淀粉酶的提取要点.doc

。-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：第一天样品的粗处理及粗分离，包括：1） 样品处理2） 离子交换色谱分离3） 紫外检测（紫外测定蛋白），绘出色谱图4） 收集样品第二天对各峰收集样品进行分析，包括：1） 精确测定蛋白含量（Folin-酚）2） 测定酶活3） 比活计算第三天对活性峰及原液进行分析及鉴定，包括：1） SDSPAGE分析（分子量分析）2） 纯化倍数计算等试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。 20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。随着环境科学的发展，不仅需要对大量有机物质进行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。1975年美国Dow化学公司的H.Small等人首先提出了离子交换分离抑制电导检测分析思维即提出了离子色谱这一概念离子。色谱概念一经提出便立即被商品化产业化由Dow公司组建的Dionex公司最早生产离子色谱并申请了专利。我国从20世纪80年代开始引进离子色谱仪器，在我国八五、九五科技攻关项目中均列有离子色谱国产化的项目，对其进行了重点技术攻关。色谱的分类 色谱的分类有多种，主要按两相的状态及应用领域的不同可分为两大类 1. 按应用领域不同分类 制备色谱 半制备色谱 2. 以流动相和固定相的状态分类 气相色谱、气固色谱、气液色谱、液相色谱、液固色谱、液液色谱、超临界色谱、毛细管电泳 离子交换色谱 离子色谱分离主要是应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子。它在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂，以苯乙烯二乙烯苯共聚体为骨架在苯环上引入磺酸基形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或薄壳型或多孔表面层型的物理结构以便于快速达到交换平衡。离子交换树脂耐酸碱，可在任何pH范围内使用，易再生处理，使用寿命长。缺点是机械强度差，易溶胀，易受有机物污染。 离子色谱基本流程图如下图所示：离子交换的分类及常见种类（一）分类离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小，还可分为强、弱两种，即 强酸剂阳离子交换剂 弱酸剂强硷型阴离子交换剂弱硷型 。1.阳离子交换剂阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基。某些交换剂在交换时反应如下：强酸性：R-SO3 -H+ Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOHNa+ R-COONa H+国产树脂中强酸1×7（上海树脂732）和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。2.阴离子交换剂阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺N-（CH3）2和季胺-N（CH3）2等硷性基团。某些交换反应如下：强硷性：R-N+（CH3）2 H·OH- Cl R-N+（CH3）2 ClOH-弱硷性：R-N+（CH3）2 H·OH- Cl R-N+（CH3）2 HClOH-强硷性201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。（二）种类1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素）， 阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。2.交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 阳离子交换剂有CM-Sephaetx C-50，C-50和Sephadex C-25，C-50。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B 上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大， 性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。交换剂的处理，再生与转型新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：1. 新出厂干树脂用水浸泡2 小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水2. 加4倍量0.1-2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性3. 再加4倍量0.1-2N NaOH搅抖4小时，除硷液， 水洗到中性备用。4. 将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。阴树脂转型也同样，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。再生：用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。树脂保存方法使用过的树脂用大量的去离子水洗至中性后，放置于20酒精中，4冰箱保存。再次使用时，需先用大量的去离子水洗至中性，再用0.5N 氢氧化钠和0.5N 氯化钠处理0.5小时，洗至中性即可使用。柱上操作交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。装柱前应先在柱内保留1/3的缓冲液，并排除柱底部气泡，然后再倾入树脂。上样：向层析柱内倾入样品液洗脱与收集不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。1.3 试验流程1.3.1 粗酶液的制备将一定量的发酵酶粉溶于醋酸钠或者磷酸盐缓冲液中，4浸泡12h，1104r/min，4离心10分钟，弃去沉淀，收集上清夜进行分离。(备注：这一步骤已完成)1.3.2 色谱柱的准备（装柱）按标准方法将离子交换树脂装填于色谱柱内，用平衡缓冲液平衡。1.3.3 -淀粉酶的分离 将一定量的样品溶液缓慢上入色谱柱内，先后用平衡缓冲液和洗脱缓冲液洗涤，每隔2分钟收集一次样品，每个样品检测280nm的吸光值，绘出色谱曲线。将每个峰的样品集中起来，以备酶活和蛋白质含量的测定。（备注：具体操作步骤及上样量以ppt课件为准）试验二、-淀粉酶的活性测定及比活计算1.1 试剂及设备3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)葡萄糖标准液（10mg/ml）福林试剂淀粉溶液（10mg/ml）磷酸盐缓冲液（pH6.0，0.02M）722 型（或721 型）分光光度计4 000r/min 的离心机分析天平1.2 原理与方法1.2.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5100g 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。1.2.2 淀粉酶活性测定淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括-55淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应式如下：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6 以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min 钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。1.3 试验部分1.3.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量（按ppt课件为准，以下仅供参考）1.3.1.1 标准曲线的制作（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250g/mL 的牛血清白蛋白溶液。（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通试管，按表1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min 后，以不含蛋白质的1 号试管为对照，用722 型分光光度计于500-650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。（3）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。1.3.1.2 样品测定将各峰收集的样品经一定稀释后，按标准曲线的步骤进行测定。以缓冲液作为空白对照。1.3.2 淀粉酶活性测定1.3.2.1 标准曲线的绘制分别吸取1.0葡萄糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的标准溶液，按表A1的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标（0.5ml以上稀释液葡萄糖含量分别为：100、200、300、400、500、600g），以吸光值为横坐标，绘制标准曲线，列出直线回归方程（Y=KX+B）。1.3.2.2 样品测定将各峰收集的样品经一定稀释后按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：表A1反应顺序样品，标准样品空白标准空白样品稀释液（ml）0.50.5蒸馏水（ml）0.550预热5min依次加入淀粉溶液（ml）1.51.5（第二步）1.5（第二步）混合50保温30min依次加入DNS试剂（ml）3.03.0（第一步）3.0（第一步）混合100煮沸7min（第一步）冷却蒸馏水（ml）101010混合均匀总体积（ml）15.015.015.0反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，AA0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。1.3.2.3 活性计算酶活力单位定义：在60、PH6.0条件下，每小时从1的可溶性淀粉溶液中释放出1微摩尔葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）淀粉酶活性U按下式计算： K（AA0） S（3060）180 U = F其中：U样品淀粉酶活性，U/ml； K标准曲线斜率；F样品溶液反应前的总量，ml；