定点突变.docx

。1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR） 搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1. 两对引物的Tm值都应相当。两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3 末端且突变位点距离3 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。5-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5 完全互补5-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5 部分互补5-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNNNNNNT-5 部分互补一对中间位置的点突变引物设计3. PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。（注意前两次不能使用taq聚合酶，因为taq在产物3 端多加一个A，导致后续的PCR3出现移码突变）4. 克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。 一步法定点突变一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。原理如图实验步骤（PROCEDURE）5. 引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质粒模板完全匹配。不同于搭桥法的一对中间引物，全质粒PCR法的一对引物最好不是完全配对，因为这对引物是放在一个PCR反应中，完全配对极易形成引物二聚体，而不是与模板质粒结合。这就要求两条引物间配对区域的Tm值要小。6. PCR。PCR1：质粒+正向引物扩增，PCR2：质粒+反向引物扩增。两次PCR均按照常规PCR程序进行，不同的是只反应12个而不是30个循环。PCR3：PCR1和PCR2反应完成后，将二者体系混合成一个体系并补加适量的高保真聚合酶（如Pfu 或 Pfu-X1），然后按照常规PCR程序继续反应16个循环。 关键步骤： 不能用taq酶，一是taq酶无3-5外切酶活性导致保真性差，全质粒PCR片段长，易出现非目标突变。二是因为taq酶具有5-3外切酶活性这就导致当PCR以质粒为模板复制一圈回到最初引物位置时，原有引物会被外切导致引入的突变又变回野生型质粒的序列。 为防止非目标突变，PCR循环数不要太多（建议不超过25个cycle） 在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量以免模板质粒消化不完全背景增加。（酶切和PCR都无法区分）7. PCR产物的甲基化酶处理8. 待突变的质粒通常来源于DH5等dam+大肠杆菌，在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来（DpnI酶只消化甲基化的DNA）。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后，突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。9. 向PCR产物中加入1 L DpnI酶和4 L的10 NEB cutsmart buffer消化模板质粒置于3