生物选修一大肠杆菌的培养和分离.pptVIP

1 1什么是生物技术 生物技术 生物工程应用自然科学及工程学原理 以微生物体 动物体 植物体或其组成部分作为生物反应器将物料进行加工 以提供产品来为社会服务的技术 1 2传统生物技术 传统生物技术指主要通过微生物的发酵来生产商品 如 酱 醋 酒 面包 奶酪 酸奶等 1 3现代生物技术 一般而言 現代生物技术可以分成以下五种 一 细胞工程二 发酵工程三 蛋白质工程四 酶工程五 基因工程 现代生物技术与传统生物技术的本质区别是现代生物技术中用到了基因工程 一 细胞工程 按照人们的需要和科学设计改变细胞的遗传基础 并通过细胞 组织 培养 细胞杂交 融合 核移植和胚胎移植等技术 重组细胞的结构和内含物 以改变生物的结构和功能 快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术 二 发酵工程 微生物的无氧呼吸叫发酵1 定义 利用DNA重组技术对不同生物的遗传基因 根据人们的意愿 进行基因的切割 拼接及重新组合 再转入生物体內 产生出人们所期望的产物或创造出具有新的遗传特征的生物类型 蛋白质工程主要包括了解合成蛋白质的DNA编码序列 蛋白质的分离纯化 蛋白质的序列分析和结构功能分析 蛋白质结晶和结构力学分析等 三 蛋白质工程 酶工程即利用基因工程等手段 改变酶或蛋白质的折叠方式 空间结构 催化活性和稳定性等 四 酶工程 选修1需学习的实验 微生物的利用 实验1大肠杆菌的培养和分离 酶的应用 实验4果汁中的果胶和果胶酶实验5加酶洗衣粉的使用条件和效果实验6 淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 生物工程在食品加工中的应用 实验8果酒及果醋的制作实验实验10泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定 浅尝现代生物工程 实验11植物的组织培养 实验1大肠杆菌的培养和分离 第一部分 微生物的利用 一 基础知识 1微生物 2培养基 3无菌技术 二 实验操作 2微生物的接种技术 1操作步骤 微生物包括哪五类 病毒细菌和蓝细菌放线菌真菌原生动植物 特点 结构都相当简单 个体多数十分微小 通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到 有的甚至没有细胞结构 原核生物界 原生生物界 真菌界 病毒界 一基础知识 一 微生物 细菌的外形与大小 细菌 单细胞不分枝的原核微生物 细菌细胞微小而透明 通常用适当染料染色 革兰氏染色 后显微镜观察 革兰氏染色 革兰氏染色是一种用于细菌的染色法 革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌 用革兰氏染液染色后 再用脱色液处理 细菌仍保留染色液的颜色 相反 细菌的构造 图细菌的结构 细胞膜 拟核 细菌细胞由外向里依次有鞭毛 菌 纤 毛 荚膜 细胞壁 细胞膜 细胞质 拟核 细胞质中又有液泡 储存性颗粒 核质等 细胞壁 成分 肽聚糖细胞壁有哪些功能 固定细胞外形 保护细胞免受外力的损伤 阻拦大分子物质进人细胞 使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性 伤寒杆菌细胞壁中含毒素 芽孢 有些细菌在一定的条件下 细胞里面形成一个椭圆形的休眠体 叫做芽孢 芽孢的壁很厚 对干旱 低温 高温等恶劣的环境有很强的抵抗力 例如 有的细菌的芽孢 煮沸3小时以后才死亡 芽孢又小又轻 可以随风飘散 当环境适宜 如温度 水分适宜 的时候 芽孢又可以萌发 形成一个细菌 菌落 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时 就会形成一个肉眼可见的 具有一定形态结构的子细胞群体 叫做菌落 菌落是鉴定菌种的重要依据 菌落 细菌的菌落特征因种而异 细菌的营养物质 碳源有机 无机氮源有机 无机水无机盐生长因子即细菌生长必需 而自身不能合成的化合物 如维生素 某些氨基酸 嘌呤 嘧啶 大肠杆菌的培养与分离 实验目的 1 进行大肠杆菌的扩增 利用LB液体培养基进行细菌培养的操作2 进行大肠杆菌的分离 用固体平板培养基进行细菌的划线培养3 说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理 对链霉素敏感 大肠杆菌基础知识 由于细菌细胞壁结构不同 细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 细胞壁厚 无荚膜 多产生外毒素 对青霉素更为敏感 细胞壁薄 有荚膜 多产生内毒素 大肠杆菌是革兰氏阴性菌 异养兼性厌氧型肠道杆菌 在肠道对人无害 但进入人的泌尿系统便会产生危害 大肠杆菌在基因工程中广泛应用 它的质粒是最常用的载体 也是基因工程中常用的受体细胞 大肠杆菌的培养和分离 培养基的配制 灭菌 分离培养 矿质元素 生长因子 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质 大肠杆菌培养基 一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌 培养后可在LB固体培养基上划线分离 一 大肠杆菌的培养 培养基种类 液体培养基 表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长 按物理状态来分 用途 工业生产 扩大培养 固体培养基 菌落 菌苔 按物理状态来分 用途 菌种分离 鉴定 计数 保存菌种 半固体培养基 无动力有动力 弥散 观察细菌的运动 厌氧菌的分离和菌种鉴定 按物理状态来分 1 液体基础培养基牛肉膏0 3g 蛋白胨1g 氯化钠0 5g 蒸馏水100ml 加热溶解以上成分 冷至40 50 调pH值至7 4 7 6 煮沸3 5分钟 补足水分 过滤 分装 高压灭菌 2 半固体基础培养基在液体基础培养基100ml中加琼脂0 2 0 5g 加热至100 使琼脂熔化 分装试管 高压灭菌 取出后直立放置至琼脂凝固 3 固体基础培养基在液体基础培养基100ml中加琼脂2 3g 加热至100 使琼脂化 分装于试管和三角烧瓶中 高压灭菌 取出后趁热将试管倾斜一定角度放置 琼脂凝固后即成普通琼脂斜面 将三角烧瓶中培养基倾注于灭菌平皿内 凝固后即成琼脂平板基础培养基 选择培养基 加入青霉素的培养基 分离酵母菌 霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞 按功能来分 添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离 鉴别培养基 按功能来分 当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色 再与美蓝结合形成紫黑色菌落 并带有绿色金属光泽 常用的伊红美蓝乳糖培养基 可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌 添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别 伊红 美蓝鉴别大肠杆菌 天然培养基有血清 血浆 和组织提取液 如鸡胚和牛胚浸液 优点 营养成分丰富 培养效果好缺点 来源受限 成分复杂 影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析 易发生支原体污染 天然培养基 按化学成分来分 根据细胞生存所需物质的种类和数量 用人工方法模拟合成的 合成培养基主要成分是氨基酸 维生素 碳水化合物 无机盐和其它一些辅助物质 优点 标准化生产 组分和含量相对固定 成本低缺点 缺少某些成分 不能完全满足体外细胞生长需要 合成培养基 按化学成分来分 血清中含有 多种蛋白质 白蛋白 球蛋白 铁蛋白等 多种金属离子 激素 促贴附物质 如纤粘蛋白 冷析球蛋白 胶原等 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存 要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基 如血清 按化学成分来分 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 不管哪种培养基 一般都含有水 碳源 和氮源 无机盐 生长因子 即细菌生长必需 而自身不能合成的化合物 如维生素 某些氨基酸 嘌呤 嘧啶 等营养物质 另外还需要满足微生物生长对pH 氧气 渗透压的要求 细菌喜荤 霉菌喜素 大肠杆菌配方 酵母提取物 0 5g蛋白胨 0 5gNacl 0 5g琼脂 1g水 50ml 细菌喜中性偏碱 霉菌喜中性偏酸 LB固体培养基 大肠杆菌菌液 LB液体培养基 大肠杆菌培养基 一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌 培养后可在LB固体培养基上划线分离 大肠杆菌的扩大培养 好氧型 将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中 使其在37 摇床培养12小时 注意事项 1 火焰旁从斜面上用接种环取菌 2 取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌 冷却后方能取菌 3 取菌后封口膜和棉塞复原 二 无菌技术 从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作 1 对实验操作空间 操作者的衣着和手进行清洁和消毒 2 将培养器皿 接种用具和培养基等器具进行灭菌 3 为避免周围微生物污染 实验操作应在酒精灯火焰附近进行 4 避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触 获得纯净培养物的关键 消毒与灭菌 1 消毒 概念 使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物 包括芽孢和孢子吗 不包括 防止外来杂菌的入侵 1 煮沸消毒法 100 煮沸5 6min 日常生活常用 2 巴氏消毒法 70 75 下煮30min或80 下煮15min 对一些不耐高温的液体 常用于鲜奶的消毒 3 化学药剂消毒法 用75 酒精 新洁尔灭等进行皮肤消毒 氯气消毒水源 双手使用酒精消毒 4 紫外线消毒 消毒的方法 对接种室 接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等溶液以增强消毒效果 然后用紫外线进行物理消毒 2 灭菌 概念 使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物 包括芽孢和孢子 方法 a灼烧灭菌b干热灭菌c高压蒸汽灭菌 a灼烧灭菌 微生物的接种工具 接种环 接种针 或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧 b干热灭菌160 170 1 2h 能耐高温的需要保持干燥的物品 玻璃器皿 C高压蒸汽灭菌100kPa121 15 30min 通常用于培养基 无菌水的灭菌 补充 表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法 所用器械是紫外灯 最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌 它可以杀灭所有的生物 包括最耐热的某些微生物的休眠体 同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌 为了防止杂菌 特别是空气中的杂菌污染 试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口 通常采用棉花塞 也可采用各种金属 塑料及硅胶帽 它们只可让空气通过 而空气中的其他微生物不能通过 而培养皿是由正反两平面板互扣而成 这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的 培养基灭菌 基础培养基 121 高压蒸汽灭菌15分钟 含糖培养基 90 以上灭菌30分钟 鸡蛋 血清培养基 间歇灭菌3天3次 不耐高温的液体成分 G6玻璃砂漏斗滤过除菌 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行 无菌室 超净工作台使用前后需进行消毒 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌标本的采集无菌试管 烧瓶的使用 3 无菌环境 4 接种前准备 用肥皂洗手并使用酒精消毒 点燃酒精灯 酒精棉擦拭双手 酒精棉擦拭桌面 1 无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外 还有什么目的 2 请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌 如果需要 请选择合适的方法 1 培养细菌用的培养基与培养皿 2 玻棒 试管 烧瓶和吸管 3 实验操作者的双手 答 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染 答 1 2 需要灭菌 3 需要消毒 思考 1 配制培养基 包器材 灭菌 菌种扩增 倒平板 接种 划线 培养 观察记录 实验流程 三 大肠杆菌的分离 倒平板 接种 划线 灼烧接种环 取菌液 划线分离 烧至暗红 接种 划线 灼烧接种环 取菌液 划线分离 菌液膜 接种 划线 1 划线分离法 为什么通过划线分离可得到单菌落 每划完一个区域要不要灼烧接种环 1 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环 在划线操作结束时 仍然需要灼烧接种环吗 为什么 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后 接种环上残留的菌种 使下一次划线时 接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端 从而通过划线次数的增加 使每次划线时菌种的数目逐渐减少 以便得到菌落 划线结束后灼烧接种环 能及时杀死接种环上残留的菌种 避免细菌污染环境和感染操作者 2 在灼烧接种环之后 为什么要等其冷却后再进行划线 3 在作第二次以及其后的划线操作时 为什么总是从上一次划线的末端开始划线 以免接种环温度太高 杀死菌种 划线后 线条末端细菌的数目比线条起始处要少 每次从上一次划线的末端开始 能使细菌的数目随