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NaCl胁迫下玉米幼苗叶片中几个microRNA的realtime PCR 鉴定上的毕业论文目录目录1摘 要4关键词4ABSTRACT5KEY WORDS51.绪论61.1盐害对植物的影响61.1.1 盐害简介61.1.2 盐害对玉米的影响61.1.3 其它因素对受盐胁迫玉米的影响61.1.3.1 NO对盐胁迫的缓解作用61.1.3.2 丛枝菌根对盐胁迫的缓解作用71.1.3.3 脱落酸对盐胁迫防御作用71.1.3.4 外源Ca2+对盐胁迫的缓解作用71.1.3.5 铈（Ce）对受盐胁迫玉米的作用71.1.3.6 硅对盐胁迫下玉米幼苗生长的影响71.2 实时定量PCR的原理81.2.1 生物原理81.2.2 化学原理81.2.2.1荧光染料嵌入法81.2.3实时定量PCR的重要概念91.3 micro RNA简介91.3.1 micro RNA概述91.3.2 植物的microRNA101.3.3 miRNA的特征与差异111.3.4 鉴定miRNA的方法111.3.5 几种热门的microRNA 介绍121.3.5.1 mir-21的研究121.3.5.2 Let-7的研究121.3.6 MiRNA与植物逆境胁迫的研究进展131.4 microRNA种类间存在协同作用关系141.5 与microRNA研究密切相关的学科或研究方向141.6选题目的及意义151.7 实验流程152.实验内容162.1 材料与仪器162.1.1 实验材料、试剂、器皿及资料162.1.2 实验仪器162.2实验方法162.2.1营养液的配制162.2.2玉米种子的处理及萌发172.2.3玉米幼苗的移栽172.2.4玉米幼苗的处理172.2.5 总RNA的提取172.2.5.1 CTAB-LiCl法提取总RNA172.2.5.2 SDS法提取总RNA182.2.5.3 TRNzol-A+法提取总RNA192.2.6 MiRNA定量PCR的引物设计192.2.7 MiRNA的cDNA的合成192.2.8 Real Time PCR 反应212.2.9待检验miRNA的引物设计212.2.10荧光定量标准曲线的制定212.2.11 内参的选择222.3实验结果232.3.1总RNA提取结果232.3.2 5个待检测MiRNA的realtime PCR结果282.3.3 相对表达量的柱状图结果302.4 实验数据处理与结果分析382.4.1 trizol法提取的总RNA的OD值分析及讨论382.4.2 trizol法提取的总RNA的电泳结果分析及讨论382.4.3 实时定量PCR结果分析及讨论382.4.4 相对表达量的柱状图分析38参考文献40附录1 缩略词41附录二 REALTIME CT值41致谢42NaCl胁迫下玉米幼苗叶片中几个microRNA的Real-time PCR鉴定作者：谢玺（西北农林科技大学生命科学学院）指导教师：武永军摘 要：microRNAs(miRNAs)是一类长度为20-25nt的非编码内源小分子RNA，广泛存在于各种生物中。它由基因组特定区域编码，抑制靶基因翻译。在线虫、植物和哺乳动物中的研究发现其功能多种多样。盐渍化土壤在我国分布广、面积大，已成为一种严重的环境问题和制约粮食生产的主要因素之一。盐渍化主要发生我国西部和北部地区，而玉米则是北方主要作物之一，故研究盐胁迫对玉米的影响是十分有必要的。本实验以玉米幼苗叶片为材料，通过NaCl胁迫的方式处理玉米并提取总RNA，对前期已经预测到的5个新的 miRNAs进行了Real time PCR验证。设置3h、6h两个时间梯度和5%、10%、20%三个浓度梯度。利用real-time PCR的数据做出相对表达量的柱状图并分析，做出推断。关键词：玉米；盐胁迫；miRNA；Real time PCRIdentification of several miRNAs in leaves of maize seedlings using real-time PCR under NaCl stressAuthor:Xi Xie Tutor:Yongjun WuABSTRACT：microRNAs(miRNAs) are a kind of noncoding endogenous RNAs and they distribute widely in nematode, plant, mammal and other organisms. They were coded by the special region of genome, matured by Dicer and other relevant enzyme. They bind with RISC and guide complexus to cut the mRNA of target gene or prevent the translation of target gene. Research of nematode, plant and mammal find miRNAs functions are various and they also have very important regulation function.The area of soil salinization in china are large, the distribution of soil salinization in China is wide. And soil salinization has become a dangerously environmental issue and a main restricted factor of food produce. Salinization occurs mainly in western or northern China and maize is main crop in northern china. Therefore, it is essential to research the effect of maize under salt stress.In this experiment, maize was treated under NaCl and their total RNA were extracted. Small RNAs of maizes leaves were tested via Real time PCR to confirm the novel miRNA.Key Words: maize；NaCl stress；miRNA；Real time PCR1.绪论1.1盐害对植物的影响1.1.1 盐害简介盐害是世界农业生产中最为重要的非生物逆境之一。据估计世界大约有三分之一的灌溉地受到盐渍危害。我国的盐渍化土壤面积达到4107 hm2以上，与灌溉有关的盐渍化土壤有2106hm2左右，约70%分布于西北地区,尤其是干旱与半干旱地区。随着污染加剧，由于灌溉不当和大量施用化肥等原因,次生盐碱化土壤面积还在继续扩大,给农业生产造成重大损失。玉米是我国北方的重要作物，在陕西、东北、河南、河北、山东等地均有广泛种植。由于灌溉的不合理或使用含盐量较高的劣质水进行灌溉，使土壤的盐分不断提高甚至产生盐害。1.1.2 盐害对玉米的影响盐害主要有渗透压胁迫，盐离子自身的毒性引起的营养不良和氧化胁迫等。大部分非盐生植物都是Na+敏感植物，盐分对非盐生植物的最普遍的影响就是生长抑制。生长是植物对盐胁迫的综合体现以及对盐胁迫的综合适应更是植物耐盐性的最优评价指标。玉米是非盐生单子叶植物，对盐分胁迫、水分胁迫都很敏感。盐胁迫对于玉米的生长有明显的抑制作用。盐胁迫抑制生长的原因有很多，一是由于盐分破坏膜透性和离子平衡而对植物产生伤害，二是盐分胁迫影响了叶绿素含量及导致气孔关闭等抑制光合作用。非盐生单子叶植物中的有机溶质包括AA、OA、SS等在总渗透调节中对COP的贡献随盐度增加而增加。AA的来源一般认为是盐胁迫下植物体内蛋白合成受阻，降解加剧导致氨基酸含量增加。用有机溶质作渗透调节物质的能量消耗要远大于以无机离子作为渗透调节物质的能量消耗，这也势必消耗大量的能量并对其生长产生影响。NaCl胁迫处理的玉米苗鲜重和干重都会减少，尤其是处理时间较长时。NaCl胁迫时，Na+/K+比不断增大，特别是根部。根部的Na+含量显著高于地上部分。Lauchli和drew推测玉米地上部分拒盐的机理可能性有：1.在玉米根部表皮或皮层细胞Na+主动向外运输从而降低了细胞液的浓度，进而了减少向木质部的运输。2.在玉米较老根区的木质部薄壁细胞可以从木质部液体中吸收Na+从而减少到达地上部的Na+。Na+大部分积累在根部会造成幼苗地上部Na+含量较低从而减轻盐害，有利于生长。1.1.3 其它因素对受盐胁迫玉米的影响1.1.3.1 NO对盐胁迫的缓解作用NO是重要的信号分子和毒性分子，植物体主要通过一氧化氮合酶和硝酸还原酶催化合成。NO 对植物体有两方面的作用，即保护和毒害，其具体表现视其浓度、作用部位不同而不同。SNP（硝普钠）是一种NO供体，用50mmol/L以上浓度的SNP保护受盐胁迫的玉米，可以增加玉米幼苗的干物质积累速率。外源NO对盐胁迫下玉米叶片叶绿素浓度的提高有明显作用。它还可使叶片质膜的电导率降低，降低各器官中Na+ 含量并提高了K+ 含量，提高植物的钾钠比，这说明外源NO保护了膜结构的完整性。1.1.3.2 丛枝菌根对盐胁迫的缓解作用丛枝菌根真菌（AM )是一类广泛存在的真菌, 它与植物共生可以提高植物在逆境中生存能力。在NaCl 胁迫下无论是否接种AM真菌，玉米植株生物量都减少, 而不接种AM 真菌的玉米的减少幅度比接种AM的真菌高10% 。AM真菌提高玉米耐盐性机理之一可能是提高了植株叶片的CO2 交换速率、蒸腾速率、气孔导度以及水分利用效率等。盐胁迫对细胞膜的损伤主要由于盐胁迫抑制植物的光能利用和CO2 的同化, 叶绿体电子传递给O2 的机率增大, 产生了大量的自由基, 从而对植物造成伤害。过氧化氢酶（CAT), 可促使H2O2 分解。AM真菌提高玉米耐盐性的另一机理是其可使受盐胁迫的玉米CAT活性升高、H2O2 含量下降从而保护玉米细胞膜的完整程度。1.1.3.3 脱落酸对盐胁迫防御作用ABA 处理能使盐胁迫下的叶片保持较高的水势，保证植物水分的吸收, 维持正常的代谢活动。ABA 也能诱导气孔的关闭从而更大程度地降低光合强度。光合的下降会进一步降低光合组织对光能的利用能力,玉米有更多过剩光能伤害的危险。但在实际上ABA 处理后, 捕获的光能下降、热耗散增加，有效地缓解了盐胁迫下玉米受光能伤害的程度。1.1.3.4 外源Ca2+对盐胁迫的缓解作用适当的浓度的外源Ca2+，可以缓解盐胁迫对玉米的危害。盐胁迫时，玉米植株内的可溶性蛋白含量大幅减少，而20 mmol/L的Ca2+可使蛋白含量明显增加。Ca2+除了在各生理指标上对盐胁迫有缓解作用，而且在植物形态上对玉米有明显保护作用。1.1.3.5 铈（Ce）对受盐胁迫玉米的作用铈是一种稀土，可用于酸雨、重金属、臭氧及农药污染防治等方面，而且对盐胁迫的玉米也有一定作用。喷施Ce对受盐胁迫玉米的影响不明显，而根施Ce的受盐胁迫玉米体内的SOD和POD的活性都有下降。说明Ce对受盐胁迫的玉米有一定的保护作用，但不同施用方法导致的保护效果的差异还有待研究。1.1.3.6 硅对盐胁迫下玉米幼苗生长的影响近年来发现，硅（Si）可大幅提高作物的抗盐性。在盐水灌溉条件下, 加入硅可使小麦产量降幅从46 %减少到4 %。硅也是通过保护膜结构完整性、增加酶活性、增加植物水势等方面提高玉米耐盐性。1.2 实时定量PCR的原理1.2.1 生物原理DNA的半保留复制是生物体生长、发育、遗传的生物基础。高温可以使DNA 变性解链, 当温度降低后又可以复性。故，通过体外控制温度的高低交换, 可操控DNA 的变性和复性。传统PCR 技术是基于上述原理, 在体外通过变性-退火- 延伸的循环, 以四种脱氧核糖核苷酸为反应原料, 使模板在引物、Taq聚合酶和镁离子存在的条件下快速而大量的扩增。实时定量PCR是在传统PCR基础上, 通过在反应体系中加入荧光基团, 利用仪器检测荧光信号积累的强弱情况, 进而实时检测每一轮PCR反应, 并对与其产物的量有正相关关系的初始模板进行定量或半定量分析的技术。1.2.2 化学原理要实现PCR 产物的实时检测, 一般借助于荧光物质产生荧光来实现。常用实时定量PCR的检测有荧光染料嵌入法和探针法。探针法又包括水解探针和分子靶标等。1.2.2.1荧光染料嵌入法 SYBR Green是一种荧光染料, 可嵌入到双链DNA 的小沟部位。SYBR G reen与双链DNA结合后可发散出绿色荧光。因此,给实时定量PCR反应体系中加入SYBR G reen 时,双链DNA上就会因为嵌入SYBR Creen 染料而产生荧光, 通过荧光实时定量PCR 仪来检测荧光信号的强弱即可分析被合成核酸的量。( 2)水解探针法( TaqMan法)在PCR 体系中加入一段可与DNA 链结合, 并且有荧光基团和淬灭基团的DNA序列作为探针。DNA 聚合酶沿着PCR产物延伸时, 就利用5到3的外切酶活性切碎荧光探针, 使探针的淬灭基团和荧光基团分开, 荧光基团不受猝灭基团干扰从而发射荧光,被自动化仪器捕捉到。在这个过程里, 每当切掉一个荧光探针, 就有一个荧光基团被释放而发出荧光。所以, 该方法的灵敏度更高，但是成本非常昂贵。（3）分子靶标法在PCR反应体系中加入有茎环结构的单链探针, 称为分子靶标。分子靶标的环上的核苷酸与靶DNA 序列互补配对, 茎部核苷酸自身可以互补配对, 但与靶DNA 无序列相似性。探针的5端和3端带告荧光报告基团和荧光促灭基团。当游离时, 茎环结构的分子靶标两端的荧光基团紧密相邻, 发出的荧光被淬灭基团所促灭, 在变性后的复性阶段, 探针环上的核苷酸与靶序列结合, 破坏了茎环结构, 解除了淬灭作用, 荧光报告基团发出荧光。荧光强度随着扩增产物的积累而不断增加。1.2.3实时定量PCR的重要概念基线： 在PCR早期, 产物荧光信号与背景荧光无较大区别。随着产物量的不断增加, 产物的荧光信号不断增强。在PCR 反应处于指数期的某一点时，就可区别出并检测到产物积累的荧光强弱, 这称为基线，是产物荧光信号能被检测到的下限。荧光阈值：为便于比较和检测, 在实时定量PCR 反应的指数期, 需设定一个荧光信号的域值, 如果检测的荧光强度超过该域值, 才可被认为是真正的信号, 然后用该阈定义模板DNA 的循环数(Ct)。扩增曲线：PCR 在开始循环后, 由于原料的分解、酶的失活等的影响, 扩增产物的量的增加会进入一个平台期, 使循环数和扩增产物量之间出现S型曲线, 即扩增曲线。进入平台期的早晚与起始模板量呈正相关。溶解曲线：溶解曲线是用于检测PCR 扩增的特异性和重复性的曲线。溶解曲线峰值单一, 表示为目标产物的特异性扩增、重复性好。1.3 micro RNA简介1.3.1 micro RNA概述近些年，许多非编码 RNA在真核生物体内被发现，包括有miRNA、siRNA及xist RNA、snmRNA等。它们组成RNA的调控网络，在转录、转录后和表观遗传等水平控制基因的表达，调控包括细胞生长、应激、凋亡、癌变等一系列生理过程。其中对miRNA的深入研究，揭示出一种新的基因表达调控方式。1993年，Lee等在研究秀丽新小线虫的发育过程中，发现了一个22nt的小分子NoncODing RNA：lin-4。能时序性的调控胚胎后期发育。它不能编码蛋白质，但后续的研究发现lin-4的转录本是一个有发夹结构的RNA前体，及pri-micro RNA，被迅速加工为另一个前体pre-micro RNA，之后在Dicer及其他没得作用下形成22nt的成熟micro RNA，它与其他蛋白形成RISC（沉默复合物）可以通过碱基互补配对的方式与lin-14 mRNA的3非编码区(3UTR）结合进而抑制蛋白的翻译。lin-7是一个21nt 的小分子RNA，作用机制和lin-4非常相似，可与lin-4相互作用调控线虫的发育。由于lin-7和lin-4都有调节发育时序的功能，因此被称为h序RNA（stRNA）。在此后，大量类似的小RNA被发现。这些小分子RNA 都具有一定的保守性，但表达特点有一定的区别：有些有时间特异性、有些有组织特异性。这些小分子RNA在2003年被统一命名为microRNA（miRNA）。miRNA的发现极大的拓展了人们对生命研究的认识，丰富了人们对基因调控尤其是转录后调控的理解。1.3.2 植物的microRNA对植物micro RNA的研究也在如火如荼的展开。植物miRNA的研究表明，miRNA同样 在植物生长发育中扮演重要的角色。植物pri-miRNA 多数由RNA聚合酶转录，在植物根、茎、叶、花、果实等器官的生长分化中 都有miRNA的参与。拟南芥幼苗和花的小分子RNA文 库已被建立，获得了16个新的miRNA并被分别命名为miR156到miR171。这些miRNA5端都是U，结构与动物中的miRNA 较为相似。1.3.3 miRNA的特征与差异通常真核生物中的miRNA有如下特征：(1)miRNA是一种Nonccoding RNA，本身没有可读框（ORF），分布在真核生物中，有高度保守性。(2)miRNA常为20-25nt，5端有U偏爱性并且有独特的序列特征。(3)miRNA有自身转录调控的机制，多数有组织特异性和时序特异性。(4)miRNA在基因中多数以单拷贝、多拷贝或基因簇方式存在，位于基因间区，小部分位于内含子中。miRNA在动植物中有较大的差异，动植物之中还没有发现完全相同的miRNA，主要差异有以下方面：(1)在植物中，只有成熟的miRNA才表现出进化保守性，但动物miRNA的前体和成熟体都有进化保守性；(2)植物miRNA 前体的茎环结构比动物的大，折叠方式更复杂，前体序列也更长；(3)植物成熟的miRNA多为21-25nt，动物则为22-23nt；(4)在与靶位点结合时，植物miRNA几乎完全互补，而动物miRNA较低；(5)植物miRNA多调节转录因子，动物miRNA除了调节转录因子外还对新陈代谢、细胞分化等生命进程进行调节。1.3.4 鉴定miRNA的方法无论是构建cDNA 文库还是高通量测序，在寻找新的miRNA 时，仅靠大小远不足确定它是 miRNA。得到的小分子RNA也可能是其他的noncoding RNA 或者mRNA的小片段。这种情况用miRNA序列和已知数据库比对，可十分容易的检测出来。但如何将 miRNA和siRNA 加以区分是一个十分棘手的问题。从生物学功能上不能准确区分二者，因为二者都与RISC结合、对基因进行负调控。在生化结构上同样难以对其区分，它们都经Dicer酶切割，都有5磷酸和3羟基，长度都为20-25nt。不同的是，siRNA来源于外源或内源的长双链RNA（dsRNA），两条链被加工成许多siRNA。故miRNA的鉴定要结合它的表达及生物来源。能说明其有表达的证据是：1. 可以采用Northern blotting或者Real-time PCR的方法让特定的22nt的转物录和一个有梯度的RNA样品杂交。2. 在cDNA文库中鉴定约22nt的序列，这序列必须跟该物种基因组序列完全匹配。microRNA的生物来源的证据是： 能预测潜在的折叠二级结构，而且22nt左右的片段在该发卡结构的一端、发卡结构必须有最低的吉布斯自由能；内在的较大的环和泡是不被允许的，尤其是不对称的环；此二级结构在动物中有60-80nt，但在植物中可以达到数百核苷酸。单独使用某条规则不能证明22nt左右的小RNA是microRNA，因为单凭表达不能排除siRNA的可能。仅凭二级结构也不能说明它是microRNA，受控于Dicer 酶的物质有许多。因此必须同时有两方面的证据，才可说明它是microRNA。最理想的情况是：它在生物体中表达（）；它与其他microRNA保守（）；它的量受到 Dicer的影响（），即+。但一般情况下+就可以说明它是miRNA。大体来讲就是，若得到了小RNA的cDNA序列，并且是保守的，则可直接判断它是miRNA。如果得到的序列不保守，那么还得通过Northern Blot或者Real-time PCR来验证它的真实性。上述的方法确定的时间较早，随着时间的推移，更多新的miRNA为人们发现，人们对miRNA的认识也不断深化。在2008年此方法做了一些改进，不过主要针对植物miRNA。植物中含有相对更大更复杂的小RNA群体，其中miRNA并不占多数。1.3.5 几种热门的microRNA 介绍1.3.5.1 mir-21的研究mir-21是一种位于17q23.2染色体上的多顺反子microRNA，是相关研究最为广泛的一种microRNA。mir-21相关研究热点现状主要表现为：肿瘤对mir-21具有“致癌基因成瘾性”，通过靶向组织中特定基因，参与乳腺癌、肺癌、直肠癌、神经胶质瘤、结肠癌等肿瘤的调控过程；该种microRNA在免疫、呼吸、消化、心血管系统等非肿瘤疾病中存在差异表达；在肿瘤诊断和治疗方面的相关研究己取得重要进展。肿瘤对mir-21具有“致癌基因成瘾性”，早在2002年，Weinstein提出“癌基因成瘾性”的概念，并将其假设为：肿瘤细胞的存活及其肿瘤表型的维持依赖于某特定的癌基因的持续高水平激活。“致癌基因成瘾性”指的是在肿瘤形成过程中虽然包含很多个步骤，但是只要靶向特定的单个致癌基因就能起到治疗效果。Volini等通过对实体肿瘤的microRNA标记信号进行了定位，结果发现miR-21广泛参与实体肿瘤的发病过程，控制或者逆转肿瘤基因。miR-21通过靶向多种基因、蛋白在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。此外，许多研究还指出在乳腺、人类神经胶质瘤、大肠癌、结肠癌、肺癌等癌症中，miR-21通过差异表达，靶向特定基因调控肿瘤疾病的进程。2010年，Medina等证明，miR-21是一个真正的致癌基因，肿瘤能够对该致癌microRNA上瘾。该研究结果首次证实致癌基因成瘾的存在，对于癌症治疗具有重要意义。1.3.5.2 Let-7的研究Let-7由8个具有相同种子序列的成员组成，这8个成员由11个prelet-7加工而成，其表达基因分布于8条不同的染色体中，在个体发育及疾病过程中发挥重要作用。Let-7相关研究热点现状主要表现为：作为肿瘤抑制因子参与多种肿瘤的调控过程；与lin-28蛋白、HMGA2基因和KRAS基因之间的作用机制研究得到较多关注。Let一7作为肿瘤抑制因子通过靶向其特异基因参与卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺肿瘤等肿瘤进程。1.3.6 MiRNA与植物逆境胁迫的研究进展尽管发现的miRNAs越来越多，但植物的miRNAs只占其中一小部分，而且主要集中在拟南芥等模式植物和水稻等作物之中, 而且他们的功能还不是十分清楚，但是实验证据表明miRNA 在植物与环境的互作中有广泛的影响。miRNA在植物抗生物胁迫中也有重要的作用：通过修饰拟南芥miRNA159 的前体从而获得能够分辩芜菁黄花叶病毒TYMV和芜菁花叶病毒TuMV毒性蛋白的人造miRNA amiR-P69159 和 amiR-HC-Pro159发现表达amiR-P69159和amiR- HC-Pro159的转基因拟南芥能够分别特异抵抗 TYMV和TuMV病毒感染。miRNA 也参与了植物适应营养胁迫的过程：缺硫可诱导 miR395 高量表达同时 miRNA395的表达与 APS1 的表达成负相关，这预示着miRNA395 在植物对硫营养的吸收过程中起着至关重要的调控作用。在缺乏磷酸盐的情况下，miRNA399 表达上调，过量表达 miRNA399抑制其靶基因泛素结合酶 E2的积累从而增加了对磷酸盐的吸收，miRNA399 可维持植物体内的磷素平衡。miR398上调表达能够提高作物在氧 化胁迫中的适应性。miRNA广泛参与了植物非生物逆境胁迫的响应过程：miRNA159 受ABA诱导过量表达、miRNA393 受冷冻干旱盐害和ABA的诱导都可表达、miR397 调控盐胁迫相关的基因的表达、miR398在拟南芥生物和生物逆境中下调表达。miRNA 与植物抗氧化胁迫的关系主要来源于模式植物拟南芥miRNA398调控Cu-Zn 超氧化物歧化酶（CSD) 基因的研究。实验结果表明，氧化胁迫并不能诱导 CSD1 和 CSD2 基因产物转录水平的增加，这两个CSD 基因的正调控取决于miRNA398 水平。当植物处于氧化逆境胁迫下，miRNA398 的表达就会受到抑制，CSD转录产物的积累表现出植物的抗氧化能力。转基因的研究进一步揭示了miRNA398在调控CSD 2 基因表达中和氧化胁迫中的重要作用。Sunkar 等构建了拟南芥幼苗经脱水、高盐、低温和 ABA胁迫处理后的小分子 RNA 文 库，并对文库的测序结果进行分析，发现26个未报道的 miRNAs，它们属于15个新的 miRNA 家族。利用miRNA与靶基因结合序列互补的特点，预测了41个有不同功能的靶基因。Nothern Blotting结果表明，许多miRNA受到一种或多种逆境胁迫的调控这些调控有正有负，有组织特异性。miRNA393在逆境胁迫下靶向TIR1，表示胁迫处理可能会造成 TIR1 mRNA的降解或翻译的抑制，而TIR1是生长素信号的正调控控子，作用在于促使泛素途径降IAA/Aux蛋白，而对TIR1 mRNA 的抑制可负向的调节生长素信号和幼苗生长。故miRNA393 对 TIR1 的正调控有可能抑制逆境环境下植株的生长。Lu等从受到机械胁迫的毛果杨木质部组织样品中鉴别出5种与机械损伤相关的miRNA，如受张力和压力下调表达的 miR156、miR162 和miR164；受张力和压力上调表达的miR408 ；受压力增强表达的miR159、受压力下调表达的miR160和miR172以及受张力小幅下调表达的miR168。众多研究数据表明miRNA在植物面对机械应力状态改变时有重要的调控作用。把miRNA 导入植物体内也可以改变植物的表型：Achard等人发现过量表达miR159 可导致拟南芥在短日照下开花延迟、花粉囊发育受阻。还有报道称拟南芥的2个miRNA基因的突变体miR164a和miR 164b的侧根较多，其突变表型能够被miR164a和miR164b基因的表达所恢复。1.4 microRNA种类间存在协同作用关系多数情况下，MicroRNA并不是单一地发挥作用，往往需要多种microRNA与其它调控因子共同作用。MiR-2l/let-7和miR-133/miR-1这两组的共现频次最高，说明这两组microRNA间存在密切协同作用关系。此外，miR-1/miR-499等相关研究也已经引起研究人员的关注。1.5 与microRNA研究密切相关的学科或研究方向1.生物信息学 ：生物信息学是是80年代末随着人类基因组计划(HGP)的顺利启动和各种后基因组计划的开始而兴起的一门新兴的交叉学科。它涉及生物学、数学、计算机科学和工程学等学科，是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一。2.系统生物学：Hood给谈论系统生物学时指出，系统生物学是研究一个生物系统中所有组分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，及在特定条件下这些组分的相关关系，并通过计算生物学建立一个数学模型来定量描述和预测生物学功能、表型和行为的学科。现在主流的系统生物学定义为：系统生物学是生物学的一个新领域，其目的在于在系统层次上理解生物系统，力求阐述作为一个系统的生物系统，并重点着眼于以下4个问题：系统结构的阐述；系统行为的分析；系统控制的方法；如何设计系统。3.混沌生物学:20世纪有三次伟大的科学革命，即相对论、量子力学和混沌。相对论排除了绝对空间和时间的牛顿幻觉、量子力学排除了对可控测量过程的牛顿迷梦、混沌则排除了P.拉普拉斯的可预见性的狂想并且正在消除对统一自然界和概率论两大对立描述体系间的鸿沟。混沌是非线性动力系统的特有运动形式。生物体本身就是一个非常复杂的非线性系统，生物的绝大多数过程中都有混沌效应，比如神经元突触的分布、毛细血管的分叉、就连糖酵解的化学反应中都存在混沌现象。可以将混沌定义为非周期性的、具有渐进的自相似有序的现象。1.6选题目的及意义正常的自然条件下，植物在生长过程中不可避免地会出现很多生物与非生物因素的胁迫作用，盐胁迫是影响植物生长主要非生物胁迫之一，本实验试图从miRNA角度进一步探索玉米受到盐胁迫时的作用机理。1.7 实验流程玉米幼苗的萌发及幼苗的移栽 玉米幼苗的盐胁迫处理总RNA提取Real time PCR验证数据及结果分析2.实验内容2.1 材料与仪器2.1.1 实验材料、试剂、器皿及资料陕单6号玉米种子、蒸馏水、双蒸水、无水乙醇、过氧化氢、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、EDTA、硫酸亚铁、Tris、SDS、氯仿、75%乙醇、氯化锂、氯化钠、异丙醇、琼脂糖粉、CTAB、异戊醇、水饱和酚、TRNzol-A+总RNA提取试剂（天根公司 产品目录号：DP421）、One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara code：D350A）； SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Tim）（Takara code：DRR081 ）、液氮、研钵、研锤、量筒、烧杯、三角瓶、电泳槽、锡箔纸、保鲜膜、焦碳酸二乙酯、1.5ml离心管、蓝口瓶、药匙、点样缓冲液（Loading buffer）、一次性PE手套、一次性口罩。2.1.2 实验仪器核酸蛋白分析仪：Thermo Scientific ND1000（USA）；高速冷冻离心机：Eppendorf 5417R（Germany）；超低温冰箱：Thermo Scientific Revco ULT（USA）；凝胶成像系统：BIO-RAD Gel Doc 2000（USA）；Real-time PCR仪：BIO-RAD CFX96（USA）；电泳仪：北京六一DYY-12；70烘箱；180烘箱；液氮罐、制冰机、水浴锅等2.2实验方法2.2.1营养液的配制按照Hoagland培养液的配比，配置培养液。成分如下表：全营养液中的大量元素：成分分子量使用浓度(mg/L)全营养液中的大量元素：硝酸钾 KNO3101505硝酸铵 (NH4)2NO38080硝酸钙 Ca(NO3)22361180磷酸二氢钾 KH2PO3136136硫酸镁 MgSO4*7H2O246492全营养液中的微量元素：成分分子量使用浓度(mg/L)微量元素碘化钾 KI166.010.83硼酸 H3BO361.836.2硫酸锰 MnSO4*4H2O223.0122.3硫酸锌 ZnSO4*7H2O287.548.6钼酸钠 Na2MoO4*2H2O241.950.25硫酸铜 CuSO4*5H2O249.680.025氯化钴 CoCl2*6H2O237.930.025铁盐乙二胺四乙酸二钠 Na2EDTA372.2537.3硫酸亚铁 FeSO4*7H2O278.0327.82.2.2玉米种子的处理及萌发选取籽粒饱满、大小均一的玉米种子用3%的H2O2浸泡15min，用蒸馏水将玉米及其残留冲洗干净。于25 蒸馏水中浸泡6-8h。在两层纱布上将玉米种子均匀的摆好，其上再盖一层纱布，用蒸馏水将纱布打湿，等待萌发。期间加水一次，但是水不能太多保持纱布的湿润、倾斜容器水不宜流出即可。2.2.3玉米幼苗的移栽待种子萌发后根部大约1-2cm长时将种子疏松摆放在双层湿润纱布上，注意保证纱布水分充足。当玉米芽长到2cm时，小心用棉花包裹种子，注意留出根部，插入自制玉米水培盆小孔中（直径1cm左右）。于蒸馏水中培养2d后换Hoagland培养液培养至三叶期挑出长势一致的玉米幼苗做处理。2.2.4玉米幼苗的处理玉米幼苗在低浓度盐胁迫下不受到盐害或受盐害较轻，故这时所表现出来的差异不一定是盐胁迫处理的结果。NaCl 溶液浓度小于50mmolL-1（2.922g/L）的盐浓度均不适于作为玉米苗期盐胁迫处理的盐浓度；而当NaCl 溶液浓度大于350mmolL-1(20.454g/L) 时，大部分幼苗均受害严重而死亡；只有NaCl 溶液浓度在50350 mmolL-1 范围内，玉米幼苗受盐害比较明显又不致死。本实验选取生长状况良好、相似的玉米幼苗，每个处理三株幼苗，每株幼苗取较大两片叶子边缘3cm作为材料，在研钵中研磨混匀后取0.1g粉末。设定5%（质量分数）、10%、20%三个梯度处理浓度，设定3h、6h两个时间梯度，并设空白对照。2.2.5 总RNA的提取2.2.5.1 CTAB-LiCl法提取总RNA1.配制CTAB提取液（1.4mol/LNaCl ，2.0%CTAB，0.1mol/LTris pH8.0， 2%PVP，2% -巯基乙醇，0.02mol/LEDTA pH8.0，其中巯基乙醇可在使用前加入）。SSTE(0.5%SDS，1.0mol/LNaCl，10mmol/LTrisRNA提取液中所有溶液都用0.1%DEPC水处理并高压灭菌，含Tris的溶液用高压灭菌后的DEPC水直接配制。2.玻璃制品及研钵等于180度烘烤6h以上，塑料制品等于DEPC水中浸泡1夜后高压灭菌。3.称取0.1g样品置于盛有液氮的研钵中磨成粉末，迅速转入1.5ml离心管中。4.加入CTAB提取液，剧烈震荡混匀，室温静置20min。5.4条件下，12000rcf离心10min，并取上清置于新离心管中。6.每管加入等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻柔颠倒混匀，冰上放置10min。7.4条件下，12000rcf离心10min，并取上清置于新离心管中。每管加入1/20体积4mol/L醋酸钾（pH5.5），1/10体积的无水乙醇，轻柔混匀。再加入相同体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻柔混匀，冰上放置10min。8.4条件下，12000rcf离心10min，并取上清置于新离心管中。9.在上清中加入1/3体积的8mol/L LiCl，使LiCl最终浓度达到2mol/L，4过夜。10.4条件下，12000rcf离心10min，弃上清，用75%乙醇洗沉淀，弃乙醇并加入SSTE缓冲液溶解沉淀，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提，转移上清至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，-20静置2h。11.4条件下，12000rcf离心10min,弃上清，75%乙醇洗沉淀，弃乙醇并在超净台上晾干，加入30mlDEPC水完全溶解，-70保存。2.2.5.2 SDS法提取总RNA1.RNA提取液的配制(50mmol/L Tris pH8.0，150mmol/L LiCl，5mmol/L EDTA，5%的SDS)2.称取0.1g样品置于盛有液氮的研钵中磨成粉末，迅速转入1.5ml离心管中。3.加入1毫升RNA提取液，震荡混匀，直至看不到任何团状沉淀物。4.立即加入500微升水饱和酚/氯仿（1：1），剧烈倒置混匀10min。5.4条件下，12000rcf离心5min，取上清转入新离心管中。6.重复三次步骤5和67.取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀5min。8.4条件下， 12000rcf离心5min，取上清转入新离心管中。9.加入三分之一体积的8mol/L氯化锂，4过夜。10.4条件下， 12000rcf离心10min，弃上清，保留沉淀。11.加入500ml无水乙醇：0.5mol/L氯化钠（7：3）的混合液洗沉淀。12.4条件下，12000rcf离心2min。13.重复12和13步骤2次。14.用75%乙醇洗沉淀2次，以去除盐离子。弃乙醇并在超净台上晾干，加入30mlDEPC水，完全溶解沉淀，-70保存。2.2.5.3 TRNzol-A+法提取总RNA1.称取0.1g样品置于盛有液氮的研钵中磨成粉末，迅速转入1.5ml离心管中，并加入1毫升TRNzol-A+2.将匀浆样品在室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。3.4条件下 13400 rcf 离心10 min，取上清。4.每使用1 ml TRNzol-A+加入200微升氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min5.4条件下13400rcf 离心15 min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500 微升）转移到新管中。6.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 min。7.4条件下13400rcf离心10 min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。8.加入1 ml 75%乙醇（用RNase-Free ddH2O配制）洗涤沉淀。每使用1 mlTRNzol-A+至少 用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。9.4条件下2300rcf离心3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。10.室温在超净台放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30ml RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA，-70保存。2.2.6 MiRNA定量PCR的引物设计在进行miRNA的cDNA合成时使用的试剂盒不仅将RNA反转录为DNA，还在反转录的同时对RNA片段后加入一段80nt左右长短的尾巴，故做PCR扩增时下游引物为通用引物Uni-miR qPCR Primer(Takara code：D352）。上游引物为特异性引物，需要与miRNA结合，故上游引物设计主要原则为miRNA的反向互补序列。为了保证扩增效率，尽量避免连续出现多个相同碱基。2.2.7 MiRNA的cDNA的合成提取总RNA后用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara code D350A），该试剂盒将小RNA的加尾反应与反转录放入一步反应中，可以直接从总RNA中合成小RNA的第一链。试剂盒具体步骤如下：(1)除去总RNA中的DNA按下列组份配制反应液。试剂使用量Total RNA40ug10DNase I Buffer5ulRNase Inhibitor20UDNase I (RNase-free)2ulRNase Free ddH2OUp to 50 ul37反应20min。用50l RNaseFree ddH2O定容到100l后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混匀。室温，13,500rpm离心5min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混匀。室温，13,500rpm离心5min，取上清。加入10l 3M醋酸钠，250l冷乙醇，冰上放置10min。4，13,500rpm离心15min，弃上清。加入500l 70%冷乙醇洗净，4，13,500rpm离心5min，弃上清。沉淀干燥。加入适量RNase Free ddH2O溶解。(2)Poly(A) 加尾反应和反转录反应按下列组份配制反应液。试剂:使用量:2miRNA Reaction Buffer Mixfor Real Time）10l0.1%BSA2lmiRNA PrimeScript RTEnzyme Mix2lTotal RNA（10pg/l到1g/l）1lRNase Free ddH2Oup to 20l反应条件如下： 3760 min（Poly(A)加尾和反转录反应） 855 sec（酶的失活反应）向得到的RT反应液中添加RNase Free ddH2O补足至100l。取2l稀释液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中，进行定量检测。2.2.8 Real Time PCR 反应在冰上按下列组份配制PCR反应液。试剂:使用量:SYBR Premix Ex TaqTMI