「用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法【参考模板】」.doc

公开号CN101461772 A发布类型申请专利申请号CN 200910067634公开日2009年6月24日申请日期2009年1月7日优先权日2009年1月7日公开号200910067634.8, CN 101461772 A, CN 101461772A, CN 200910067634, CN-A-101461772, CN101461772 A, CN101461772A, CN200910067634, CN200910067634.8发明者李文忠, 欧来良申请人天津欧瑞生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan被以下专利引用 (1), 分类 (2), 法律事件 (3) 外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet)用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法CN 101461772 A摘要本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分泌因子的制备方法。包括细胞分离、干细胞的扩增、干细胞因子体系的获取和浓缩、贮存得到含有干细胞活性因子体系。该体系包括目前已鉴定的各型干细胞所分泌的活性因子。本发明所得的干细胞活性因子体系中不含外来的培养液成分，也不含有死细胞裂解成分。并可以长期保存而维持组织和细胞修复活性。使干细胞美容真正从理想走向了现实。在生物医学的深度对传统美学观念进行了提升。同时该发明简单易行，适宜于大规模生产，为干细胞服务于美丽事业提供了一条捷径。权利要求(6)1、一种用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于包括的步骤：1)分离干细胞：从人或哺乳动物相应组织中分离出干细胞；2)干细胞的扩增，用相应干细胞的常规培养方法，包括a-MEM培养基，加入10的胎牛血清，5CO2，37条件下培养，定期换液，传代，进而得到所需数量的干细胞；3)干细胞因子体系的获取：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液(磷酸缓冲液，pH7.4左右)清洗1-3次，然后加入PBS或生理盐水，细胞培养箱中培养4-24小时，收集上清液，即可得到富含干细胞生长因子体系的溶液；4)浓缩、贮存：所得液体离心，除去散落细胞，浓缩，按1106个细胞/毫升的浓度进行浓缩，得产品，可于-20长期保存，以备使用。2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的来源于干细胞所分泌的干细胞 因子体系，该体系包括该体系包括干细胞因子、内皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、 肿瘤坏死因子肝细胞生长因子、神经生长因子、纤维母细胞生长因子、胰岛素样成长因 子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素；此外，干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白， 包括I、 II、 III、 IV型胶原蛋白，以及各种溶菌酶。3、 根据 权利要求1所述的方法，其特征在于所述的千细胞因子体系是指：来源于 人或哺乳动物胚胎干细胞、脐血干细胞、骨髓千细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、外周 血干细胞、脂肪干细胞，也可泛指所有的干细胞。4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所得的产品作为活性成分配以医学上 接受的溶解液构成组合物的产品，直接用于美容、护肤，包括、美容、祛斑、修复疤痕。5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所得的产品作为活性成分可以添加到 各种制剂的美容护肤产品中，包括除皱、美容、祛斑、修复疤痕。6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所得的产品用于美容、护肤产品中的 针剂、面霜、乳液、水液制剂，包括清洁霜、清洁乳、清洁皂、面膜、化妆水、按摩膏、 乳液、营养霜、关容霜、粉底或粉饼。说明用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法技术领域本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分泌因子的制备方法。该干细胞分泌的 复合因子，可被应用于美容化妆品、保健品、护肤品。 背景技术干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，根据来源的不同可以分为胚胎干细胞和成 体干细胞。胚胎干细胞可以分化为身体的任何一种细胞，所以也叫全能干细胞。成体干 细胞是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，能在适宜的环境中分化成与其定位相宜 的细胞系，又称为多能干细胞。干细胞在特定的环境中可以定向分化，从而达到修复组织 和细胞损伤的作用。本发明者研究表明（Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function, Stem Cells, 2007 Aug;25(8):2118- 27.)干细胞可以通过分化为特 定的细胞来修复组织，而旁分泌作用在组织的修复中发挥了更大的作用。也就是说，在 千细胞治疗组织损伤的时候，干细胞分泌的细胞因子发挥了极为重要的作用。该体系包 括干细胞因子（SCF)、内皮细胞生长因子（VEGF)、表皮细胞生长因子（EGF )、肿瘤坏 死刮子（TNF)肝细胞生长因子（HGF )、神经生长冈子（NGF )、纤维母细胞生长因子 (F;F )、胰岛素样成长因子（IGF )、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、白细胞介素（IL) 等20余种。其中干细胞因子（Stem Cell Factor, SCF)不仅是维持生命活动所需要的， 而且在抵抗电离辐射对机体的作有及修复辐射所致损伤中都是必不可少的。此外，干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白（如i、 ii、 m、 V型胶原蛋白）以及各种溶菌酶等。表皮千细胞是皮肤更新的种子细胞。每天都有大量的表皮细胞死亡脱落，也会有相 应数量的新生细胞加以补充。随着人们年龄的增加，皮肤出现斑点，皱纹也逐渐增多， 表皮失去了往昔的光彩，这一切皆源于表皮干细胞再生能力的减退，如何使表皮干细胞 保持旺盛的新陈代谢能力，将是保持皮肤健康美丽的关键所在。基于人们对美丽的需求，干细胞美容技术及其相关产品的丌发R益受到业界的重 视。目前市场上出现了很多所谓的干细胞产品，从技术角度上并不具备实施的可行性。 中国专利CN1817339A、N1872025A和CN1817339A专利涉及产品的内容使用了活性干细胞和 中药组分，首先如何在护肤品种保持干细胞的活性？其次如何避免干细胞坏死后产生毒 素对人体的损害？这些都是值得探讨且很难以解决的问题。CN1872025A采用细胞破碎技 术，以及正常状态下的细胞培养技术来获取干细胞活性组分。这种获取干细胞活性组分 的方法缺乏依据。就如你砍碎了苹果树你并不会得到苹果？粉碎了细胞只是得到了细胞 片断。常规来讲在正常生长状态下，所获取的细胞培养上清液，上清液中包含更多的是 代谢废物，同时采用a-MEN(其中添加有激素如地塞米松）培养基，如何有效除去其中的激 素，都是其所面临的问题。3目前市场上也有在芙容护肤产品中添加生长因子如bFGF和EGF的，而细胞的更新是 一个系统的过程，单一生长因子的添加在某种程度上虽可以刺激细胞的代谢，但也容易 造成依赖性。综上可以看出，基于干细胞的美容疗法具有广阔的前景，但如何科学、有效地利用 干细胞的独特性能，开发出真正意义上的干细胞美容护肤产品，仍让是一个崭新的课题。发明内容本发明的目的在于提供一种用于关容护肤的干细胞分泌因子的制备方法，干细胞分 泌因子可用于关容护肤的产品。本发明提供的用于关容护肤的千细胞分泌因子的制备方法包括的歩骤：1) 采用常规的细胞分离方法，从人或哺乳动物相应组织中分离出干细胞。2) 干细胞的扩增，用相应干细胞的常规培养方法，包括a-MEM培养基，加入10% 的胎牛血清，5%C02， 37C条件下培养，定期换液，传代，进而得到所需数量的干细胞。3) 干细胞因子体系的获取：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS 缓冲液（磷酸缓冲液，pt7.4左右）清洗l-3次，然后加入PBS或生理盐水，细胞培 养箱中培养4-24小时。收集上清液，即可得到富含干细胞生长因子体系的溶液。4) 浓缩、贮存：所得液体离心，除去散落细胞，浓缩，按lXl()个细胞/ml的浓度浓 缩，得产品，于-2(TC长期保存，以备使用。本发明所述的来源于干细胞所分泌的干细胞因子体系，该体系包括干细胞因子 (SCF)、内皮细胞生长因子（VEGF)、表皮细胞生长因子（EGF )、肿瘤坏死因子（TNF) 肝细胞生长因子（HGF )、神经生长因子（NGF )、纤维母细胞生长因子（FGF )、胰 岛素样成长因子（K;F )、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、白细胞介素（IL)等。此外， 干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白（如I、 II、 III、 iV型胶原蛋白）以及各种溶菌酶等。本发明所述的干细胞因子体系是指：来源于人或哺乳动物胚胎干细胞、脐血干细胞、 骨髓干细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、外周血干细胞、脂肪干细胞等，也可泛指所有 的干细胞。本发明所得的产品作为活性成分配以医学上接受的溶解液构成组合物的产品，直接 用于美容、护肤方面的用途，包括除皱、美容、祛斑、修复疤痕等。本发明所得的产品作为活性成分可以添加到各种制剂的美容护肤产品中。用于美 容、护肤方面的用途，包括除皱、芙容、祛斑、修复疤痕等。本发明所得产品可以用于美容、护肤产品中的针剂、面霜、乳液、水液或常用化妆 品中的各种制剂，以及按照用途分类的护肤及关容的各类产品，包括但不限于清洁霜、 清洁乳、清洁皂、面膜、化妆水、按摩膏、乳液、营养霜、美容霜、粉底或粉饼等。本发明所得的干细胞活性因子体系中不含外来的培养液成分，也不含有死细胞裂解成分。并可以长期保存而维持组织和细胞修复活性。本发明利用干细胞多向分化和强大 的自我复制能力，体外大量扩增干细胞。依据干细胞复合因子体系具有促进表皮干细胞 增殖、促进皮肤新陈代谢，增强皮肤细胞的活力，促进细胞物质成分交换的作用，来增 强皮肤对其他营养物质的吸收，以及机体内代谢废物的排放。采用干细胞在无血清条件 下的分泌效应，得到不含细胞培养基和细胞组分的干细胞因子复合体系。由于本发明不 含外来培养基和细胞组分，从而避免了外来添加剂和细胞裂解毒素对皮肤造成的伤害。 使干细胞美容真正从理想走向了现实。在生物医学的深度对传统美学观念进行了提升。 同时该发明简单易行，适宜于大规模生产，为干细胞细胞服务于美丽事业提供了一条捷 径。具体实施方式 实施例l小鼠胚胎干细胞：来源于南丌大学生物中心ES细胞的培养与扩增:取lml胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)，细胞浓度约 为1X10个细胞A)，注射器或吸管吹打数次，以保证为单细胞悬液，将细胞铺于有原代 小鼠胚胎成纤维细胞（Mt:F)的培养瓶中，ES维持培养基（天津联呈生物技术有限公司） 10inl培养，过夜培养后更换培养液，2-3天后，消化、传代，再培养。反复以上操作，以 得到足够数量的ES。干细胞活牲因子的制备：在ES细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶70-80%面积），弃 去培养基，用PBS (或生理盐水）清洗2-3次，然后加入10mlPBS，继续培养24小时。取上 清，离心，得富含干细胞因子体系。细胞消化、计数：用磷酸缓冲溶液（PBS)轻轻冲洗培养瓶中细胞1一2次，添加3ral 消化液（025%胰蛋白酶、002%RDTA)， 37。C保温2-3分钟，显微镜下观察细胞己经分离， 加入含血清DMEM培养基，吹散细胞，1500转/分钟离心5分钟，弃上清，加入5mlPBS，充 分吹散细胞，进行细胞计数，按lml上清液/lX10个细胞的浓度浓缩上清液。干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并），置-2(TC 冰箱，可长期保存，备用。实施例2本实施实例提供了骨髓来源的干细胞因子体系的制备过程，具体如下： 1.原代骨髓干细胞的获取：取健康人骨髓10ml， PBS稀释至20ml，通过Ficoll密 度梯度离心获得骨髓单核细胞，根据MSCs具有倾向于粘附在聚苯乙烯表面上的特性，使 MSCs与造血细胞分离。培养3天以后开始出现小的细胞集落。约7-9天后细胞达到饱和， 此时进行传代。传代3h后细胞即完全贴壁，2天后，细胞呈现典型的成纤维细胞样形态， 均匀分布在培养瓶内。3 4天后细胞密度即达到80 90%。2. 细胞的扩增：细胞密度达到80 90%时，用磷酸缓冲溶液（PBS)轻轻冲洗培养 瓶中细胞1 一 2次，添加3ml消化液（025%胰蛋白酶、002%RDTA) ， 37。C保温2-3分钟， 显微镜下观察细胞已经分离，加入含血清a -MEM培养基，吹散细胞，按1瓶细胞传代3 瓶的比例进行传代，2天后更欢培养液，再细胞密度达到80_90%时，反复以上操作， 以得到足够数量的骨髓干细胞。3. 干细胞活性因子的制备：在骨髓间充质干细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶 70-80%面积），弃去培养基，PBS或生理盐水清洗2-3次，然后加入10mlPBS，继续培养24 小时。取上清，离心，得富含千细胞因子体系。消化细胞，进行细胞计数，按lml上清液 /1 X IO个细胞的浓度浓缩上清液。4. 干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并），置-20 C冰箱，可长期保存，备用。实施例3本实施例提供了表皮干细胞活性因子体系的制备过程，具体如下：细胞来源：来源于健康人的皮片（或新生儿包皮）。细胞的分离培养方法：按常规方法进行培养，具体可参照（参见张卓然主编的培 养细胞学与细胞培养技术）。干细胞活性因子的制备：在表皮干细胞生长