苦菜总黄酮对小鼠脑缺血缺氧保护作用的实验研究.doc

苦菜总黄酮对小鼠脑缺血缺氧保护作用的实验研究【关键词】 苦菜总黄酮；,脑缺血；,脑缺氧；,保护作用,摘要：目的 研究苦菜总黄酮对小鼠脑缺血缺氧的保护作用。方法采用小鼠断头、结扎双侧颈总动脉等脑缺血缺氧模型，观察苦菜总黄酮对脑缺血缺氧小鼠存活时间、断头小鼠喘息时间及脑毛细血管通透的影响；TBA法、NBT法测定小鼠脑缺血缺氧后脑组织MDA含量和SOD活性。结果苦菜总黄酮能显著延长小鼠存活时间、喘息时间，能显著降低缺血缺氧小鼠脑毛细血管的通透性，能显著降低脑组织MDA含量，能显著提高脑组织SOD活性。结论 苦菜总黄酮对小鼠脑缺血缺氧有显著的保护作用，其作用机制可能与提高SOD活性，降低MDA含量有关。关键词：苦菜总黄酮； 脑缺血； 脑缺氧； 保护作用 Study on the Protective Effect of Bitter Vegetable Flavonoids against Cerebral Ischemia and Anoxia in MiceAbstract：ObjectiveTo observe the protective effect of bitter vegetable flavonoids（BVF） against cerebral ischemia and anoxia in mice.MethodsThe model of cerebral ischemia and anoxia in mice was established by decollation and ligating common bicarotid artery the effect of BVF on the survival time of the mice,and the time of catching their breath after mice decollated,and mouse brain capillary vessel permeability were observed. The content of maiondialdehyde（MDA）,activity of superoxide dismutase（SOD）in the brain tissues of cerebral ischemia and anoxia mice were measured by TBA,NBT technology respectively.ResultsBVF could remarkably lengthen the survival time of cerebral ischemia and anoxia mice, and the time of catching their breath after mice decollated,could evidently decrease mouse brain capillary vessel permeability and the content of MDA, increase activity of SOD in the brain tissues of cerebral ischemia and anoxia mice.ConclusionBVF has protective effect obviously on cerebral ischemia and anoxia in mice, its mechanism may be related to the decrease of MDA content and the increase of SOD activity content of MDA,and increase significantly activity of SOD in the mouse brain tissues of cerebral ischemia and anoxia.Key words：Bitter vegetablef flavonoids； Cerebral ischemia and anoxia； Pretective effect 苦菜为菊科植物苦苣菜Sonchus Oleraceus L.的全草。文献1记载苦菜具有清热凉血、解毒消肿功能，久服可安心益气，轻身耐老。现代药理研究证实，苦菜有保肝降酶，抗心肌缺血作用2。本文研究旨在探讨苦菜总黄酮对小鼠脑缺血缺氧的保护作用，并探讨其药理作用机制，更好地为苦菜的临床应用提供科学理论依据。1 材料1.1 动物昆明种小鼠1823 g，雌雄各半，由南华大学实验动物中心提供。1.1.2 药品及试剂 苦菜：采集于湖南永兴；苦菜总黄酮的制备：苦菜茎叶干品，先后用60%，80%乙醇热回流，滤液静置过夜后过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩至浸膏，经检识主要含苦菜总黄酮，高压灭菌后备用，临用前稀释至所需浓度。四乙氧基丙烷为Sigma产品；DTNB为Fluka产品；伊文思蓝（Evans Blue）西德Serve进口分装，中国医药公司北京采购供应站；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。1.3 仪器 THZ-80型恒温振荡器，TDL-2B型高速冷冻离心机，S54型分光光度计，FA1604电子分析天平。2 方法2.1 苦菜总黄酮对急性脑缺血缺氧小鼠的保护作用2.1.1 苦菜总黄酮对急性不完全脑缺血小鼠的影响昆明种小鼠40只，随机分为4组，分别为苦菜组灌胃4.5，9.0，18.0g/（kgd），正常对照组灌胃等体积的生理盐水，1次/d，连续1周。末次给药后1 h，结扎双侧带迷走神经的颈总动脉，观察小鼠存活时间（s）。2.1.2 苦菜总黄酮对断头小鼠喘息时间的影响 分组与给药剂量同2.1.1，末次给药1h后，自小鼠耳后根部快速断头，记录小鼠断头后喘息的时间（s）。2.2 苦菜总黄酮对脑缺血小鼠脑毛细血管通透性的影响 32.2.1 伊文思蓝标准曲线的制备 将伊文思蓝配制成系列浓度（0.39，0.78，1.56，3.12，6.24，12.48，24.96 g/ml），在S54型分光光度计620 nm处测定吸光度（A）值，以浓度为横坐标，以吸光度（A）值为纵坐标，得回归直线方程：y=0.024 6+0.076 4x，r=0.999 0。2.2.2 小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量的测定昆明种小鼠50只，随机分5组：假手术组、模型对照组、苦菜组灌胃4.5，9.0，18.0 g/（kgd）。假手术组与模型对照组灌服生理盐水，其余同2.1.1。末次给药后1 h，假手术组尾静脉注射伊文思蓝50 mg/kg，分离两侧颈总动脉但不结扎，其余各组在结扎两侧颈总动脉前5 mine，尾静脉注射伊文思蓝50 img/kg。结扎3h后断头，小心剥取两侧大脑半球，称重，加入0.5%NaSO4 3 ml与丙酮7 ml，匀浆，密封放置1 h，3 000 r/min离心10 mine，取上清液，以丙酮-硫酸（37）混合液调零，620 nm处测定吸光度。根椐标准曲线计算出脑内伊文思蓝的含量（g/g脑湿重）。2.3 苦菜总黄酮对脑缺血小鼠脑组织MDA 含量、SOD活性的影响2.3.1 小鼠脑缺血后脑组织匀浆液的制备昆明种小鼠50只，随机分5组：假手术组、模型对照组、苦菜组灌胃4.5，9.0，18.0 g/（kgd）。假手术组与模型对照组灌服生理盐水，其余同2.1.1。末次给药后1h，假手术组分离两侧颈总动脉但不结扎，其余各组在结扎两侧颈总动脉3 h后断头，小心剥取两侧大脑半球，称重，按重量体积=19的比例加入预冷的生理盐水（4），用组织匀浆器充分匀浆，将匀浆液以1 500 g，4离心12 mine，取上清液，用考马斯亮法测定总蛋白含量，-70冻存备用。2.3.2 脑组织MDA 含量、SOD活性的测定TBA法4测定MDA的含量，NBT5法测定SOD活性。2.4 统计学处理各组数据以s表示。两组间的差异显著性分析用t检验。3 结果3.1 苦菜总黄酮对小鼠双侧颈总动脉结扎后的存活时间、断头小鼠喘息时间的影响 结果见表1。表1 苦菜总黄酮对小鼠双侧颈总动脉结扎后小鼠的存活时间、断头小鼠喘息时间的影响（略）与正常对照组比较， 1)P0.05 ，2)P0.01；n=10 由表1可见，与正常对照组比较，苦菜总黄酮能显著延长双侧颈总动脉结扎小鼠的存活时间、断头小鼠喘息时间（P0.05 ，P0.01），而且随着剂量增加其作用增强，存在一定的量效关系。3.2 苦菜总黄酮对小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量、MDA 含量、SOD活性的影响结果见表2。表2 苦菜总黄酮对小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量、MDA 含量、SOD活性的影响（略）与假手术组比较，1)P0.05，2)P0.01；与模型组比较，3)P0.05，4)P0.01；*以每克脑湿重计；n=18由表2可见，与假手术组比较 ，模型组小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量、 MDA 含量明显增高，SOD活性明显降低；与模型组比较，苦菜总黄酮能显著降低小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量、MDA 含量，显著提高脑组织SOD活性（P0.05或P0.01）。4 讨论本研究结果表明，小鼠灌胃苦菜总黄酮4.5，9.0，18.0 g/（kgd），1次/d，连续1周，能显著延长小鼠双侧颈总动脉结扎后的存活时间、断头小鼠喘息时间（P0.05 ，P0.01）；模型组小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量、 MDA 含量明显增高，SOD活性明显降低，与模型组比较，苦菜总黄酮能显著降低小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量、MDA 含量，显著提高脑组织SOD活性（P0.05，P0.01）；而且剂量与效应之间存在一定的正比量-效关系。脑缺血后可通过花生四烯酸代谢途径、嘌呤核苷酸代谢途径及NO途径产生自由基，使血脑屏障通透性发生明显改变6，伊文思蓝为一脑血管通透性指示剂，正常情况下不易通过血脑屏障，但血脑屏障受到破坏时，伊文思蓝易于进入脑组织，通过测定各组小鼠脑缺血后脑中伊文思蓝含量，反映脑毛细血管的通透性。实验结果显示，小鼠灌胃苦菜总黄酮4.5，9.