茭白中对菰黑粉菌敏感的蛋白质的筛选和鉴定.doc

茭白中对菰黑粉菌敏感的蛋白质的筛选和鉴定建了茭白愈伤组织培养和菰黑粉菌分离、鉴定、培养的实验体系及茭白与黑粉菌互作的模拟体系，获得了栽培和野生茭白的愈伤组织， 分离鉴定了10个材料的灰茭和正常黑粉菌。分析了不同发育时期茭白茎部的双向电泳，三个时期分别检测到586、622、513个蛋白点，有469个共有蛋白，随着茭白发育，38%的蛋白点呈上调趋势，15%呈下调趋势，40的蛋白点在第二时期最高，三个时期之间有79、14和44个差异点。对灰茭黑粉菌和正常黑粉菌互作、及对照愈伤组织进行双向电泳分析，检测到160、 195和176个蛋白点，89个、77个和80个特异蛋白，44个共有蛋白，24个蛋白在对照和灰茭黑粉菌互作的愈伤组织中表达；49个蛋白在灰茭黑粉菌和正常茭白黑粉菌互作的愈伤组织中表达；3个蛋白点在灰茭黑粉菌互作的愈伤组织中关闭。 1、主要研究内容及研究方法研究内容：1）茭白试验材料的组织培养方法摸索和菰黑粉菌分离方法摸索，获得茭白组织培养材料和菰黑粉菌；2）双向电泳技术的摸索和建立；3）通过双向电泳技术建立茭白与菰黑粉菌互作/未互作以及不同发育时期茭白茎部的蛋白表达的2-D PAGE参考图谱；4）采用胶内酶解及网络数据库等技术鉴定差异明显的蛋白质斑点；研究方法：1）茭白组织培养：选取河姆渡双季茭和野生茭白的茎上互生侧芽或嫩苗，消毒后取最里层的嫩芽 0.5-2mm接到培养基上。放入25黑暗培养箱中培养（采用MS固体培养基）。外植体接种5天左右，在超净工作台中用解剖刀轻轻在其上划开切口。培养条件：25，16h光照培养+8h黑暗培养。每30天继代。2）菰黑粉菌的分离和鉴定：从灰茭上挑取少量黑粉菌冬孢子，将其均匀铺在PDA平板上培养4d。将消毒后的正常茭白切成0.5cm0.5cm的小块置于PDA培养基上培养，每隔12h观察菌落生长情况。挑取特征菌落接种到PDA平板上纯化培养30d后用4mm打孔器于生长活跃的菌落边缘打孔，将圆形菌块接种到PDA平板上。其它培养条件为：28，相对湿度80%。采用菌落形态、孢子形态、和5.8S rDNA-ITS相结合的鉴定方法。3）双向电泳技术：蛋白样品的制备：采用-巯基乙醇-丙酮法提取总蛋白（蛋白提取液：含10%三氯乙酸和0.07% -巯基乙醇的丙酮溶液，蛋白提取液：含0.07% -巯基乙醇的丙酮溶液）。用Bradford法测定蛋白浓度，测定时与溶解待测样品相同的裂解液代替水配制蛋白质标准品。双向电泳：采用IPG-DALT系统的2-D PAGE，电泳过程按改进的胶内加样方法进行，并参照IPGphorTM等电聚焦系统程序指南。根据2-D凝胶电泳数据库提供的数据，第一项选用7cm和17cm（pH4-8）的IPG胶，第二项选用9%-16%线性梯度胶对正常组和处理组的蛋白质组进行分离，银染后得到两者的凝胶图谱。4）图谱分析和蛋白质斑点鉴定：采用GS800 Calibrated Imaging Densitometer（BIO-RAD，USA）扫描，用PDQuest v7.1.1（BIO-RAD,USA）软件进行差异分析（包括蛋白质斑点的检测、量化、背景扣除和点的匹配以及蛋白质斑点表达量变化的分析），寻找该图谱上蛋白质斑点的差异。应用胰蛋白酶等蛋白质水解酶胶内酶解和质谱技术测定差异明显的蛋白质斑点，结合数据库搜索，鉴定被分析的蛋白质斑点。2、主要研究成果，特别是创新之处，并给出必要的支持证据1）建立了一套茭白愈伤组织培养和菰黑粉菌分离的技术体系，目前正在摸索茭白分化的条件，同时通过形态和分子特征相结合的方法对分离的菰黑粉菌进行鉴定；2）建立了茭白双向电泳技术体系，摸索了从总蛋白提取到分离纯化，到双向电泳的上样量、平衡时间、染色条件和方法等整个技术体系；3）分析了茭白不同发育时期蛋白表达的差异，以及与菰黑粉菌互作/未互作时茭白蛋白表达的差异，获得差异蛋白点；4）申请发明专利1项“一种茭白总蛋白质的提取纯化方法”（申请号：200810060113.5）；获得软件著作权1项“ACDAA遗传模型分析软件V1.0”(软件著作权登记号2007SR20913)；5）发表论文4篇，一级刊物2篇，核心期刊2篇：A.我国茭白的生物学研究，长江蔬菜，2008，11：35-34B.茭白总蛋白提取方法及SDSPAGE电泳的改进，世界农业，2008，11：8-10C. Genetic Dissection of net effects between yield and its components in Sea Island Cotton (Gossypium barbadense L.). Agricultural Sciences in China, 2008, 7(9)： 1052-1060D.基于支持向量机(SVMs)的果蝇核心启动子的识别. 生物数学学报, 2006,(5)： 767-7813、研究结果的意义（对基础研究，着重阐明其科学意义；对应用基础研究，着重阐明其指导实际应用的价值）有助于明确菰黑粉菌与茭白的共生作用，促进茭白产量和品质的提高，有助于浙江省效益农业的发展。茭白是茭白与其寄生真菌菰黑粉菌的病态共生体，是茭白与菰黑粉菌长期协同进化的结果。因此，本项目研究结果为明确菰黑粉菌与茭白的共生关系及作用机制分析不同类型的茭白材料对菰黑粉菌的差异反应，为进一步克隆菰黑粉菌敏感基因和通过分子育种手段提高茭白产量和品质奠定基础。有助于在蛋白质水平上明确茭白的孕茭机理。找到相应的对菰黑粉菌敏感或不敏感的，在不同发育阶段表达的蛋白，能够帮助在蛋白质水平甚至可能在基因水平上明确茭白的孕茭机理，为提高茭白品质和产量提供理论基础和实践指导。4、学术界的反映、引用情况，以及转入其他科技计划的情况07年参加全国水生蔬菜研讨会，和与会专家交流了本项目的研究成果和研究思路，获得与会专家的认可，并认为本项目的研究内容和研究成果对阐明茭白的孕茭机理具有重要的意义。本课题组将在本项目研究的基础上进一步申报国家自然科学基金。5、本项研究工作对研究小组、实验室或学科发展所起的作用本项目的实施将十分有助于本研究小组在茭白蛋白质组领域的学术创新，以及为今后开展茭白遗传育种，培育新的种质做了前期的理论和材料积累，为今后的成长和长远发展奠定良好的基础。6、本项研究工作对培养博士生、硕士生的作用本项研究工作培养了两名硕士研究生，硕士学位论文的主要内容分别为：茭白不同发育时期茎部双向电泳分析及茭白内生真菌的初步研究。7、实际完成该课题的研究人员及作用实际完成本课题的研究人员为：叶子弘，项目总设计；郑许松，茭白材料的种植；朱敏，蛋白点分析；胡华军，蛋白样品制备；邹克琴，茭白双向电泳技术建立；刘倩，茭白双向电泳及蛋白点分析；安欣欣，茭白组织培养及双向电泳；尤文雨，菰黑粉菌的分离和鉴定。8、未完成研究计划的请说明理由本项目经过两年的实施已大部分完成项目内容，基本达到项目预期目标，但是也存在一些问题，做了一些调整。项目原计划要对北美种质进行双向电泳分析，寻找差异蛋白点。但由于实验过程中北美种质的组织培