溶菌酶的紫外分光光度法检测.doc

溶菌酶的紫外分光光度法检测仪器仪表与分析监测92006年第2期溶菌酶的紫外分光光度法检测DetectioninLysozymebyUV-spectrophotometry祁静(渤海大学化学化工学院辽宁锦州121003)摘要文章采用紫外分光光度法对蛋清中溶菌酶的含量进行了分析检测,并进行了方法的稳定性,准确度,精密度,检出限,回收率的实验.结果表明,与传统测定溶菌酶的方法比较,紫外分光光度法具有简便,快速,经济,准确等优点.关键词溶菌酶紫外分光光度法蛋清分析检测中图分类号0657.32文献标识码A溶菌酶又称胞壁质酶(Muramidase),是一种碱性蛋白质,它在自然界中广泛存在于哺乳动物乳汁,体液,禽类的蛋白,微生物体内及木瓜,卷心菜,大麦等植物中.其中以蛋清中的溶菌酶的含量最为丰富,可达0.3.溶菌酶具有溶菌,杀菌,抗病毒,抗肿瘤细胞的作用,而且对人体无任何毒副作用.因此它在食品工业,医疗,生物学等领域有着广泛的应用,溶菌酶含量的检测就具有了现实意义.传统的对溶菌酶的定量分析方法是显色法.即根据溶菌酶通过水解细菌细胞壁中的粘多糖而使之裂解这一特性,将待测样品和一定量的染色小球菌在适宜的条件下反应,染色小球菌被样品中的溶菌酶溶解,而释放出颜色,其颜色的深浅与溶菌酶的含量呈正比,再利用可见分光光度计绘制标准曲线来确定溶菌酶的含量.传统方法存在一定的缺点,其一是因为要用染色小球菌,这种小球菌造价比较昂贵;其二此方法的操作比较麻烦,要求在无菌的条件下进行操作,这对于工业生产来说即不经济又不方便.本文尝试用紫外分光光度法对溶菌酶的含量进行分析检测.l实验部分1.1仪器和试剂仪器:UV一1600型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司),测光方式为双光束,分光器为消象差型闪耀全息光栅,波长扫描范围为1901100nm;1cm石英比色皿;FA1004电子分析天平(万分之一),量筒,移液管,容量瓶,冰箱.试剂:溶菌酶标准品(优级纯),氯化钠(分析一34一纯),鸡蛋(市售,新鲜),二次蒸馏水.氯化钠溶液:分析纯的氯化钠溶解于二次蒸馏水中配制成0.85(w/v)的溶液.1.2检测方法1.2.1溶剂的选择和溶菌酶使用液的配制根据有关文献和国家标准的要求,进行了反复的实验,确定以浓度为0.85的氯化钠溶液作为检测溶剂并作为测试的参比溶液.用分析天平准确称取溶菌酶标准品试剂0.5000g,以0.85的氯化钠溶液为溶剂稀释10000倍,得到50.O0tg/mL的溶菌酶标准使用液.密封于冰箱中冷藏保存备用.1.2.2最大吸收波长的选择取上述溶菌酶使用液1mL,用UV一1600型紫外可见分光光度计在248340nm紫外波长区域内进行波长扫描得吸收曲线,如图1所示.此吸收曲线在281nm处有最大吸收峰.图1溶菌酶溶液的吸收峰1.2.3标准曲线的绘制分别吸取溶菌酶标准使用液1.O0,2.O0,3.O0,4.O0,5.O0mL于10mL容量瓶中,以0.85的氯溶菌酶的紫外分光光度法检测祁静化钠溶液为溶剂稀释至刻度,摇匀.用1cm比色皿,以0.85的氯化钠溶液为参比溶液,于入-_281nm处依次测定各标准溶液的吸光度并绘制标准曲线.如图2所示.C(ue/m1)图2溶菌酶溶液的标准曲线1.2.4样品的测定准确称取新鲜鸡蛋的蛋清样品0.5921g,溶解于0.859/6的氯化钠溶液中并定容至1O0.0ml.按照标准曲线的操作步骤,在入一281nm处测量此样品溶液的吸光度.平行测定5次取结果的平均值,由标准曲线上确定此吸光度对应的溶菌酶的含量.2结果与讨论2.1检测结果得到蛋清中溶菌酶的浓度为17.41ptg/mL.蛋清中溶菌酶的含量一(17.41ug/mL100.0mI)/(0.592110)1009/50.29409/5.此结果与相关文献报道的蛋清中溶菌酶的含量达0.39/6左右相吻合,证明实验结果正确.标准曲线的回归方程的相关系数R一0.9998,说明标准曲线在溶菌酶的浓度为025.O0g/mL之间线性关系良好.2.2方法的稳定性取浓度为5.000g/mL的溶菌酶溶液6份按照本文前述的测定方法,分别于1,2,3,4,5,6h吸光度值,结果如表1所示.计算结果的RSD一0.9209/6,证明此方法的测定结果稳定.表1稳定性实验时间(h)123456吸光度A0.1141O.11580.11490.1152O.11460.11552.3方法的检出限在选定的入射波长入一281nm处,平行测定空白参比液10次,数据记录如表2所示.计算10次结果的RSD=0.913.计算该方法的检出限CL=3Sb/bo.6340ptg/mL.其中:Sb为空白样品10次测量结果的标准偏根据标准曲线及样品溶液吸光度为0.3963,差.b为标准曲线的斜率.表2检出限实验样品标号1234567891o吸光度AO.O142o.o143O.O145o.o143o.o144o.o143o.o144O.O142o.o145o.o144容茵酶浓度/g/mLr0.5168O.5212O.5301O.5212O.5258O.5212O.52580.51680.5301O.52582.4方法的准确度与精密度取标准系列溶液3,4,5,用UV一1600型紫外光度6次,测定结果如表3所示.实验结果的RSD不超过0.4,RE不超过0.55,证明结果的准确可见分光光度计在281nm处测定标准溶液h的吸度和精确度均较高.表3准确度,精密度实验标真实浓度溶茵酶的测量浓度/g/mL相对标准相对平均相对样/lg/mL偏差()偏差()误差()123456平均值115.O014.9914.9714.9314.9915.O915.O615.010.3960.3220.O6722O.002O.132O.102O.142O.072O.122O.072O.110.152O.1240.550325.0025.1125.0125.O524.9925.O325.O425.04O.165O.1130.1602.5方法的回收率采取加标回收法,取等量的蛋清样品溶液5份,分别加入等量的不同浓度的溶菌酶标准液.在281nm下分别测定混合液的浓度并计算回收率,该方法的平均回收率为102.85,RSD为0.858,符合相关标准.3结论本文突破了传统测定溶菌酶的显色法,直接利用紫外可见分光光度计在紫外光区内281nm处进行测量.与传统方法比较,此方法操作非常简便快捷,且数据准确,计算简单,所用试剂经济易得;实验也不受操作条件的限制,不用进行无菌操作.本文以测定蛋清样品中的溶菌酶含量为例,建立了以紫外分光光度法分析检测溶菌酶的新方法.实验表明,此方法的灵敏度高,重现性好,稳定,干扰一35仪器仪表与分析监测2006年第2期小,分析结果的准确度和精密度也很高.因此本文的研究具有现实意义,为溶菌酶的检测提供了新途径.参考文献1LeheningerAL,NeLsonDL,CoxMM.PrincipLesofBiochemistryandEditionJ.NewYork:WorthPubLishers.1993,18O:3123142PerryIJ.eta1.DisulfidebondengineeredintoT4Lysozyme:StabilizationoftheproteintowardthermalinactivationJ.Science.1984,226:5555573楼善贤,苗德林.溶菌酶的研究进展J.中国肿瘤临床.1994,21<9):70971143刘仲敏,何伯安.溶菌酶及其在食品工业中的应用J.食品与发酶工业.1995(5):8O一825-1朱奇,陈彦.溶菌酶及其应用J-I.生物学通报.1998(10):9-106李春联.微量溶菌酶比色测定法在临床诊断上的应用J.同济大学.2002,23(3):251,263(上接第31页)4邱林友.分光光度法测定微量铬J.光谱实验室,19955汪军涛,马卫兴,吕松涛,等.分光光度法测定六价铬的研究J-I.中国环境监测,19976解月珍,谢沅清.电子电路计算机辅助分析与设计M.北京:北京邮电大学出版社,2001(上接第33页)4.3C5000系列(定点,低功耗)该系列相比其它系列的主要特点是低功耗,运算性能比较强,所以适合个人与便携式上网以及无线通信应用,如手机,PDA,GPS等应用,如果作为一个协处理器适用于要求数据运算能力很强的测控仪器.所以本仪器选TMS320C5402作为协处理器.DSP(TMS32OC54O2)外围电路如图3所示.图3DSP外围电路73罗庆尧.分光光度分析M.北京:科学出版社,199283胡华强,卢秀娟.分析化学M.北京:科学出版社,2001E9罗庆尧,曾云鹗,等.分光光度分析M3.北京:科学出版社,1992E蔓曼?皂f5结论提出了一种基于ARM9&DSP的网络嵌入式测控仪器,使用了32位处理器和嵌入式操作系统Linux与DSP相结合,解决了前者单独使用数据处理能力差,实时性不强,和后者单独使用时控制能力差的问题,使系统具有更好的运算能力和