分子生物学方法鉴定微生物.ppt

微生物分子生物学鉴定 微生物分类学定义 按微生物的亲缘关系和进化规律把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群的科学 微生物的鉴定 主要步骤 纯化 测定一系列必要的指标 查找权威性鉴定手册鉴定方法分四个水平 细胞的形态和习性水平 形态特征 运动 酶反应 营养要求及生长条件等细胞组分水平 细胞壁成分 氨基酸库 脂类 醌类 光合色素等的分析蛋白质水平 氨基酸序列分析 凝胶电泳和血清学反应等基因或DNA水平 核酸分子杂交 G C mol 转化和转导 16SrRNA寡核苷酸族分分析 DNA或RNA核苷酸序列分析等 类别 分子生物学菌种鉴定 DNA碱基比例的测定 16SrDNA序列分析法 全基因组序列的测定 随着分子生物学的迅速发展 细菌的分类鉴定从传统的表型 生理生化分类进入到各种基因型分类水平 核酸分子杂交 一 DNA的碱基组成 G C mol G C mol A T G C G C X100 1 DNA碱基比例的测定是指 G C mol 值 简称 GC比 表示DNA分子中鸟嘌呤和胞嘧啶所占的摩尔百分比值 AT间仅形成2个氢键 GC间可形成3个氢键 GC值根据样品的Tm值计算 通过核酸分析鉴定微生物遗传型生物GC比的特点 亲缘关系相近的种 其GC比也相近 反之 GC比相近的两个种 它们的亲缘关系则不一定都很接近 GC比差距很大的两个种 其亲缘关系必然较远 GC比是建立新分类单元时的可靠指标GC比相差5 时 为不同种 GC比相差 10 时 为不同属 测定DNA碱基组成的方法 由于热变性温度法操作简单 重复性好而最为常用 基本原理 将DNA加热 两条单链逐渐被打开 从而使DNA溶液260nm紫外吸收明显增加 称DNA的增色效应 G C 增加 所需温度也较高 当温度高达一定值时 DNA完全分离成单链 此后紫外吸收不再增加 DNA的热变性过程 即增色效应的出现 是在一个狭窄的温度范围内发生的 紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度 Tm 在一定条件下 DNA的Tm值与DNA的G Cmol 成正比 Tm 69 3 0 41 G Cmol 二 核酸分子杂交 DNA DNA杂交法DNA rRNA杂交法rRNA rRNA杂交法杂交同源性 60 同种 70 同一亚种20 60 同一属 按碱基的互补配对原理 用人工方法对两条不同来源的单链核酸进行复性 退火 以构建新的杂合双链核酸的技术 核酸的分子杂交 DNA DNA杂交基本原理 双链DNA分子加热可变性 冷却处理时 又可复性 不仅同一菌株的DNA单链可以复性结合成双链 来自不同菌株的DNA单链 只要二者具有同源互补的碱基序列 它们也会在同源序列之间互补结合形成双链 这就称之为DNA DNA分子杂交 不同微生物之间 DNA同源程度越高 其杂交率就越高 若两个菌株DNA分子序列完全相同 则应100 地杂交结合 具体测定方法很多 按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类 在这些方法中 有的需要用同位素标记DNA 有的则用非同位素标记 而 复性速率法 则是通过测定单链DNA分子复性结合的速率来计算DNA的同源性而不需要对DNA分子进行标记 细菌常用固相杂交法 参照菌株 A菌B菌 待测 DNADNA 同位素标记 酶切并解链 单链单链 固定于滤膜上 未标记 最适温度复性杂交 洗涤 测定放射强度 杂交率 以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百 60 同一个种 70 同一亚种 20 60 同属不同种对于许多有争议的种的界定和建立新种起了重要作用 DNA rRNA杂交rRNA是DNA转录的产物 在生物进化过程中 其碱基序列的变化比基因组要慢得多 保守得多 它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列 因此 当两个菌株的DNA DNA杂交率很低或不能杂交时 用DNA rRNA杂交仍可能出现较高的杂交率 因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系 进行属和属以上等级分类单元的分类 DNA DNA杂交和DNA rRNA杂交的原理和方法基本相同 只是在技术细节上有些差异 如DNA rRNA杂交中 用同位素标记的是rRNA而不是DNA等等 核酸探针广泛用于微生物鉴定 传染病诊断 流行病调查 食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域 所谓核酸探针 probe 是指能识别特异核苷酸序列的 带标记的一段单链DNA或RNA分子 因此 一种核苷酸片断能否作为探针用于微生物鉴定 最根本的条件是它的特异性 即它能与所检测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交 根据特异性的不同 在微生物鉴定与检测中的作用也不同 有的探针只用于某一菌型的检测 有的可能用于某一种 属 科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定 例如 从一株淋病奈瑟氏菌 Neisseriagonorrhoeae 隐蔽性质粒制备的DNA探针 它具有种的特异性 可用来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌 使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法 是将探针与所检测的细菌进行杂交 在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时 常用菌落原位杂交法 大致步骤是 将细菌点种于硝酸纤维素膜上进行培养 加溶菌剂使细胞释放出DNA分子 加变性剂使DNA离解成单链并固定于膜上 加入带标记的核酸探针进行杂交 洗膜后进行显色或显影鉴定 用核酸探针来鉴定或检测微生物 具有准确 快速等优点 特别是当用常规方法难于鉴定和检测时 往往更显示其优越性 三 rRNA寡核苷酸编目分析 利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家CarlWoese 60年代末Woese开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类 他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA rRNA 特征序列 认为16SrRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适 三 rRNA寡核苷酸编目分析 一种通过分析原核或真核细胞中最稳定的rRNA寡核苷酸序列同源性程度 以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法 是 三域学说 提出的科学根据 选用rRNA做生物进化和系统分类的原因 rRNA普遍存在 易于提取 rRNA重要恒定的生理功能 在细胞中含量高 易于提取 编码rRNA的基因在细胞中不像质粒DNA那样会转移 而是十分稳定的 rRNA某些核苷酸序列非常保守 历经进化仍能保持原初相对分子量适中原核生物rRNA 23S 2900 16S 1540 和5S 120 真核生物rRNA 28S 4000 18S 2300 和5 8S 160 核糖体构造和组分模式图 原核生物 小亚基 30S 大亚基 50S 16SrRNA 21种核糖体蛋白 23SrRNA 34种核糖体蛋白 5SrRNA 真核生物 小亚基 40S 大亚基 60S 18SrRNA 33种核糖体蛋白 28SrRNA 51种核糖体蛋白 5 8SrRNA 原理 用一种RNA水解酶水解rRNA后 产生一系列长短不一的寡核苷酸片段 电泳分离 放射自显影技术获得指纹图谱 确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳谱上的位置 找出图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸片段作序列分析 获得的结果进行按不同长度进行编目 列表 通过比较 分析 计算 就可知道各菌株间的亲缘关系大小 若两种或两株微生物的亲缘关系越近 则其产生的寡核苷酸片段的序列也越接近 反之亦然 rRNA寡核苷酸编目分析 实验过程 将事先用32P标记的被测菌株rRNA提纯 用可专一水解G上3 端磷酸酯键的T1RNA酶进行水解 于是产生一系列以G为末端的长度不一的寡核苷酸片段 接着把它们进行双向电泳分离 再用放射自显影技术获得rRNA寡核苷酸群的指纹图谱 然后将图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸作序列分析 把获得的结果按不同长度进行编目 列表 通过比较计算和分析 就可定量地知道各被测菌株间的亲缘关系 rRNA寡核苷酸编目分析 培养微生物 提取基因组DNA rDNA序列测定 分析比较 微生物之间的系统发育关系 16SrDNA微生物鉴定流程 PCR扩增16SrDNA片段 从样品中分离提取总微生物DNA 从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA 这是进行PCR扩增16SrRNA的前提 一种方法是直接提取总DNA 对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取 另一种选择是提取微生物细胞中的rRNA RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂 一般多采用提取细胞总DNA 但也可根据情况选择提取rRNA PCR扩增16SrRNA基因片段 聚合酶链式反应 PCR 又称体外基因放大技术 是将DNA样本与寡核苷酸引物 三磷酸脱氧核苷和耐热的TaqDNA聚合酶在一种适当的缓冲液中混合 然后进行循环的扩增反应 由于PCR技术的产生和发展 现在一般采用16SrRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列 或通过反转录PCR获得cDNA序列后再进行分析 采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16SrRNA序列 而且方便了后面的克隆和测序 但也同样会出现PCR所固有的缺点 尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增 可能出现嵌合产物 Chimericproduct 和扩增偏嗜性现象 影响结果的分析 PCR扩增步骤如下 1 双链DNA 模板 加热变性为单链 2 引物与模板DNA单链结合 3 引物延伸 扩增 通过16SrRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定 16SrRNA基因片段的分析方法主要包括以下4种 一是将PCR扩增后微生物16SrDNA序列 提交到GeneBank采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析 GenBank将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单 相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类 与16SrRNA数据库中的序列进行比较 确定其在进化树中的位置二是通过16SrRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息 此外 探针也可以直接与样品进行原位杂交检测 通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度 而且能够分析它们的空间分布 三是对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析 PCR RFLP 通过观察酶切电泳图谱 数值分析 确定微生物基因的核糖体型 再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系 用以揭示微生物RFLP的多样性 四是对PCR扩增产物进行梯度凝胶电泳分析 直接观察其多样性 通过T1RNA酶的水解 一般可使rRNA形成含有1 20个核苷酸单位的寡核苷酸片段 如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为 字母 的话 则含两个以上核苷酸的片段就成了 单词 将含有6个 字母 以上的所有 单词 一一测定其核苷酸序列 最后可把它们编成一部 词典 于是 两个茵株rRNA的相似性就可通过查阅 词典 来作比较 比较的具体方法是计算它们间的缔合系数 associatedcoefficient 或相关系数SAB值 上式中 NAB是A B两被测菌株所共同具有的 单词 的 字母 数 而NA和NB则是两株菌分别具有的 单词 的 字母 数 根据SAB值进行数值分析 就可推知它们之间的亲缘关系 它的作用很大 至今Woese及其同事已对400多株细菌和放线菌进行过分析 并从其中发现了生命的第三种形式 古细菌 提出了生物界级分类中的 三域学说 三域学说及其发展1980 Woese 16sRNA共同的祖先古细菌域 产甲烷细菌 极端嗜盐菌 极端嗜酸热菌真细菌域 除古细菌原界以外的细菌真核生物域 原生生物 真菌 动物 植物 嗜热菌 真细菌原界 紫色细菌 G 细菌 绿色非硫细菌 蓝细菌 黄杆菌 极端嗜盐菌 甲烷细菌 极端嗜酸热菌 动物 纤毛虫 真菌 植物 鞭毛虫 微孢虫 原始祖先RNA 真核原界 古细菌原界 内共生假说 现今一切生物都有一个共同的远祖进化而来 小细胞先分化出细菌和古生菌 古生菌分支上的细胞丧失细胞壁后 先后吞噬了 变形细菌 相当于G 细菌 和蓝细菌 并形成了内共生 从而使两者进化成与宿主细胞难分难解的细胞器 线粒体和叶绿体 于是宿主最终也就发展成了各类真核生物 四 微生物基因组全序列的测定 是当前国际生命科学领域中掌握某微生物的全部遗