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药学微生物基础教案 上课时间 200年月日授课内容 第二节抗生素效价的微生物测定技术授课人 汪穗福任教班级 级班课时 课型 教学媒体 教学目标 熟记抗生素效价单位的表示方法 熟知抗生素效价 二剂量法和管碟法的概念 知道二剂量法的原理和操作技术 教学重点 1 概念和抗生素效价单位的表示方法2 二剂量法的原理和操作技术教学难点 二剂量法的原理和操作技术 第二节抗生素效价的微生物测定技术 本节主要介绍抗生素效价和单位的含义及表示方法 抗生素微生物学测定技术的种类 重点介绍管碟法中二剂量法的概念 原理及操作技术 一 抗生素的效价和单位抗生素的化学结构复杂 因此人们通常所说的某种抗生素常常是几种相似成分的混合物 而且抗生素性质不稳定 产品中混杂着分解产物 异构物等 再加上抗生素生产过程中不可避免地混入一些发酵产生的杂质 这些情况还会随着工艺路线的不同 生产菌种的变异 培养基原料和培养条件的改变而发生相应的变化 所以必须对抗生素的有效成分加以测定 效价是指抗生素有效成分的含量 即在同一条件下由抗生素的检品和标准品的抗菌活性的比值得出的百分数 单位是衡量抗生素有效成分的尺度 是效价的表示方法 抗生素的含量用效价和单位表示 有时把这两个名词不加区别统称为效价单位 指每毫升或每毫克中所含某种抗生素的有效成分的多少 1 质量单位以抗生素的生物活性部分 不包括无活性的酸根部分 的质量作为效价单位 1 g 1U 1mg 1000U 用这种方法表示不同酸根的同一抗生素的效价单位时 虽然抗生素称重不同 只要单位一样 则表示其有效部分的质量是一样的 如硫酸链霉素 盐酸土霉素 硫酸卡那霉素 硫酸新霉素 硫酸庆大霉素 乳酸红霉素等 1 抗生素效价单位的表示方法 2 类似质量单位以纯粹抗生素盐类的质量 包括无生物活性的酸根部分 作为效价单位 l g 1U lmg 1000U 这是根据国际使用习惯而来的 如四环素 新生霉素等 3 质量折算单位以特定的纯粹抗生素盐的某一质量作为效价单位加以折算 如青霉素的单位 最初是指定在50ml肉汤培养基内能够完全抑制金黄色葡萄球菌生长的青霉素的最小量为1U 后来制得纯品 这一量相当于青霉素G钠盐0 5988 g 因而国际上一致认定0 5988 g为1U 则1 g 1670U 又如硫酸黏菌素指定4 88 10mg为1U 则lmg硫酸黏菌素相当于20500U 4 特定单位 以特定的抗生素样品的某一质量作为效价单位 经国家有关机构认可而定的 如特定的一批杆菌肽称重0 018mg为1U 即lmg 55U 又如制霉菌素 第一批标准品1mg 3000U 1 国际标准品与国家标准品抗生素的国际标准品由世界卫生组织邀请有条件的国家检测机构或药厂协作标定后 由生物检定专家委员会最后通过决定 抗生素的标准品是与供试品同质的纯度较高的抗生素 用来测定效价的标准 标准品分为国家标准品和国际标准品 经国际协议 每lmg标准品中含有一定的单位 其单位称为国际单位 U 2 标准品与供试品 国际标准品供各国检定国家标准品时作对照用 不用于常规检验 国家标准品制备后 须与国际标准品的效价单位进行比较 定出效价单位 我国于1952年开始建立国家标准品 由卫生部药品生物制品检定所会同全国有关单位共同进行选样 分装 协作标定 确定效价等 经卫生部审定后 向全国各使用位分发 对于没有国际标准品的我国特有品种 由我国按照一定的原则自定效价单位 标准品应按规定条件保存 2 供试品供试品是供检定其效价的样品 它的活性组分应与标准品基本相同 抗生素微生物检定法是利用抗生素抑制或杀死细菌或真菌的程度作为客观指标来衡量抗生素中有效成分的效力的一种方法 各国药典均有采用 它比物理学方法或化学方法都更能够确定抗生素的医疗价值 且有较高的灵敏度 所以被各国药典收载为测定抗生素效价的经典方法 二 抗生素微生物检定法的种类 1 稀释法现在已不用来测定抗生素的效价 而以之测定抗生素的最低抑菌浓度 MIC 和最低杀菌浓度 MBC 2 比浊法 用透光度测量浊度 浑浊程度越高 光吸收越好 通过的光线也就越小 采用分光光度计来测定吸光度 用二剂量法或三剂量法可计算出供试品的效价 这种方法准确 快速 不受扩散影响且自动化程度高 这种方法准确 快速 不受扩散影响且自动化程度高 各国药典相继收载 我国药典2005年收载此法 有二个品种 根据抑菌圈的大小可判断细菌和真菌对抗生素的敏感程度 也可将供试品的抑菌圈与标准品的抑菌圈进行比较 计算出供试品的效价 扩散法根据扩散形式不同可分为多种 其中管碟法是国际通用的方法 我国药典微生物检定法也一直采用管碟扩散法 3 扩散法 1 管碟法的概念管碟法是利用抗生素溶液在含敏感试验菌的琼脂培养基内扩散渗透作用形成一定的抑菌圈而设计的 通过琼脂培养基 可观察并测量出抑菌圈的大小 在一定的抗生素浓度范围内 抗生素的对数浓度 剂量 与抑菌圈的面积或直径成正比 2 抑菌圈的形成原理 三 管碟法 将不锈钢小管 俗称牛津杯 放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上 将抗生素溶液注入小钢管中 抗生素分子随溶液向培养基内呈放射状扩散 同时将培养基置于适宜试验菌生长的条件下培养 试验菌开始生长 抗生素分子在琼脂培养基中的浓度 随离小钢管的距离增大而降低 离小钢管越远 琼脂培养基中抗生素的浓度越低 当抗生素分子扩散到一定时间 在小钢管周围形成了一个能有效抑制试验菌生长的范围 也就是通常所说的抑菌圈 抑菌圈的边缘处所含的抗生素浓度恰好是抗生素对试验菌的最低抑制浓度 抗生素的浓度不同 形成的抑菌圈的大小也不同 图 抗生素在含试验菌平板上扩散示意图 3 管碟法的动力学公式 抗生素溶液在培养基内呈球面扩散 利用分子扩散定律推导出的动力学公式如下 r2 4Dt 1nM lnc ln 4 DtH 或lgM 1 9 21Dt r2 lg 4 cDtH 式中 D为扩散系数 mm2 h t为抗生素扩散时间 h M为管中抗生素总量 U r为管中心到抑菌圈边缘距离 mm H为培养基厚度 mm c为最低抑菌浓度 U ml 由上式可知 lgM与r2成直线关系 即抗生素总量的对数值与抑菌圈半径的平方值成直线关系 抗生素的量可从抑菌圈的大小来计算 四 二剂量法 一 概念二剂量法是根据在一定的浓度范围内 抗生素的对数剂量和抑菌圈的直径或面积成正比的原理 将抗生素的标准品 S 和供试品 U 各稀释成一定比例的两种剂量 即高剂量和低剂量 2 1或4 1 在同一含试验菌的平板上进行比较 根据两种剂量4种溶液所产生的抑菌圈的大小 计算出供试品的效价 根据设计原理不同 管碟法分一剂量法 标准曲线法 二剂量法 2 2法 和三剂量法 3 3法 三种常用的方法 二 效价计算公式 不讲 效价计算公式的推导如下 图 设lg lg效价 直线角度K 高剂量与低剂量之比UH 供试品高剂量之抑菌圈直径UL 供试品低剂量之抑菌圈直径SH 标准品高剂量之抑菌圈直径SL 标准品低剂量之抑菌圈直径V UH UL SH SL W SH UH SL UL 由图知lg tg UH SH lg tg UL SL 2lg tg UH SH UL SL tg UH UL SH SL tg vlg tg V 2 而lgK tg UH UL lgK tg SH SL 2lgK tg UH UL SH SL tg UH SH UL SL tg Wtg 2 1gK W 代入 得lg 21gK W V 2lg lg KW V lg 1 KW V 由公式 即可算出效价 注意 公式 中 的为相对效价 即供试品效价 Pu 与标准品效价 Ps 之比 所以供试品的效价代入下列公式即可求出 Pu Ps lg 1 KW V K 高剂量与低剂量之比UH 供试品高剂量之抑菌圈直径UL 供试品低剂量之抑菌圈直径SH 标准品高剂量之抑菌圈直径SL 标准品低剂量之抑菌圈直径V UH UL SH SL W SH UH SL UL 为相对效价 即供试品效价 pu 与标准品效价 ps 之比 所以供试品的效价代入下列公式即可求出 pu ps 抗生素微生物检定法的检验程序 图 ZY 300IV型智能抑菌圈测量仪图 CHB 1型抗生素效价测量仪 抗生素微生物检定法的过程 标准品 供试品的称量 标准品 供试品的稀释 缓冲液的制备 培养基的制备 菌液的制备 平板的制备 抗生素微生物检定法的过程 加陶瓦园盖 培养 测量抑菌圈 可