基因重组技术论文.doc

基因重组技术学生姓名：赵慧芳 学号：20115071261生命科学学院 生物科学专业指导教师：张海滨 职称：教授摘要：基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。发生在生物体内基因的交换或重新组合。包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类。是生物遗传变异的一种机制。 基因重组是指非等位基因间的重新组合。能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换。基因重组是杂交育种的理论基础。 基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。1关键词：基因重组；特点；分离；纯化Abstract: Genetic recombination is the result of the fracture and the connection of different DNA strand DNA fragments of exchange and recombination, the formation of new DNA molecule. In organisms of gene exchange or recombine. Including the homologous recombination, site specific restructuring, transfer function and abnormal four categories. Is a mechanism of biological genetic variation. Genetic recombination is refers to the recombination between alleles. Can produce a large number of variation types, but only to create new genotypes, does not produce new genes. Genetic recombination is the cytological basis of the original cells first division of meiosis, homologous chromosomes split each other, not the free combination between homologous chromosomes and the intersection of the chromatids of homologous chromosomes swap. Genetic recombination is the theoretical foundation of the cross breeding. Gene mutation is refers to the change of the molecular structure of the gene, the gene sequence of DNA nucleotides changed, resulting in the change of the genetic information. Keywords: Genetic recombination；feature；separate；purification1.基因工程的核心目的基因和适当的载体在连接酶的作用下形成重组子，再转入相应的受体细胞进行繁殖，从而使外源基因得到表达。通过分离、纯化、扩增等一系列实验步骤后获得目的基因，再根据欲使目的基因进行有效表达的受体细胞选择适当的载体，然后将目的基因与表达载体在体外进行有效连接。 重组DNA的步骤：连接，转化，筛选。 重组DNA的优点：简单易行方便后续操作，节点处加内切酶位点不破坏目的基因的阅读框1.1黏性末端DNA分子间连接如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连接。缺点：外源DNA和载体都可环化，造成插入的外源DNA有两种相反连接方向。解决方法：去磷酸化，双酶切取代式。两种相同的限制性内切酶分别剪切外源DNA，然后再连接，这那么，载体分子和外源DNA片断将按唯一的一种取向退火形成重组DNA分子。这就是所谓的定向克隆技术。这种技术能够克服插入式（单酶切）带来的缺点。1.2平末端连接T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。1.3同聚物加尾法酸转移酶要求底物DNA上必须带有凸出的3-OH，所以，得先用5-外切酶处理DNA底一个DNA3末端加多聚A，一个DNA3末端加多聚T。但是由于末端核苷物。其他几类还有人工接头连接和其他连接技术如T-载体连接。2.基因转移将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。重组质粒DNA分子转化大肠杆菌的基本步骤：细菌感受态的形成转化因子的吸收整合复合物前体的形成单链DNA转化因子的整合转化子的形成。 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 。大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体，用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴放置12 - 24小时，备用。大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng的载体DNA连接液，混匀，冰浴放置半小时，在42保温 2 分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟，加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时，涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。电穿孔转化：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。33.转化率转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA 。4转化率的影响因素：载体及DNA重组分子方面：载体本身的性质，不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象，质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小，对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。 受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。54.重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 转染(transfection)：是指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。转导和转染的区别：转导(transduction)：通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。转染：噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。 4.1噬菌体的体外包装体外包装：是指在体外模拟噬菌体DNA在受体细胞内的一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体DNA分子包装成为成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。6噬菌体的体外包装的原理：根据噬菌体DNA的体内包装途径，分别获得缺失D包装蛋白的噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的噬菌体突变株。由于不具备完整的包装蛋白，这两种突变株均不能单独包装噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包装物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包装物（含D蛋白），两者混合后就能包装噬菌体DNA。噬菌体DNA体外包装过程：1制备包装物：单独培养两种溶原菌诱导溶菌生长收集包装物。2体外包装第一次包装第二次包装去除碎屑。75.质粒两种病原土壤杆菌根瘤土壤杆菌( Agrobacterium tumefaciens) 和发根土壤根菌( Agrobacterium rhizogenes) 分别含有Ti和Ri质粒为基因克隆载体介导的基因转移。原生质体共培养法取含重组Ti质粒、的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。叶盘共培养法该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化 。优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。悬浮细胞或愈伤组织共培养原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。8 活体接种(inoculation in vivo) 所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。96.基因重组的检测法6.1物理检测法6.1.1凝胶电泳检测法 证明重组体质粒在分子量上的增加,一种直截了当的方法是分离质粒的DNA并测定其分子长度。对此。电子显微镜测定无疑是有效的方法，但对于以筛选为目的实验来说,则显得过于烦琐。因此,常用操作程序比较简单的凝胶电泳测定法来代替。带有外源DNA插入序列、分子量较大的重组体DNA在凝胶中的迁移速率，比不具有外源DNA插入序列、分子量较小的质粒DNA来得缓慢些。 根据这种差别就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有外源DNA插入序列的分子量较大的重组质粒。6.1.2 R环检测法采用mRNA作探针的核酸杂交法，来检测具有外源DNA插入片段的重组体分子。一种是R-环检测法，另一种是放射性探针检测法。在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70)的甲酰胺溶液中, 双链的DNA-RNA分子稳定。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体,叫做R-环结构。可以在电子显微镜下观察到。可以鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域。使待检测纯化的质粒DNA，在含mRNA分子的缓冲液中局部的变性。如果质粒DNA分子上存在着与mRNA探针互补的序列，那么这种mRNA就将取代DNA分子中的相应的互补链，形成R-环结构。然后放置在电子显微镜下观察,这样使可以检测出重组体质粒的DNA分子。106.2免疫化学检测法免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种 。116.3核酸序列分析DNA-蛋白质筛选法：DNA-蛋白质筛选法(Southwestern screening)是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。用于筛选并分离表达融合蛋白质的克隆。合成此种融合蛋白质的重组DNA分子中的外源DNA序列，编码一种能专门同某一特定DNA序列结合的DNA结合蛋白质(DNA-binding protein)。127.应用从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。随着遗传学研究的深入，人们逐渐发现细菌的结合、转导、转化、转座等现象，在这些事件中存在明显的遗传物质转移，而这种转移与生物繁殖过程中的遗传物质的转移有显著区别。这些现象后来成为基因工程的基因转移技术。可以用于细菌、真菌和动、植物的基因工程体构建。147.1基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域一。农作物生物技术的目的是提高作物产、量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。7.2基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。参考文献：1 徐长波 王巍杰. 双水相萃取技术研究进展 河北河北理工大学 化工与生物技术学院 2009，（3）2廖文彬,鲍时翔 1红树林放线菌产抗菌活性物质的分离纯化研究 药物生物技术, 2004, 11 (6) : 376 3803解翠华,阮丽君,夏焕章,等 1