鸡别决定与胚别鉴定技术研究进展.doc

。鸡性别决定与性别鉴定技术研究进展摘要:鸡的性别决定机制与胚胎性别鉴定技术一直是人们关注研究的重要方向,在遗传育种领域具有重要意义.文章主要从鸡的性别决定的可能机制和假说两个方面概括了近年来在鸡性别决定机制和性别分化的研究进展,总结了鸡胚胎性别鉴别方法,以期为探究性别决定的机制提供必要的理论依据，能够在实际生产中根据需要,定向调控鸡的性别,进行早期胚胎性别鉴定,为我国家禽养殖业带来一定的经济效益.关键词:鸡;性别决定机制;性别分化;性别鉴别前言性别决定机制、性别控制和性别早期鉴定研究一直是人们很感兴趣的课题,鸟类性别决定的研究由于家禽养殖业的经济价值而格外受到重视.鸡的性别与其经济价值有着直接的联系,在蛋鸡的集约化生产中,母鸡的生产效益远高于公鸡.在肉鸡的生产养殖过程中,公鸡的生长速度,生命力强，其生长速度以及饲料利用率均显著高于母鸡.随着家禽集约化养殖模式的发展，通过遗传育种学的知识,根据生产定向地调控鸡的性别,因此,研究鸡的性别决定机制和性别控制技术,不仅在科研方面具有极其重要的意义,进行鸡的早期胚胎鉴别更在实际的生产当中具有重要的意义.1鸡的性别决定1.1家禽(鸡)的性染色体正常情况下,鸟类雌性为ZW异配型性染色体,雄性为ZZ同配型性染色体1-4,早期的染色体核型分析研究表明,一些新颌型鸟类(家鸡)的Z和W的相对大小明显不同5,在进化过程中,只有一小部分的Z和W区域出现了基因重组,且W染色体变得小于较原始的鸟类5.家鸡的Z染色体包含有7%的单倍体染色体组,而W仅包含1.5%6,而在更多的原始古鸽型鸟类中,如鸸鹋，鸵鸟，南方鹤鸵等,Z和W的性染色体通常是同态的7.由此可知,在鸟类进化的过程中,Z染色体正不停地重组产生新的染色体型,使得性别决定基因倾向于独立调控性别的方向发展,同时也确保性染色体不至于因为基因的隔离而产生退化.1.2 鸡性别决定的可能机制和假说性别决定基因是通过控制胚胎性腺的发育来实现性别决定的，因此性别决定的过程与性腺的发育和分化息息相关.在鸟类的胚胎期,性腺形成的基本过程是保守的,但同时又具有非对称性发育的独特特征8.性腺的分化在本质上依赖于皮质或髓质的增殖以及生殖细胞的获得.最早能够发现性别分化的时期是在家禽孵化的第67d,这时在雄性性腺内部的髓质中曲细精管索(seminiferous cords)开始形成,同一时期在雌性性腺外部的皮质层开始增殖 鸡性别决定的分子机制近期的研究已获得DMRT1、ASW、DAX1等多个可能与鸡性别决定有重要关联的候选基因,这些基因可能像哺乳动物中的SRY基因一样,与鸡性别决定有着重要关联.已有研究表明,同哺乳动物的X染色体一样,家禽的Z染色体中含有大量的控制睾丸性征表达基因10,其中之一就是DMRT1(DM-related transcription factor 1).DMRT1位于Z色体上,与W染色体不同源,是一种调控睾丸发育的基因,并且可能在决定雄性性别方面发挥主要的作用11.有文献报道,在鸡胚胎性腺分化之前,DMRT1在雄性胚胎的性腺中的表达量远高于雌性,并且在睾丸的形成过程中发挥作用.DAX1 基因(dosage sensitive sex reversal,adrenal hypoplasia congenital, X chromosome,number 1)是一种基因编码蛋白,具有介导卵巢发育的功能.实验表明,在鸡卵巢发育过程中,DAX1基因的表达量保持稳定;而睾丸发育过程中,DAX1基因的表达量则显著下降,这说明DAX1可能参与性别决定,并参与调控雌性发育13.此外,1994年Bardoni在转DAX1基因小鼠的实验中发现,当该基因编码蛋白发生不正常复制时,其结果会使得小鼠发生从雄性到雌性的性逆转,并且DAX1基因发生功能性突变能引起肾上腺发育不全14.不同的性连锁基因在禽类性别决定的调控中起着不同的作用,但目前对它们与其他一些性别决定基因间的联系还知之甚少,因此禽类性别决定的分子机制还需要进一步的探究和讨论.1.2.2 Z染色体的剂量效应和W染色体的显性效应假说假说认为,Z染色体上携带雄性决定基因且具有剂量效应,该效应在雄性发育的初期以Z染色体的数量来诱导个体的性别发育,即两个Z染色体时为雄性,一个Z染色体时为雌性;W染色体上携带着显性的卵巢决定基因,它具有显性效应,使ZW成为雌性15.但是由于鸟类缺乏非整倍体的性染色体个体,所以很难验证Z剂量效应和W显性效应假说.因此,性别决定类型为ZW型的禽类的性别决定机制是由W雌性决定基因决定,还是由Z基因的剂量差异所决定,还是两种机制同时存在还不清楚.1993年Thorne等报道一群ZZW三倍体鸡发育成间性.这些三倍体的鸡在出雏时具有雌性的外部表型,但同时具有卵巢体和睾丸,并分别位于身体左右两侧,随着年龄的增长其左侧卵巢逐步退化16.卵巢的出现说明W染色体可能携带雌性决定基因；而其卵巢组织随年龄增长而退化可能与假定的W雌性决定因子的作用被Z染色体以数量上的优势所削弱有关.该三倍体性染色体鸡的证据支持了Z剂量假说,说明W染色体具有雌性决定作用但能被Z连锁雄性决定基因的剂量效应所影响.2004年,Arit等发现1例雌大苇莺(greatreed warbler)具有2个Z连锁微卫星标记的杂合子遗传型,从而推断该个体可能具有2AZZW的基因型17.这个事例支持了W可能携带雌性决定因子的假说,并做出了性别决定与Z染色体数目无关的推断.但是,推断的ZZW基因型并没有得到核型分析的证实,且其2个Z等位基因也没有遗传给后代.究竟W染色体是否独立决定性别还有待进一步的探索和确定.2010年,有学者提出了关于一只雌雄嵌合体家鸡的详细研究报告18,报告称这只鸡是侧面性别嵌合,左侧雄性右侧雌性.在雄性一侧表现出明显的雄性特征,具有巨大的肌肉型胸部和锋利的脚爪,而雌性一侧则不具备任何雄性特征.经验证,其雄性一侧的细胞内全部都是ZZ性染色体,而在雌性一侧的却是ZW型,但其性腺内同时含有具有ZZ染色体的细胞和具有ZW染色体的细胞.然而,在实验条件下,却无法实现将带有雄性基因的细胞和带有雌性基因的细胞混合进入同一个鸡胚细胞,并且实验发现雌性细胞不能够在雄性的性腺内存活,反之亦然.基于曾有研究指出没有发现不带Z基因鸟类,而哺乳动物中有只带X基因的性别类型的研究结论19-20,Zhao(2010)在讨论了该嵌合体鸡之后作出推断:“高剂量的Z连锁基因在ZZ基因型的细胞中可能起到增强雄性的作用”18.因此,Z剂量和决定性的W假设仍旧都有可能,最终性别究竟是决定于Z的剂量效应(两个是雄性,一个是雌性)或者决定于W的显性效应,抑或决定于它们共同的作用仍需要进一步的研究探讨.1.2.3 常染色体平衡假说常染色体平衡学说最早是由美国生物学者Bridges以果蝇为材料提出并证实的.Bridges认为生物的性别是由细胞核内染色体上雄性化基因系统与雌性化基因系统的平衡所决定的,基因系统的优势会影响胚胎在发育早期向某一性别方向发育21,1954年,Crew在文献中报道,鸡的性别由性染色体个数与常染色体倍数之比决定22,Newcomer等则认为,常染色体数的增加使性染色体与常染色体之比的平衡趋于雌性 H-Y抗原决定假说雄性特异性抗原(male-specific antigen)通常也称为雄性特异性弱组织相容性Y抗原(male-specific minor histocompatibility Y antigen),简称H-Y抗原,是一组雄性特异性基因的表达产物,Eichwald等在1955年首次发现这一抗原,Eichwald在研究小鼠雌性时,发现雄鼠对移植皮肤的排斥反应,比同种雌鼠对移植皮肤的排斥反应24更为迅速,从而推论Y染色体上存在一种很弱的移植抗原,该抗原由次要组织亲和点(H)所决定,进而提出了H-Y抗原和H-Y抗体的名称25. H-Y抗原在异性间组织移植的排斥反应和性别控制等方面的研究中具有重要的理论和实践意义. 1975年Wachel等人,提出一个假说:H-Y抗原可能是性别决定基因的产物.在鸟类和某些两栖类中，该基因编码卵巢26,即在鸟类中,H-W决定雌性性别27.然而,Muller等在研究由雌二醇诱导得到的雌性化的小鸡时发现,基因型为ZZ的小鸡中也有所谓的ZW抗原表达,只是抗原水平低于基因型为ZW的个体 细胞自主控制性别分化科学家们把鸡性别决定的研究重点更多地放在了性腺分化和激素调控性别表型上,而最近的研究开始强调性腺以外的因素对性发育的影.许多研究表明,在胚胎发育时期多种机体组织性二态基因在性腺分化以前就能检测到其表达29.Zhao等30研究了表型为一侧为有肉垂、鸡冠、长直腿和胸部肌肉发达的典型雄性特征,而另一侧为典型雌性特征的雌雄嵌体鸡,发现左右侧机体组织中都含有ZZ和ZW型性染色体组成的细胞,只是比例不一.左右侧组织细胞接收同样的性腺分泌物(雌雄激素),却做出了不一样的应答,导致表型的不一致,说明经典的由性腺激素决定机体表型的理论在鸡中并不完全适用,鸡机体的性别识别可能是由细胞自主控制的,ZZ型和ZW型细胞的相对比例决定了机体的表型性状.而关于此类的研究还在持续进行中.2鸡性别鉴定禽类性别鉴定方法依其生理阶段可划分为出壳后鉴定与出壳前鉴定两大类，前者主要包括禽类外观鉴定法、雏禽伴性遗传法及雏禽翻肛鉴定法三种,雏禽翻肛鉴定法应用最为广泛,其次是雏禽伴性遗传法,由于禽类不同性别的生产效益差别显著,且禽类产品生产量巨大,在种蛋孵化早期甚至孵化之前就能够鉴别出其性别,并对不同性别的种蛋进行合理处理,不仅可降低孵化成本,减少孵化过程的资源浪费,还可避免出雏后处死不受欢迎的雏禽而违背动物福利的指责.因此,目前有研究者尝试在禽类出壳前进行性别鉴定,其中以鸡胚居多按照鉴定技术所要求的鸡胚胚龄来看,从1618胚龄的激素含量鉴定开始到12.5胚龄左右的PCR鉴定法,8胚龄左右的性腺形态学鉴定,35胚龄的血线形态法,最后是种蛋的蛋形指数法,鉴别时间向孵化早期靠拢.2.1鸡胚尿囊液雌激素含量鉴定法由于性腺的发育与性激素的释放,孵化中后期雌胚尿囊液中雌激素的含量远高于雄胚,通过测定胚蛋尿囊液或羊水中雌激素含量,可对胚胎性别进行鉴定美国 Embres公司已为此项技术及与之相配套的胚蛋尿囊液取样定位技术申请了两项专利(专利号为 6506570 和6510811,前者是对雌激素进行检查的方法,后者则提供了对胚蛋尿囊液进行采集或定位的方法31.这两项专利为生产自动化禽类雌雄鉴定设备提供了技术基础,但目前尚无相关产品问世,该方法的缺点在于需要孵化至中后期(16d 左右)才能进行鉴别,同时尿囊液的采样会破坏鸡胚蛋的蛋壳,对孵化率会造成一定影响.2.2 细胞核型分析法该方法主要依赖于 Z 染色体与 W染色体在形态上的区别,通过对分裂旺盛的组织进行取样，并制片观察其有丝分裂中期染色体的形态来鉴定样本的性别.但某些禽类如鸵鸟的 Z 染色体与 W染色体的长度、大小差异均不明显32,且取样操作对胚胎损伤较大,操作时间长,很难获得高质量的染色体中期分裂相,因此难以在生产实践中推广应用.2.3细胞DNA含量检测法由于性染色体 Z 和 W上的 DNA 含量不同，不同性别个体的细胞中DNA含量相差 0.6%3.5%,可用碘化丙啶对细胞核染色,然后通过流式细胞仪分析细胞基因组大小,并据此判断样本性别.该方法缺点在于仪器本身价格昂贵,鉴别成本较高.2.4 PCR鉴定法家禽的性别由Z染色体与W染色体决定,因此用于性别鉴定的目的基因都位于性染色体上,主要有CHD1基因EE0.6序列及 Hxo重复序列等,其中后两者为假基因序列.CHD1基因在非平胸总目家禽基因组中有2个同源拷贝,即CHD1-Z与CHD1-W,前者与Z染色体连锁,后者与W染色体连锁33,二者的内含子大小差异很大,可通过设计特异性引物进行PCR扩增,产物直接电泳,或经限制性内切酶特异性酶切后电泳,根据产生的条带数目对样本性别进行区分.直接电泳时,雌性为2条带,雄性为1条带;酶切后电泳时,雌性为3条带,雄性为 1条带34.该方法可用于鸡、鸭、鸽子、鹌鹑及部分鹤形目鸟类的性别鉴定，只需采集少量胚胎尿囊液样本、血液样本或成禽羽毛样本即可,不同鸟类扩增的适用引物对各不相同。目前,该基因的PCR 鉴别方法已在鸭35与鸽子36上申请了相关试剂盒专利.EE0.6 序列仅存在W染色体上,根据该序列扩增条带的有无同样可以鉴定性别;亦有研究者通过双引物扩增PCR.法进行扩增37,电泳结果出现 2条带的为雌性,1条带的为雄性.双引物扩增PCR法可有效防止PCR扩增失败造成的假阴性结果,提高判别准确率,这一序列可用于火烈鸟、黑冠鹤、东方白鹳等鸟类的性别鉴定.Hxo重复序列为家鸡W染色体上一个基因家族,有研究表明其中长度为 0.6的一段重复序列与性别有关，设计引物对其进行特异性扩增可鉴定样本性别38.由于该片段仅存在于W染色体上,在实际鉴定中应采用双引物扩增PCR法以排除假阴性结果,提高判别准确率.PCR法具有采样量少、取材方便、操作简便等优越性.但由于该方法是采样操作,尤其是采血操作会对胚胎造成影响,可能影响其孵化率与健雏率,目前该方法多用于实验室操作及珍稀鸟类出壳后的性别鉴定.2.5性腺观察法鸡胚发育至7天左右时,解剖胚胎可明显看出雌雄胚胎性腺差异,据此亦可准确判断性别.雄胚性腺为2条白色#接近对称的短棒样组织,雌胚则呈现一侧退化,另一侧片状的发育形态.但该方法会使胚胎死亡,无法继续孵化,多在实验室应用,目的是验证胚胎性别.2.6卵黄囊血管形态鉴别法已有研究表明,鸡原始生殖细胞与性腺的发生发育存在一定关系.孵化前3天,在未来性腺位置处出现上皮增厚时,外迁的原始生殖细胞(PGCs)渗入脏壁层的体腔上皮,出现性腺的形态39.(PGCs)的迁移与卵黄血管的形成存在一定关系,有研究表明血管的发育会影响睾丸形态结构的形成40.这些研究结果均表明,卵黄囊血管形态与性腺发育之间存在一定联系,可用于判定性别.早在1976年,马任骝41对3.03.5日龄的鸡胚和4.04.5日龄鸭胚进行壳外透视、破壳观察和性腺解剖,结果发现,在种蛋质量、孵化条件等相同情况下,胚外卵黄囊血管分布与性别存在一定关系,雄胚主血管明显、血管较粗、分布均匀,雌胚血管纤细、分支较多、不规则,准确率达70%90%.此后,一直没有相关的研究报道,原因可能是该方法的判定标准不好统一,或者在那个特殊的历史年代,数据的准确性值得怀疑直到2000年,李振钢等42根据鸡胚蛋血管分布形态制作了雄性鸡胚蛋的标准模板,并据此对,日龄鸡胚进行性别判定,准确率84%接下来几年,李振钢和其他学者给出了血线方向与鸡胚性别的函数关系式,同时增加了血线图像与背景之间的对比度、将血线骨架化及编制了判别程序.此后,没有后续报道,也没有推广到生产实践中去,可能与复杂的处理方法有关.其他性别鉴定技术比较,在早期(孵化35d)应用血管形态鉴定法进行雌雄鉴别,可及早对鸡胚进行合理安排,节约孵化成本;同时,该技术操作简便,不破坏蛋壳,对后期孵化影响较小,几乎不影响孵化率和出雏率.另外,随着该技术的完善,可实现机械光源透照与计算机自动识别雌雄,达到商业化的目标.但是,这项技术至今未像翻肛鉴别法一样推广到生产中去,其鉴别的技术标准和稳定性还有待提高.2.7蛋形指数鉴别法有研究人员利用蛋形指数对禽胚蛋进行早期性别鉴定并作了报道,但目前仅限于对黔东南小香鸡与鹌鹑的研究43,并认为蛋形指数与性别比例无直接关系,且试验重演性较低,故可认为蛋形指数与禽胚蛋性别无关.3结论与展望综上所述,性别决定与性别分化是研究家禽性别控制最重要的前提条件.目前在禽类性别控制的研究过程中已取得了一些较为可喜的进展,但还存在一些问题.首先,禽类生殖的具体机制还不够清楚,至今还没有手段在配子水平上实现其性别控制.利用化学物质处理性别分化前的胚胎,可在一定程度上实现性别的表型反转,但结果难以稳定.其次,通过性别鉴定实现性别控制,在商品代蛋鸡的集约化生产中已广泛应用,方法仍以翻肛鉴别和快慢羽为主.另外,性别的分子鉴定已取得很大的进步,并正在实验室水平上被采用,但此方法存在一定的局限性和不足,距生产应用还有一定的距离.深信不久以后,人们必将彻底探明禽类性别决定基因的表达和调控机理;或从免疫学角度寻找一种新的特异性强抗原;或在禽类W染色体上DNA特异序列方面获得重大突破等等,从而达到预测和控制禽类的遗传及表型性别的目的.参考文献1Fridolfsson A K,Cheng H,Copeland,N G,et al.Evolution of the avian sex chromosomes from an cestral pairof autosomesJ.PNAS,1998,95:8147-8152.2 Marshall Graves J A.Weird animal genomes and the evolution of vertebrate sex and sex chromosomesJ. Annual Review of Genetics.2008,42:565-586.3 Nanda I,Shan Z,Schartl M,et al.300 million years of conserved synteny between chicken Z and human chromoome 9J.Nature Genetics.1999,21:258-259.4 Stiglec R,Ezaz T,Marshall Graves J A.A new look at the evolution of avian sex chromosomesJ.Cytogenetic and Genome Research.2007,117:103-109.5 Marshall Graves J A,Shetty S.Sex from W to Z: evolution of vertebrate sex chromosomes and sex determining genesJ.Journal of Experimental Zoology.2011,290:449-462.6 Mank J E,Ellegren H.Parallel divergence and degradation of the avian W sex chromosomeJ.Trends in Ecology & Evolution.2007,22:389-391.7 Ogawa A,Murata K,Mizuno S.The location of Z- and W-linked marker genes and sequence on the homomorphic sex chromosomes of the ostrich and the emuJ.PNAS.1998,95:4415-4418. 8 Smith C A, Andrew H S. Sex determination in the chicken embryoJ. Journal of experimental Zoology.2001,290:691-699.9 Smith C A,Andrew H S.Sex determination: insights from the chickenJ.BioEssays.2004,26:120-132.10 Bellott D W,Skaletsky H,Pyntikova T,et al.Conver gent evolution of chicken Z and human X chromosomes by expansion and gene acquisitionJ.Nature.2013,466:612-616.11 Smith C A,Roeszler K N,Ohnesorg T,et al.The avian Z-linked gene DMRT1 is required for male sex determination in the chickenJ.Nature.2009,461:267-271.12 孟和.鸡性别决定机制及相关基因研究进展J.动物学杂志.2005,40(2):106-111.13 Gao Z Y.Molecular Mechanism of Sex DeterminationJ.Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine.2009,2:62-63.14 Bardoni B. A dosage sensitive locus at chromosome Xp21 is involved in male to female sex reversalJ. Nature Genet.2004,7;497-501.15 Melamed E,Arnold A P.Regional differences in dosage compensation on the chicken Z chromosomeJ. Genome Biology.2007,8:202.16 Thorne M H,Sheldon B L.Triploid intersex and chimeric chickens: useful models for studies of avian sex determination M. K.C.Reed,JAM.Graves,Sex chromosomes and sex-determining genes.Chur Switzerland:Harwood Academic Publishers.2013:201-208.17 Arit D,Bensch S,Hansson B.Observation of a ZZW female in a natural population:implications for avian sex determinationJ. Proceedings Biological Sciences.2014,271(4):249-251.18 Zhao D,McBride D,Nandi S,et al.Somatic sex identityis cell autonomous in the chickenJ. Poultry Science.2001,35:231-247.19 Kuroda Y,Arai N,Arita M T.et al.Absence of Z-chromosome inactivation for five genes in male chickensJ.Chromosome Research.2001,9:457-468.20 Melamed E,Arnold A P. Regional differences in dosage compensation on the chicken Z chromosomeJ. Ge nome Biology.2007,8:202.21 Bridges B C.Genetics of sex in drosophilaJ.Genetica.1998,22:951.22 Lecniak D,Strabel T,King WA.Sperm preincubation in relation to sex and development of bovine embryosin vitroJ.J Reprod Fertil,2000,25:9125 Eichwald E J,Silmse C R.Skin.Transplantation bulletinJ. Genetica.1997,2:148-149.26 Eichwald E J.H-Y and serendipity,Hum inheritance of Female Dimorphism in the DamselflyJ.Ischnura Damula,Genetics.1994,49(3):513-519.23 Newcomer E H,Donnelly G M.A cytological Study of Sex Reversal in the Domestic FowlJ.Poultry Science.1960,51:208.24 Newcomer E H,Donnelly G M.A cytological Study of Sex Reversal in the Domestic FowlJ.Poultry Scien Genet.1981,58:6-8.27王建平.家禽的性别决定和性反转J.中国家禽.2001,19(3):28-30.28 Muller U,Zenes M T,Wolf U.Appearance of H-W(H-Y) antigen in the gonads of oestradiol sex-reversedmale chicken embryosJNature.2015,280:142-144.29 杜继煜.性反转J.生物学通报.2006,10(41):35.30 Hutt F B.Genetics of the fowlJ.Journal of genetics.1949,32(2):277-285.31 Liu C K,Ku K Y.Histological changes in the gonad of Monopterus during sex transformationJ.Acta Hydrobio Sinica.2001,2(1-2):85-109.31AYERS K L,SMITH C A,LAMBETH L S.The molecular genetics of avian sex determination and its manipulationJ.Genesis.2013,51(5):325-336.32ZHAO D,MCBRIDE D,NANDI S,et al. Somatic sex identity is cell autonomous in the chickenJ. Nature.2010,464(7286):237-242.33 Jacquel J M.Photorefractory period of the Muscovy Duck(Cairina mo.rchaca):Endocrine and neuro-endocrine response to day length alter a full reproduction cycleJ.British Poultry Science.1997,(38):209-216.34 Eu:hes R J.Reproduction in poullryM.Walling UK: Cab.International.1996,106(124):263-278.35 Lewis P D,Perry C C.Eternal of Lighting on Reproduction in PoultryM.In:Poultry production.Edited by Hunlon P.Elsevier Science BV.2005, 359-388.36 Underwood H, Menaker M. Photo-periodically signaling W photo-acception in sparrows:Is the retina involved?J.Science.1970,167:298-301.37 Olives J,Bayle J D.The involvement of the preopti-suprachiasmalic region in the photo-sexual rellex in quailJ. Physiol.1976,72:627-637.38Homma K,Ohta M.Surface and deep pholoreceplorin photo-periodism in birdsMl.In endocrine aspects, edited