遗传学果蝇杂交实验报告VIP

广州大学综合性实验报告实验课题：遗传学果蝇杂交实验学院 生命科学学院 年级：14级专业班级：生物技术142班姓名 陈子禧 学号1414300004 实验地点：广州大学生化楼指导教师 汪珍春老师 1、 前言果蝇（fruit fly）是双翅目（Diptera），属果蝇属（genus Drosophila）。Morgan（1909）利用黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)发现了连锁与互换定律。果蝇作为实验材料有许多优点:（1）饲养容易，生长繁殖要求较低, 在常温下, 以玉米粉等作饲料就可以生长、繁殖;（2）生长迅速,12天左右就可完成一个世代, 25条件下黑腹果蝇平均产卵量高达375.4粒(P0.01)1,因此在短时间内就可获得大量的子代,便于遗传学分析;（3）染色体数少,只有4对;故本研究采用黑腹果蝇e#和6为研究材料进行正交和反交实验，对果蝇的性状（眼色、体色和翅型）进行观察记录并结合统计学对实验结果进行分析，以验证遗传学三大定律，并尝试培养和分析小量的F2代数据观察连锁交换现象。关键词：黑腹果蝇；遗传学；正交；统计学；遗传学三大定律；连锁交换2、 实验材料品种：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)品系：突变型(e#):长翅、黑檀体、红眼；突变型(6#):小翅、灰身、白眼工具：显微镜、电子天平、培养瓶、棉塞、量筒、烧杯、温度计、玻璃棒、解剖针、毛笔、解剖剪、镊子、恒温恒湿培养箱、电炉药品及材料：燕麦、玉米粉、蔗糖、琼脂粉、酵母粉、丙酸、乙醚等3、 实验方法3.1、果蝇的饲养3.1.1培养基的配制：称量100ml水+0.85g琼脂+7g蔗糖，将上述三份材料倒入白瓷杯，保留约30ml的水待用，将电炉打开，搅拌至80C煮溶将称量的8g燕麦玉米粉干燥混合物与上述保留的30ml冷水混匀成浆糊，搅匀并加入白瓷杯中不断搅拌体系约5min直至煮沸（此时应成糊状），关火等待体系自然降温，温度计测温至80C,倒入1g干性酵母粉和0.4ml丙酸冷却至70C，趁热将白瓷杯的混合物转移至大烧杯，并分装到各个培养瓶。待水珠或水雾散去后，封上纱布并写上制作日期和品系信息及使用者姓名，待24小时或至少隔一夜后使用。 新配制的培养基有效使用期最长为7天，超过7天的培养基水分不足易与瓶壁分离且滋生霉菌，影响实验结果质量。 3.1.2 生活周期：果蝇的生活周期包括四个发育阶段:卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段，本实验中从初生卵发育至新羽化的成虫为一个完整的发育周期，在25，60相对湿度条件下，大约为9至10天（因交配到产卵的时间未能准确观察，故仅能推算为9至10天）。3.1.3 培养条件：25C恒温、60%相对湿度恒湿的培养箱中培养。3.2、果蝇杂交的流程3.2.1杂交实验的果蝇品系本人实验组：突变型(e#)（黑檀色、红眼、长翅）突变型(6#)（灰黄色、白眼、短翅）组员实验组：突变型(6#)（黑檀色、红眼、长翅）突变型(e#)（灰黄色、白眼、短翅）3.2.2杂交实验前的准备工作每一培养瓶要封好纱布绑好橡皮筋贴好标签，注明品系、时间、班别及姓名。分别取原种e#和6#于两个培养瓶中培养78d，当出现较多蛹或蛹变黑时除去原种。然后每隔8h取一次处女蝇，雌雄性别的鉴定主要通过性梳的有无以及背上条纹数量的差异来区分2(见图1)，若超过8h的雌蝇除去，可保留雄蝇，将取出处女雌和雄性果蝇分别置于两个培养瓶中，直到各瓶有68只果蝇。将收集到的处女蝇和雄性果蝇分别置于1号、2号瓶进行杂交，（杂交时间2016.10.12 8:00 转瓶时间10.18 12:00），将转瓶瓶号标记为3号、4号。根据亲本的生活周期（原种产卵至亲本羽化为成虫的时间），推测出本人组的F1由亲本杂交到羽化成虫的时间约为9天。开始对F1的数目与性状进行统计并记录（第一批成虫羽化时间：2016.10.21）以7天为保守时间收集F1代（1、2号瓶的可收集时间截止10.28，已于当天17:30停止收集，3、4号瓶收集时间延迟至10.31）图1 实验过程中雌雄果蝇外形比较及雄性性征.A:雌雄果蝇外形侧面观 B:雄性果蝇性梳Fig.1 External characters of Drosophila melanogaster between male and female；Male sexuality. A:Lateral view of male(left) and female(right)； B:Sexual comb-the sexual character of male 4、 实验结果表1 6# e#果蝇杂交F1实验结果 e#6# (本人） e#6#（组员） 红灰长 172 171 162 0白灰小 0 0 0 156合 计 172 171 162 156Table 1.Characters of filial generation 1st5、 结果分析5.1、性别比分析 根据表1，雌果蝇合计334，雄果蝇合计327，雌雄比例约为1.02以下将假设性别决定的方式为XY型，描绘遗传流程为（图2）,X2检验（卡方检验）（列表）亲本：P X XX Y 配子： X X X Y F1： X X X Y X X X Y雌性 雄性 1 ： 1 图2 果蝇性别遗传流程图示Fig.2 Procedure of genetic sexuality in Drosophila melanogaster表2 性别比X2检验雄性雌性合计实际观测数O327334661理论频数P1/21/21理论数E330.5330.5661O-E-3.53.500.0270.027Table 2.X2-Test of sex ratio由表2计算结果可得：X2=0.027 X20.05=3.84，上述分析均与实验数据基本吻合。所以可以证明果蝇的性别决定方式为XY型。5.2、眼色分析根据实验数据可知（表1），在F1代中，e#6#正交的结果是不论雌雄均为红色，反交的结果是雌性为红眼，雄性为白眼，故可以判定红眼为显性性状，白眼为隐性性状，且控制该性状的基因位于X 染色体上，红眼基因以XW表示，白眼基因以Xw表示。 表3 眼色数据统计e#6# (本人） e#6#（组员）红眼343 162白眼 0 156合计 343 318Table 3.The staticstics of eyes colour上述表3统计数据中正交e#6#产生的子代均为红眼，而反交e#6#中的子代雌性均为红眼，雄性均为白眼。为明显的交叉遗传现象，故假设控制眼色的基因位于X染色体上，正交组e#6#的遗传过程如下图（图3）所示。正交组 亲本：P XW XWXw Y 配子： XW XW Xw Y F1： XW Xw XW Y XW Xw XW Y雌雄均为红眼反交组 亲本：P Xw XwXW Y 配子： Xw Xw XW Y F1： XW Xw Xw Y XW Xw Xw Y雌性红眼 雄性白眼 1 ： 1 图3. 果蝇眼色遗传流程图示Fig.3 Procedure of genetic eye colour in Drosophila melanogaster据上述图3可知，正交组中红眼雌性和红眼雄性的比例符合1:1的关系（在0.05显著标准下符合），同理可知，反交实验会出现交叉连锁，即6#产生的Xw将和e#产生的Y配子结合，导致F1中雄性全为白眼，雌性全为红眼。上述分析均与实验数据基本吻合。故综上所述，假设成立，成功验证控制眼色的基因位于X染色体上。5.3、翅形分析正交e#6#中，雌性亲本的翅形为长翅，雄性亲本的翅形为短翅，子一代全部为长翅；其反交e#6#的雌性亲本为短翅，雄性为长翅，F1的雄性全部为短翅，雌性全部为长翅，由此可见，无论是正交还是反交，都出现了长翅性状，由此可推测长翅由显性基因决定而短翅由隐性基因决定。另外在组员的反交实验中，性状与性别有关，且出现了交叉遗传现象，其中小翅性状和白眼性状出现连锁现象，因此可以假设短翅基因位于X染色体上，相对长翅基因为隐性，短翅基因用Xm表示，故其等位基因用表示XM表示。假设本人正交组e#6#遗传过程如下图（图4）所示。正交组 亲本：P XM XMXm Y 配子： XM XM Xm Y F1： XM Xm XM Y XM Xm XM Y雌雄均为长翅反交组 亲本：P Xm XmXM Y 配子： Xm Xm XM Y F1： XM Xm Xm Y XM Xm Xm Y雌性长翅 雄性短翅1 ： 1图4. 果蝇翅型遗传流程图示Fig.4 Procedure of genetic wing type in Drosophila melanogaster故由上图4可得知，e#6#的子代雄雌均为长翅，同理可推知，反交实验会出现交叉连锁，即6#产生的Xm将和e#产生的Y配子结合，导致F1中雄性全为短翅，雌性全为长翅，长翅雌性和短翅雄性的比例符合1:1的关系（在0.05显著标准下符合）。另外其中短翅性状和白眼性状出现连锁现象可以进一步支持假设。上述分析均与实验数据基本吻合。故综上所述，假设成立，成功验证控制翅型的基因位于X染色体上。5.4、体色分析根据表1显示，突变型(e#)的体色为黑檀色，突变型(6#)的体色为灰黄色，而F1代的体色均为灰黄色。子代体色不因性别不同而有差异，故假设控制体色的基因位于常染色体上，并且黑檀色为隐性性状，灰黄色为显性性状，故控制显性性状的基因以E表示,控制隐性性状的基因以e表示。遗传过程如图5示。 ee EE亲本：P 配子： e e E E F1： E e E e E e E e均为灰色 图5 果蝇体色遗传流程图示Fig.5 Procedure of genetic body colour in Drosophila melanogaster故由上图可知，正交组e#6#的子代均为灰色，同理可得反交组的子代也为灰色，以上分析均与实验数据符合，故综上所述，假设成立，成功验证控制体色的基因位于常染色体上。6、 结论6.1基因位置本实验研究的性状主要为3种，分别为体色、颜色、翅型，而控制以上三种性状的基因分别以眼色 W-w 翅型 M-m 体色E-e 表示。而通过对性别比例（sex ratio）进行卡方检验（X2-Test）我们推断XY染色体控制果蝇性别。另外通过假设遗传流程、卡方检验并与实验数据进行比对，我们可以证明控制体色的E-e基因位于常染色体上；控制眼色的W-w基因位于性染色体（X）染色体上，控制翅型的M-m基因同样位于性染色体（X）染色体上。6.1亲本及F1代的性状及基因型亲本及F1代的性状及基因型如下图（图4）所示体色眼色翅型基因型突变型e#黑檀色红色长翅eeXMWXMW/eeXMWY突变型6#灰黄色白色短翅EEXmwXmw/EEXmwY正交组F1灰黄色红色长翅EeXMWXmw/EeXMWY反交组F1灰黄色红色、白色长翅、短翅EeXMWXmw/EeXmwY Table 4.The characters and genetype of parents and filial generation 1st对果蝇品系进行资料搜集，我们得知突变型(e#)的性状为黑檀色、红眼、长翅，其雌性基因型为eeXMWXMW ，雄性基因型为eeXMWY ；而突变型(6#)的性状为灰黄色、白眼、短翅，雌性基因型EEXmwXmw，雄性基因型为EEXmwY 。正交实验中产生的F1仅具有一种性状，为灰黄色、红眼、长翅基因型有EeXMWXmw和EeXMWY;反交实验中产生的F1有两种性状，分别为灰黄色、红眼、长翅和灰黄色、白眼、短翅，基因型有EeXMWXmw和EeXmwY。以上控制眼色和翅型的基因虽处于同一染色体，但仍能进行交换，称为连锁交换现象，在本实验的F2代（共107只）中同样可以得到体现，后续将继续进行分析。6.2亲本产生F1代的遗传流程图正交组P e# eeXMWXMW X 6#EEXmwY配子 eXMW EXmw EYF1 EeXMWXmw EeXMWY 雌性灰身红眼长翅1 ： 1雄性灰身红眼长翅反交组P e#eeXMW Y X 6#EEXmw Xmw 配子 eXMW eY EXmw F1 EeXMWXmw EeXmwY雌性灰身红眼长翅1 ： 1雄性灰身白眼短翅Fig.6 Procedure of genetic heredity in Drosophila melanogaster6.4 F2代的统计及简要分析表5.F2推测性状比例和实际观察比例红灰长白灰短红黑长白黑短推测性状比例56.2518.7518.756.25实际性状比例57.947.4721.50.93Table 5.The Comparision of filial generation 2nd between presumed characteristic ratio and experimented observed characteristic ratio经过另一个星期培育，采用正交的F1直接繁殖F2代，若不考虑连锁交换现象本人推测有四种性状分别为，红灰长(9/16其中6份3份)；白灰短（3/16其中3份均）；红黑长（3/16其中2份1份）白黑短（1/16均）。但实际数据能观察到白长灰（4只）、白长黑（1只）、红灰短（1只），所以根据上述结果可以判断，性染色体上发生了连锁交换。所以会出现超出本人预计范围内的性状类型，而红灰长（62只）比例为57.94%，与推测中的9/16(56.25%)十分接近，基本与推论吻合，白灰短（8只）7.47%与推测的18.75%相差甚大，红黑长（22只）比例为21.50%，与推测的18.75%较接近，而白黑短（1只）0.93%与推测的6.25%亦相差甚大。但倘若数据量增多，应该比例会逐渐靠近，同样可以计算出控制眼色和翅型基因的交换值，所以通过突变型(e#)与突变型(6#)杂交产F2代，可以研究性连锁遗传、分离律、性染色体与常染色体上基因自由组合, 性染色体的连锁交换, 并可计算交换值的发生5。6.3结果汇总与分析本实验中F1代正交组（本人组）的样本量为343只，反交组（组员组）的样本量为318只，并对正交组产生的F1代交配取得107只的F2代数据。其中通过对F1代的遗传过程假设和经过卡方检验进行分析，在0.05的显著标准下，性别比例符合1:1的关系，其性别决定方式为XY染色体控制；通过假设遗传流程和比对实验结果可以得知控制眼色和翅型的基因位于同一条性染色体上，且会出现连锁交换现象（F2可证明），其中红眼为显性性状，白眼为隐性性状，长翅为显性性状，短翅为隐性性状；另外通过遗传图示和验证结果，我们发现控制体色的基因位于常染色体上，其中灰色为显性性状，黑檀色为隐性性状。根据遗传学的原理，判断显隐性的依据是在F1中能够表现的性状为显性，反之为隐性; 某性状在正反交中的结果相同，则控制该性状的基因位于常染色体上，若出现交叉遗传和隔代遗传则该基因位于性染色体上3。而本次实验主要利用了分离规律、自由组合规律、连锁规律。另外，各种操作的准确性对实验的顺利进行有很重大的意义，培养基的干湿度; 果蝇生长的条件; 处女蝇的选取;性状的准确观察; 处死果蝇的方法; 转瓶的技巧; 快速增加后代数量的方法等。控制好这些影响因素，可大大提高实验结果的准确性47、 特例说明在10月31日23:30最后一次取样中，转瓶4号瓶中出现一只白眼雄性个体，而距离该瓶第一批羽化成虫出现已过去6天稍多，推测可能为F2已经出现，因为样本量总共仅有343只，出现白眼基因突变的可能性较低。经文献查证，发育速率随温度升高明显加快，在15下，完成发育需要长达41 d，而在30下，黑腹果蝇完成发育仅需7 d,并且黑腹果蝇的发育起点温度为12.8，充分完成发育所需有效积温为123.3日度6另外我们的实验期间停电且期间温度较高，或者观察时间较长，有可能导致有效积温上