色谱质谱联用技术在代谢组学中的应用.doc

2009年 9 月S ep tem b e r 2009色谱V o l. 27 N o. 5566572C h in ese J ou rn a l of C h rom a tog ra ph y色谱 2质谱联用技术在代谢组学中的应用许国旺 3黄强 ,尹沛源 ,路鑫 ,孔宏伟 ,(中国科学院大连化学物理研究所 , 中国科学院分离分析化学重点实验室 , 辽宁 大连 116023 )摘要 :代谢组学是对生物体受外部刺激所产生的小分子代谢产物的变化或其随时间的变化进行研究的一门学科 ,以实现对体液 、细胞以及组织提取物等复杂的生物样本中所有代谢产物的定性和定量分析为研究目标 。色谱 2质 谱联用技术在代谢组学的研究中已显示出极大的发展潜力 。本文主要综述近年来代谢组学研究中涉及的色谱 2质 谱联用技术及其数据处理方法 , 重点介绍各种分离技术的特点及其在应用中的关键问题 , 并对其在代谢组学应用 中的未来发展给予展望 。关键词 :色谱 ; 质谱 ; 代谢组学 ; 代谢谱中图分类号 : O 658文献标识码 : A文章编号 : 1000 28713 ( 2009 ) 0520566207栏目类别 :专论与综述A p p l ic a t io n s o f c h r om a t o g r a p h y 2m a s ssp e c t r om e t r y in m e t a b o n om ic s3HU AN G Q ia n g, YIN P e iyu a n, LU X in, KO N G H o n gw e i, XU G u ow a n g( CAS K ey L a bo r a to r y of S ep a r a t i on S c i en ce fo r A n a ly t i ca l C h em i s t r y, D a li a n In s t i tu te of C h em i ca l P h y s i cs,th e C h i n es e A ca d em y of S c i en ces, D a li a n 116023, C h i n a )A b s t r a c t : M e ta b o n om ic s ( o r m e ta b o lom ic s ) is o n e o f p la tfo rm s fo r fu n c t io n ge n om ic s a n d s ys 2tem s b io lo gy. M e ta b o n om ic s fo c u s e s o n th e c h a n ge s o f low m o le c u la r m a s s m e ta b o lite s in c om 2 p le x s am p le s s u c h a s b io f lu id s, c e lls a n d t is s u e / t is s u e e x t ra c ts. A lth o u gh it h a s n o t b e e n p o s s i2 b le fo r qu a n t ita t ive m e a s u rem e n ts o f g lo b a l m e ta b o lite p ro f ilin g, th e c om b in a t io n o f c h rom a to g2 rap h y 2m a s s sp e c t rom e t ry a n d c h em om e t r ic s h a s s e c u re d a c e n t ra l ro le in m e ta b o n om ic s re 2 s e a rc h. H e re, ap p lic a t io n s o f c h rom a to g rap h y 2m a s s sp e c t rom e t ry in m e ta b o n om ic s a re re v iew e d, th e a d va n ta ge s a n d d is a d va n ta ge s o f va r io u s s ep a ra t io n te c h n iqu e s in c lu d in g ga sc h rom a to g rap h y, liqu id c h rom a to g rap h y a n d c ap illa ry e le c t rop h o re s is a re em p h a s ize d, th e ir fu r2th e r d e ve lopm e n ts in m e ta b o n om ic s f ie ld a re p ro sp e c te d.K e y w o r d s : c h rom a to g rap h y; m a s s sp e c t rom e t ry; m e ta b o n om ic s /m e ta b o lom ic s; m e ta b o lite p ro f ilin g近年来 , 随着系统生物学的迅猛发展 , 研究者已开始注重从生物系统的整体性分析入手 , 了解复杂 的生命过程 , 寻找疾病的早期诊断和治疗方法 。代 谢组学 (m e ta b o n om ic s, 即 m e ta b o lom ic s ) 1, 2 是继 基因 组 学 ( ge n om ic s ) 、转 录 组 学 ( t ra n s c r ip tom 2 ic s ) 、蛋白质组学 ( p ro te om ic s ) 之后系统生物学的 主 要 研 究 平 台 , 并 逐 渐 成 为 生 命 科 学 的 研 究 热 点 3, 4 。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰 动后 (如将某个特定的基因变异或环境变化后 ) 其 代谢产物的变化或其随时间的变化 , 来研究生物体 系的代谢途径的一种 技 术 1 。其研 究目 标 是对 体 液 、组织 、细胞等生物样本中相对分子质量 (M r ) 为1 000以下的所有小分子代谢物进行定性和定量分析 , 从而得到生物体受外界刺激后其代谢水平的整 体变化的结果 5 - 9 。代谢组学研究的基本流程包括样品采集 、预处理 、代谢组分析 、数据分析以及研究结果的解释与应 用等 10 。代谢组学的样品预处理和分析技术要尽 量满足对代谢组分的高灵敏度 、高通量 、无偏性的要 求 , 并减少基质的干扰 11 - 13 。完整的样品预处理方 法包括样品快速转移 、淬灭 、代谢物定量提取以及最 合适的样品预处理条件等 12 。与基因组学不同 , 代谢组学样品中代谢物的数 目通 常 未 知 , 如 在 人 类 中 , 代 谢 物 的 数 目 可 能 在3 通讯联系人 : 许国旺 , 研究员 , 博士生导师. Te l: ( 0411 ) 84379530, E 2m a il: x u gw d icp. a c. c n.基金项目 : 国家自然科学重点基金项目 (N o. 20835006 )和面上基金项目 ( N o. 20675082 ) .收稿日期 : 2009 208 2263 000100 000之间 14 。不仅如此 , 代谢物的浓度分布范围也很宽 , 有 7 9个数量级 。由于分析样品 数目多 、差异大 、浓度分布范围广 、组成复杂 , 目前尚 没有能够完全满足高灵敏度 、高分辨率和高通量的无歧视性的代谢物分析平台 , W is h a r t 等 15 认为目前的任何一种分析技术一次分析只能获得占全部代 谢物数量 10 %15 %的代谢物信息 。要实现普遍适 应性和特殊选择性的有机结合 , 需要多种分析技术 的互补 16 - 18 。目前主要采用的分析技术有核磁共 振谱 (NM R ) 、质谱 (M S ) 、色谱 、光谱等 19 - 22 。色谱 与质谱的联用结合了两者的优势 , 因而在代谢组学 研究中已成为重要的分离分析技术 23, 24 。本文试图通过选择典型实例 , 综述近年来色谱 2 质谱联用技术在代谢组学研究中的应用及其最新的 研究进展 。一步的分 离 , 所 有 组 分 从 第 二 根 色 谱 柱 进 入 检 测器 35, 36 。G C G C 有别于中心切割 的 二维 气相 色 谱 ( G C + G C ) 。G C + GC 是把第一根色谱柱流出的 部分馏分转移到第二根色谱柱上进行进一步分离 ,峰容量是两根柱的峰容量之和 ; 而 G C G C 是两根柱的峰容量之积 , 因而大大提高了分离系统的分辨 率 。由于 G C G C 在第二维上的分离非常快 , 一般 使用 F ID 做检测器 , 与质谱联用时仅 TO F M S 能够 实现快速扫描 。G C GC 越来越多地应用于石油化工 、环境保护 、药 物 开 发 、植 物 研 究 等 复 杂 样 品 的 分 离 分 析 。V a z 2F re ire 等 37 用顶 空固 相微 萃 取 方 法 处 理 得 到橄榄油中的芳香化合物 , 用 GC G C 2TO F M S 检测 得到指纹图谱 。基于 G C G C 2TO F M S 技术平台 ,我们 38 分析了糖尿病患者和正常人的血浆代谢谱 ,峰匹配后用正交信号滤噪 2偏最小二乘法辨别分析 法 (O SC 2PLSD A )找到了在糖尿病患者中浓度明显 变化的葡萄糖等 5 种潜在标志物 。 Ko e k 等 39 通过 实验证明 , 在代谢组学研究中应用 G C G C 2M S 可 以减少基质干扰 、增大峰容量 , 与采用一维 G C 2M S1 气相色谱 2质谱联用 ( G C 2M S )气相色谱作为一项成熟的分析技术可连接多种 检测器 , 在代谢组学中以火焰离子化检测器 ( F ID ) 和质谱检测器最为常见 。质谱检测器可以通过标准 谱图库提供化合物结构信息 , 并具有高灵敏度等优 势 , 因而非常适合于代谢组学的研究 。对极性强 、挥 发性低 、热 稳 定 性 差 的 物 质 需 要 衍 生 化 后 再 进 行 G C 2M S 分析 25 。衍生化不仅可以改善分析对象的 挥发 性 、峰 形 、分 离 度 , 也 可 提 高 检 测 的 灵 敏 度 26 - 29 。W in d e r等 30 用气相色谱 2飞行时间质谱 ( G C 2TO F M S )技术对大肠杆菌提取物进行了全组 分分析 , 建立了细胞淬灭和胞内物质提取的评价方 法 , 证明统计分析方法和实验结合才能实现胞内物 质的精确定量 。D in g 等 31 利用 G C 2TO F M S 测定 工业酒精连续发酵和一次性发酵过程中酵母细胞内代谢物质的差异 , 分别检测到 143 和 128种化合物 。 在转基因水稻研究中 , 我们 32 用 GC 2F ID 分析野生 型和转基因 型水 稻 代谢 表型 的差 异 , 用 G C 2M S 鉴 定了在转基因和环境影响下水稻中含量均有显著性 差异的代谢物 , 对转基因水稻的安全性进行了初步 的研究 。类似地 , 我们应用 G C 2M S 技术也进行 了 转基因青蒿各生长阶段代谢表型的研究 , 发现了转 基因青蒿代谢物发生显著变化的时期 , 实现了代谢 组学的动态分析 33, 34 。在对复杂样品进行分析时 , 由于峰容量的限制 , 一维色谱很难达到理想的分离效果 , 多维色谱是改 进分辨率的办法之一 。全二维气相色谱 ( G C G C ) 把分离机理不同而又相互独立的两根色谱柱以串联方式连接在一起 , 这两根色谱柱之间装有一个调制器 (调制器起捕集再传送的作用 ) , 经第一柱分离的 组分由调制器聚焦后以脉冲方式进入第二柱进行进相比 , GC G C 2M S 更适合于生物样品的定量分析 。可以预期 , G C GC 技术将会在复杂混合物的分离分析尤其是代谢组学的研究中发挥更大的作用 。2 液相色谱 2质谱联用 (L C 2M S )高效液相色谱 ( H PLC ) 具有分离效率高 、分析 速度快 、应用范围广等特点 , 与 G C 相比 , 不受样品 挥发性和热稳定性影响 , 是一种更加普适性的分析 手段 。当其与 M S 联用时 , 能够集 H PLC 高分离性 能和 M S 高灵敏度 、高专属性的优点于一体 , 且具有 提纯和制备单一物质的能力 。与 GC 相比 , 样品可 以在简单的预处理之后直接用 H PLC 进行分析 , 避 免了衍生化等繁杂的预处理 。目前 , LC 2M S 技术已发 展 成 为 代 谢 组 学 研 究 的 主 流 技 术 手 段 21, 40 - 42 。O g is o 等 43 建立了反相液相色谱 ( R PLC ) 2M S 测定磷脂酰肌醇磷酸盐的方法 , 分析了 A 431 细胞中表 皮生长因子诱导分子水平的代谢变化 , 该方法具有灵敏度高 , 检测范围宽等优点 。我们 44 用反相液相 色谱 2离子阱 2傅里叶变换质谱 ( R PLC 2Io n 2T rap 2F T2M S )方法测定 p 53 基因突变模型老鼠的血浆 , 一次 进样能检测出超过 160种磷脂 。反相色谱方法是分析非极性和中等极性化合物 的常规手段 , 但反相色谱柱对强极性的化合物无法 保留 , 损失了这些强极性样品的信息 , 此时可选择亲水相互 作 用 色 谱 ( H IL IC ) 代 替 常 规 的 反 相 色 谱 。H IL IC 是一种以极性固定相 (如硅胶或衍生硅胶 )及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的568色谱第 27卷色谱模式 , 特别适用于强极性和强亲水性小分子物质的分离 。H IL IC 对复杂样品中的极性物质具有很 好的灵敏度和选择性 , 已经被广泛应用于代谢组学研究中 。 C u b b o n 等 45 综 述了 H IL IC LC 2M S 在 代谢组学应用中的 固 定相 种类 、特 点 、数据 处 理方 法 等 , 并对其发展前景进行了展望 。 T K in d t 等 46 比较了 H IL IC 和传统的反 相色 谱 柱在 植物 研 究中 的 分析结果的差异 , 发现两者的保留能力相当 , 但采用 反相色谱法色谱峰峰面积变化较 H IL IC 大 5 %, 由此证明 H IL IC 在代 谢 组学 研究 中 的应 用潜 力 。由 于R PLC 和 H IL IC 的不同选择性 , 因此这两种方法同1 ) 47 。时使用可 以 大 大 增 加 代 谢 物 的 信 息 (见 图在 慢 性 肝 炎 诱 导 的 肝 硬 化 和 肝 癌 研 究 中 , 利 用R PLC 和 H IL IC 分别与质谱联用 , 我们 48 检测了人体血清中非极性和极性化合物 , 鉴定出甘氨胆汁酸 、甘氨鹅胆酸 、牛磺胆酸和牛磺鹅去氧胆酸 4 种肝硬化潜在标志物以及二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇 2种肝 癌潜在标志物 。图 1 采用 ( a ) R PL C 和 ( b ) H IL IC 分离尿中代谢物的典型总离子流色谱图 47 F ig. 1 T yp ic a l u r in a r y t o t a l io n c h r om a t o g r am s o f u r in a r y m e t a b o l i t e s b y ( a ) R PL C a n d ( b ) H IL IC 47 S e ve ra l m e ta b o lite s m a rk e d w ith a n a r row w e re n o t re ta in e d o n a re ve rs e d 2p h a s e c o lum n b u t w e ll s ep a ra te d o n a h yd rop h ilic in te ra c 2t io n c o lum n.代谢组学研究的生物样品成分相当复杂 , 各类物质的极性 、亲水性 、解离度 、含量等差异极大 。采 用一维液相色谱 ( R PLC 或者 H IL IC ) 和质谱联用往 往无法提供足够的峰容量 。想要增大峰容量 , 在特 定条件下尽可能多的对有响应 的代 谢产 物 进行 分 析 , 就要增大分离维 数 , 二维 液 相色 谱也 就 应运 而生 。传统的二维液相色谱采用“中心切割 ”( h e a r t2 c u t t in g )技术 , 将第一维色谱柱 分离 出的 感 兴趣 的 组分切入第二维进行进一步的分离 。这种模式的流 路比较简单 , 但不能得到第一维洗脱产物全部组分 的信息 , 适用于靶标分析 。较有前途的是全二维液 相色谱 (LC LC ) , 它采用分离基质不同的二维色 谱柱 (反相柱 、亲水柱 、离子交换柱 、亲和色谱柱等 )组合构成分离系统 , 通过特殊设计的接口 , 将第一维色谱分离出的所有组分间隔有序地引入第二维色谱 进一步分离 。借助此体系 , 我们应用 H IL IC H IL IC 系统鉴定出商品化皂树皂甙提取物中的 46 种单体组分 , 其中 8 种此前未见报道 49 。 除了采用全二维的方式改进分辨率外 , 采用不同选择性的色谱柱组成的多维系统也可拓展分离窗 口 。我们用 第 一维 H IL IC 柱和 第二 维 反相 色谱 柱 构建了在线柱切换模式的二维液相色谱系统 (见图2 ) 50 。用 25种混合标样 ( 12 种亲水 、13种疏水 )验证了系统的可靠性 , 与一维 H IL IC 分析尿样的结果 相比检测到了更多的物质 (见图 3 ) 。将这一系统用于研究人参皂甙 R g3 对荷瘤大鼠尿代谢的影响 , 发现 17 个与药物作用有关的代谢物 , 推测 R g3 可能在细胞分化 、生长抑制以及凋亡等过程中具有重要 的生理意义 51 。除了 多 维 色 谱 外 , 也 可 采 用 超 高 效 液 相 色 谱(U PLC )改善极端 复 杂的 样品 的 分离 状况 。U PLC相对于 H PLC 更高效 、快速 、灵敏 , 和质谱联用时基质干扰 减 少 , 从 而 可 提 高 质 谱 的 检 测 灵 敏 度 52 。P lum b 等 53 用 超 高 效 液 相 色 谱 2电 喷 雾 离 子 质 谱(U PLC 2ES I2M S )检测得到小鼠和狗的胆汁代谢轮 廓图 , 分辨率大大提高 , 峰展宽变小 , 缩短了分析时 间 。可以看出 U PLC 相对于普通 H PLC 更加适合与 M S 联用 。利用 U PLC 2M S 技术 , 我们 54 - 57 对人和 动物血浆 、尿液的代谢组学进行了研究 。我们 56 用U PLC 2M S 技术检测慢性肾衰病人和正常人血浆的 代谢差异 , 经过数据处理和 M S /M S 定性 , 鉴定出肌 酐 、色氨酸 、苯丙氨酸 、犬尿酸和 3 种溶血磷脂酰胆 碱类化合物是慢性肾病的潜在标记物 。通过研究代 谢通路来解释病发原因 , 为临床诊断和防治提供了 有力依据 。除了代谢物的分离检测外 , 未知代谢物的定性图 2 可连续 、在线分离极性和非极性化合物的全自动柱切换 H PL C 系统装置图 50 S c h em e o f t h e f le x ib le , f u l ly a u t om a t ic c o lum n 2 sw i t c h in g H PL C s y s t em f o r t h e s e q u e n t ia l, o n 2 l in e s e p a r a t io n o f p o la r a n d a p o la r c om p o u n d s2F ig. 14 55 也是代谢组学发展的一个瓶颈。我们建立了一 个 基 于 超 高 效 液 相 色 谱 2四 极 杆 飞 行 时 间 质 谱(U PLC 2Q 2TO F M S )技术对代谢物结构鉴定的集成( T h e f ig u r e is r e p r o d u c e d f r om w i t h p e rm is s io n )l i t e r a t u r e 50 图 3健康雄性大鼠尿样用 ( a ) 在线的 H IL IC 2M S 单柱测定和 ( b )在线的 H IL IC / R PL C 2M S 柱切换全二维系统测定的基峰色谱图F ig. 3 B a s e p e a k c h r om a t o g r am s (B P C ) o f u r in e o f a h e a l t h y m a le S p r a g u e 2D aw le y r a t o n ( a ) a s in g leH IL IC c o lum n a n d ( b ) t h e H IL IC / R PL C c o lum n sw i t c h in g H PL C 2E S I 2M S s y s t emTh e s ign a ls w e re re c o rd e d b y a Q t rap lin e a r io n t rap m a s s sp e c t rom e te r. Th e f igu re is rep ro d u c e d f rom lite ra tu re 50 w ithp e rm is s io n.570色谱第 27卷谢物的识别非常有帮助 , 如人类代谢组数据库 58 ,其代谢物的数据已扩增到 6 826个 , 其中的 4 413 个 含体 液 或 组 织 中 浓 度 的 数 据 , 790 个 化 合 物 有NM R、LC 2M S 和 GC 2M S 数据 。方案 , 该方案综合运用了 LC 2M S 技术 、F TM S 技术 、G C 保留指数 、微制备技术等各种分析手段 , 不仅可 鉴定潜在的生物标志物 , 而且可区分异构体 。表 1给出了目前常用的代谢组学数据库资源 , 它们对代表 1 代谢组学中最常用的数据库T a b le 1 R e p r e s e n t a t iv e d a t a b a s e s u s e d in m e t a b o n om ic sD a ta b a s eIn te rn e t s iteC o n te n tGC /M S, LC /M S , a n d M ALD I2M S, M S /M S sp e c t ra, c h em ic a l c om p o u n d s t ru c tu re sLC /M S , LC /M S /M S , F T 2M S sp e c t ra o f m e ta b o lite s, d ru gs a n d d ru g m e ta b o 2lite s, c h em ic a l c om p o u n d s a n d s t ru c tu re s, re te n t io n t im e s, lin k s to KEGGc h em ic a l n am e s a n d s t ru c tu re s, b io a c t iv it ie s d a ta a n d s t ru c tu re 2a c t iv ity re la t io n s h ip , lin k s to E n t re z d a ta b a s em e ta b o lite s in th e h um a n b o d y, NM R , GC 2M S a n d M S /M S d a ta, c lin ic a l, m o le c u la r b io lo gy a n d b io c h em is t ry, c h em ic a l s t ru c tu re s, m e ta b o lic p a thw a ys, lin k s to KEGG a n d P u bC h emm e ta b o lic a n d re gu la to ry p a thw a ys, p ro te in in te ra c t io n a n d re a c t io n n e tw o rk sM a s sB a n kh t tp : /w w w . m a s s b a n k. jp / in d e x. h tm lh t tp : /m e t lin. s c r ip p s. e d u /m e ta b o _s e a rc h. p hph t tp : / p u b c h em . n c b i. n lm . n ih. go v /M E TL INP u bC h emHMDBh t tp : / hm d b. c a /( H um a n M e ta b o lom e D a ta b a s e )KEGGh t tp : /w w w . ge n om e. jp / k e gg / liga n d. h tm l fo r m e ta b o lism , h um a n d is e a s e s, d ru gs, c h em ic a l c om p o u n d s 态变化 , 并阐明其生物学功能 , 为认知生物系统组成的复 杂 相 互 关 系 提 供 了 依 据 。 S aw a lh a 等 64 用 C E 2M S /M S 对甜味和苦味 橘皮 提取 物 中的 黄酮 类 代谢物进行了定性和定量分析 , 提供了获取天然黄3 毛细管电泳 2质谱联用 ( C E 2M S )毛细管电泳与色谱相比 , 具有仪器简单 、分离效 率高 、分析速度快 、溶剂消耗少 、应用范围广等特点 。 C E 与 M S 联用提高了检测灵敏度 , 在一次分析中可 同时得到迁移时间 、M r和碎片特征信息 。由于分离 机理和色谱不同 , C E 2M S 在生物样品研究中可作为 色谱技术的补充 , 特别适合于离子性代谢物的分析 。C E 2M S 的接口技术是影响整个检测的关键因 素之一 。 H a s h im o to 等 59 建立了用于 C E 2M S 的同 轴液体 鞘 流 微 电 喷 雾 ( m ic ro ES I) 界 面 接 口 技 术 。S o ga 等 60 在鞘流接 口 C E 2M S 检测 阴离 子 代谢 物 研究中 , 毛细管末端采用铂金包裹的 ES I喷雾针 , 防 止了喷雾针被氧化和腐蚀 。 C h a lc ra f t 等 61 建立了 用计算机多维变量模型实现 C E 2M S 对代谢物的定 量分析 , 该方法无需化学试剂 , 可对离子化效率进行 预测 , 消除了存在不挥发性盐和离子抑制等基质干 扰的影响 。随着接口技术的发展 , C E 2M S 在代谢组学中的 应用越来越广泛 。微生物代谢 , 尤其是能量代谢过 程中的代谢产物几乎都是离子性化合物 , 用 C E 2M S 进 行 分 析 有 其 独 特 的 优 势 。O h a s h i 等 62 建 立 了C E 2M S 分析组氨酸缺乏的大肠杆菌代谢物动态变 化的方法 。根据已有数据库和文献鉴定出 375 种代 谢物并对其中的 198 种进行定量分析 , 解释了细胞 内糖酵解 、三羧酸循环 、氨基酸和核苷酸生物合成等 能量代谢过程的代谢通路 。 C E 2M S 在植物细胞中 的阴 、阳离子化合物的代谢组学研究方面也有相应 应用 。 S a to 等 63 用 C E 2M S 和 C E 2D AD (二极管阵 列检测器 ) 分析水稻叶子中 56 种碱性代谢物的动 65 酮的新途径 。L e va n d i等 用 C E 2M S 研究比较了 3种 B t (B a c illu s Th u r in g ie n s is ) 2转基因玉米和普通玉 米代谢物的差异 ,发现了一些有明显差异的代谢物 。将 C E 2M S 技术用于疾病诊断和生物标志物的发现 , 只需对体液和组织等极端复杂的生物样品进 66 行简单的预处理就可以直接进样 。 H ira yam a 等用 C E 2TO F M S 对癌症病人的结肠和胃肿瘤中带电代谢物进行了全面分析 。在结肠和胃中分别定量检 测到 94 和 95 种代谢物 , 并对其中具有癌症特异性 的代谢物的代谢特征进行了代谢途径分析 。4 基于色谱 2质谱联用技术的代谢组学的数 据处理色谱 2质谱联用技术分析得到的原始数据不能 直接用于化学计量学分析 。因此需要对这些原始数 据进行预处理 , 将其转变为适合多变量分析的数据 形式 。目前多数厂商的色谱 2质谱联用仪器都配备 了基本的数据处理功能 , 包括滤噪 、重叠峰解析 、峰 匹配以及归一化等 。分析过程中 , 仪器的自身状况 以及参数变化会使样品的保留时间发生漂移 ; 为了 使不同色谱图的峰可以辨识比较 , 需要对色谱图进 行峰 匹配 。 S iu zd a k 等 67 发 展了 XCM S 软 件 并 用 其对质谱数据进行峰匹配 , 可得到未知化合物的结 构信息 。 Yu 等 68 发现在质谱方法中因为存在噪声因而很难 同 时 实 现 低 丰 度 和“假 阳 性 ”峰 的 检 测 。峰匹配时去除“假阳性 ”峰后 , 有利于肝癌标志物的发现 。D a n ie ls s o n 等 69 建立了不需要峰匹 配就 可以对一维或者二维的 LC / G C / C E 数据进行快速多重变量分析的方法 , 简化了数据前处理步骤 , 缩短了 数据处理的时间 。在分类方法上 , 通常采用无监督的主成分分析( PCA ) 方 法 70, 71 和 有 监 督 的 S IM CA ( s o f t in d e 2 p e n d e n t m o d e lin g o f c la s s a n a lo g ie s ) 、偏最小二乘 法 ( PLS ) 等数据分析方法 72 。近年来支持向量机( SVM )方法已逐渐应用于代谢组学研究的判别分析中 73 - 75 , 其 预 测 精 度 明 显 优 于 传 统 的 PLS 2DA ( d is c r im in a n t a n a lys is )方法 。正交信号校正 ( O SC ) 是常用于 PLS 的数据过 滤方法之一 , 其原理是过滤掉与 Y矩阵正交的 X 变 量 , 去除额外的影响因素 , 从而提高判别的准确性 。在代谢组学分析中 , 分析对象的性别 、年龄 、环境影 响等因素都会降低判别准确性 , 应用 O SC 能够获得 更好的分类结果 , 找出各代谢物更加细微的差异 。 必须强调 , 在 PLS、PL S 2D A 模型 建 立后 , 正 交验证 ( c ro s s va lid a t io n ) 是必需的步骤 , 建立的模型要避免过拟合 , 使得分类结果有较好的可信度 74 。5 展望色谱 2质谱技术的创新和发展推动了代谢组学 的发展 。实现对生物样本内代谢物的无偏性 、高通 量 、高灵敏度的分析和代谢组学对分离分析技术的 要求与挑战相呼应 。目前 , 每种色谱 2质谱联用技术 都有其自身不足 之 处 , 许 多 关键 问题 仍 亟待 解决 。 LC 2M S 由于缺少谱图数据库 , 化合物的结构鉴定仍 是其瓶颈 ; 而 G C 面临着简化预处理过程 、改进衍生 化方法 、提高 G C 的分离效率等问题 ; G C GC 2TO F M S 的数据处理一直是代谢组学研究中比较棘手的 问题 ; C E 2M S 对中性代谢物不能分离 , 接口技术仍 需优化 , 且重复性和灵敏度都有待改进 。除了需要 不断开发新的柱填料 、发展新的联用技术 、研究新型 色谱和质谱仪器 、不断提高分离分析的分辨率和灵 敏度等指标外 , 分析仪器的小型化 , 样品采集 、转移 、 提取等预处理环节的标准化也越来越重要 。代谢组 学要取得进展 , 急需类似于基因组学中阵列毛细管 测序的方法 , 从而做到既有好的通量 , 也有好的灵敏 度和分辨率 。现在的色谱 2质谱技术离代谢组学的 要求还有不小的差距 , 需要分析科学家作出艰苦的 努力 。另一方面 ,任何一种组学研究平台的单独使用都 只能为系统生物学研究提供有限的认知 。代谢组学技术与基因组学 、蛋白质组学数据整合在一起可比它 们各自本身提供更多的信息 ; 如何整合不同平台和不 同组学的数据是一个令人感兴趣的研究课题 。参考文献 : 1 N ic h o ls o n J K, L in d o n J C , H o lm e s E. 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