用硼酸盐、磷酸盐和枸橼酸盐等,而在线CE-MS中一般不能用这些非挥发性盐,应选用乙酸铵、甲酸铵等挥发性盐代替。所以前述的三角形法、四面体法优化法不适合选择在线CE-MS的BGE。色谱指纹图谱指数F优化BGE可应用于CE-MS中毛细管各种分离形式上的开发。当分离分析结构相近的同系物时,CE-MS谱图中所示的分子离子峰的质荷比信息就与孙国祥等30提出的按定量结构-性质相关(QSPR)原理标定指纹峰的表观分子量序大致相符。在CE-MS中的MS也可用作检测器,输出总离子的时间函数,得到的电泳谱图在形状上与CE-UV谱图基本一致,当然提供的分子离子峰的质荷比信息更有助于电泳峰分子结构的定性鉴别,实现对中药成分的准确定性、定量分析和评价。5. 中药毛细管电泳数字化指纹图谱的应用的现状与前景数字化指纹图谱是利用数学原理或数学方法对指纹图谱本质特征进行定义、表达、重组、模拟、信息挖掘等处理过程,将检测方法和仪器检测的信号数据转化成易于判别、能揭示潜在复杂的化学和生物活性信息特征的数字化信息。因此数字化指纹图谱实现了将样品指纹特征转化成量化的数据信息,从而建立样品的数据信息共有模式,使在不同仪器、色谱柱、色谱条件下的分析结果可以直接互相对比。是色谱图及色谱数据处理的一次质的飞跃,将色谱图间的直观比较变化为数据之间的比较,增强了样品间的可比性,使鉴定结果更加公正、客观、科学、准确,将极大增强指纹图谱的通用性和实用性。高效毛细管电泳以其高效、快速、简便且柱不易受污染的特点而优于HPLC法,在中药有效成分的分离、定性定量、中药材鉴别等方面应用越来越广泛,但目前仍存在重现性较差、系统不稳定等缺陷,所以仅凭色谱图直接比较可能会存在很大误差,应用数字化指纹图谱技术对其评价就大大增强CEFP的可比性与可控性。目前国内也有关于数字化指纹图谱的报道31,32,但是大多数都是数据内涵简单,没有实现真正意义上数字化,并且需要大量的手工计算。孙国祥等33研制的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0”软件,是将积分信号直接导入软件后可即刻得到指纹峰特征技术参数、色谱指纹图谱潜信息特征判据参数、色谱指纹图谱定性相似度和定量相似度判据参数和色谱指纹图谱相对统一化特征判据参数总计114个以上。它们从各个方面反映指纹图谱的数字化特征,且不需要复杂数学方法和繁杂计算,使用起来极为方便和快捷。这一软件为数字化CEFP的建立提供了极大的便利条件,使毛细管电泳技术能够更加准确、客观、真实的用于中药质量的鉴别和控制。数字化指纹图谱技术是数字中药质控的典型代表和核心技术,建立毛细管电泳数字化指纹图谱是实现中药现代质量控制的重要技术之一。参考文献：1 Sun YQ,Ruan JH, Ma X. 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