耳叶苔科系统发育重建与分歧时间估计耳叶苔毕业设计论文.doc

摘要： psbA基因编码的D1蛋白是光系统（PS）的重要组成部分，参与维持PS反应中心构象的稳定和电子的传递。以耳叶苔科植物的psbA基因序列作为研究材料，通过预测耳叶苔科各物种间的分化时间，推测可能影响其进化的外部因素；应用位点模型、分支模型、分支位点模型以及FEL模型对psbA基因进行适应性进化分析，检测可能受到正选择的位点，为D1蛋白的结构和功能研究提供参考信息。研究结果显示耳叶苔科植物最早的分化发生在距今约121Ma年前，进入新生代分化速度明显加快，推测与被子植物的兴盛有关；通过适应性进化分析，在D1蛋白中检测到4个正选择位点，30个高度保守的位点，研究结果再一次验证了psbA基因高度保守的特性。关键词：耳叶苔科；psbA基因；分歧时间；适应性进化； Divergence Time Estimation and Adaptive Evolution Analysis of Frullaniaceae收稿日期: 修改稿收到日期：基金项目：作者简介：孙君波(1986- )，男（汉族），硕士生，专业方向：植物学。E-mail:通讯作者：苏应娟 (1965- )，女，博士，研究方向：进化遗传学。Tel: E-mail: Abstract: D1 protein encoded by psbA gene is an very important component of Photosynthesis System (PS) and contributes to the stability of PSs reaction center and electron transfer. The divergence time is estimated using psbA gene of Frullaniaceae, the adaptive evolution of psbA gene is also analyzed under site model, branch model, branch-site model and FEL model, respectively. The result shows that the first divergence event happened about 121Ma ago, the speed of divergence accelerated after Cenozoic; Four sites were founded under positive selection while thirty sites under negative selection and no site was founded to experienced coevolution. The result of our research is another evidence of the highly conservative of psbA gene.Key words: Frullaniaceae; psbA gene; divergence time; adaptive evolution; coevolution 在相当长的一段时间里，人们普遍认同这样一种观点：白垩纪被子植物的兴起伴随着包括蕨类植物在内的众多非种子维管植物多样性和丰富度的急剧下降。Schnelder等基于化石记录利用分子钟重新估算了被子植物和蕨类各自的分化时间，研究结果表明现存的绝大多数蕨类植物的分化发生在白垩纪被子植物繁盛之后，即蕨类在适应由被子植物提供的新的生境的过程中发生了物种的“辐射式”增长。之后对水龙骨科附生蕨类rbcL基因的适应性进化分析表明蕨类植物的确可以通过功能基因的进化达到适应外界新环境的目的。苔藓植物是一类与蕨类具有相似起源与进化历史的植物类群，对蕨类的研究结果提示我们苔藓植物在进化过程中极有可能也经历了类似的物种快速分化的阶段。耳叶苔科（Frullaniaceae）是苔类植物中较大的一科，包括毛耳苔属（Jubula）和耳叶苔属（Frullania）。现存的耳叶苔科植物约有800多种 1-2 ，主要分布于热带、亚热带地区，其生活方式以附生为主。由于在水分、光照等方面存在较大差异，推测耳叶苔科各物种在进化过程中相关的功能基因会发生适应性进化，尤其是与光合作用相关的基因。 光系统（PS）定位于叶绿体的基粒类囊体膜上，是光反应“Z”链上的第一个蛋白-色素复合体，同时也是自然界中唯一一个能将水分子分解成氢和分子氧的复合体。PS主要负责光能的吸收、传递和转化，在光合作用过程中发挥重要作用。 psbA基因编码的D1蛋白是构成PS反应中心的核心蛋白之一，与D2蛋白共同构成了PS的基本骨架；D1蛋白也是PS中一个重要的功能蛋白亚基，直接能与了光合作用过程中原初电荷的分离与电子传递，因此，D1蛋白在结构上发生的任何改变都有可能极大的影响PS的结构与功能，进而影响光合作用的效率。因此在时间框架下对psbA基因进行适应性进化分析将有助于进一步阐明光合作用中功能基因适应性进化的机制。生物进化就是生物与环境之间相互作用并导致遗传系统与表型发生一系列不可逆改变并不断适应环境的过程（杨继等. 植物生理学，高等教育出版社）。在分子水平上进行适应性进化分析可以为蛋白的结构和功能研究提供重要的参考信息。尤其是1962年Zuckerkandl提出分子钟假说之后，人们可以在时间框架下研究生物的进化历史，并将生物的进化与地质史上的重大事件联系起来，有助于深入理解环境变迁影响生物适应性进化的机制。经过近五十年的发展与完善，如今的“分子钟”假说已经较好的解决了不同谱系间分子异速进化的问题，即使在缺少化石资料的情况下也可以很好的估计物种的分歧时间，这为研究早期物种的适应性进化提供了契机。鉴于psbA基因在光合作用中的重要作用以及GenBank中已经收录了大量的psbA基因全序列，本研究选取110种耳叶苔科植物的psbA基因全序列进行适应性进化分析，目的在于：（1）通过估计耳叶苔科各物种的分化时间，推测可能影响其进化的地质事件；（2）检测psbA基因各位点在进化过程中承受的选择压力，进而推断在维持D1蛋白结构、功能以及适应环境方面发挥重要作用的位点，为D1蛋白的结构功能研究提供参考资料。1、材料和方法1.1序列数据从GenBank下载110种耳叶苔科植物以及6种作为外类群的细鳞苔科植物的psbA基因全长序列(表1)。应用Clustal X 2.0软件9对序列进行多重比对并加以手工校正；编辑后的序列矩阵中，每条序列包含有1059个核苷酸，353个密码子。本文中氨基酸位点编号参照Lejeunea pallescens（ABL86495）的编码。1.2 耳叶苔科系统发育重建与分歧时间估计运行Modeltest 3.7软件选取最优的核苷酸进化模型。根据Modeltest选取的GTR+I+G模型设置似然模型参数，用Mrbayes 3.1.2软件经贝叶斯途径构建系统发育树。系统发育模型的后验概率依据Mropolis-Hastings-Green算法通过4条链（Markov Chain Monte Carlo, MCMC）运行15 000 000代估计。MCMC分析以随机树起始，每100代保存1棵树，使用Tracer v1.4.1软件12检验各参数的收敛程度。最初的37500棵树被当作老化样本摒弃，以剩余样本构建系统发育树。采用BEAST v1.5.3软件10中的UCLD（Uncorrelated Lognormal Distributed Relaxed Clock Model）分子钟模型估算各分支的分歧时间，利用最近共同祖先时间（Tmrca，the most common ancient）对各分支的分歧时间加以校正。根据Modeltest 3.7软件11选取的核苷酸替换模型设定MCMC运算的参数，迭代运算30 000 000代，每1000代保存1株样本；利用Tracer v1.4.1软件12检验各参数的收敛程度。将最初的7500棵树作为老化样本摒弃，用剩余样本重建时间尺度下的一致树。表1 植物材料及其psbA基因GenBank登录号 Table 1 Plant materials and their psbA gene GenBank accession numbers中文名Chinese name学名Species nameGenebank登录号Accession number-Frullanoides mexicana Slageren. EF011851-Frullania aculeata Taylor FJ380698喙尖耳叶苔Frullania acutiloba Mitt.FJ380572-Frullania aff. neurota Costa & Gradstein FJ380637-Frullania amplicrania Steph.FJ380599-Frullania ampullifera J.B. Jack & Steph.FJ380561-Frullania anderssonii Angstrom.FJ380558-Frullania angulata Mitt.FJ380703-Frullania anomala E.A. Hodgs. FJ380611-Frullania apicalis Mitt.FJ380695尖叶耳叶苔Frullania apiculata (Reinw., Blume & Nees) Dumort. FJ380681折扇耳叶苔Frullania arecae (Spreng.) GottscheFJ380624-Frullania armitiana Steph.FJ380676-Frullania aterrima (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380680-Frullania atrata (Sw.) Dumort.FJ380687-Frullania azorica Sim-Sim et al.FJ380586缅甸耳叶苔Frullania berthoumieuii Steph.FJ380563细茎耳叶苔Frullania bolanderi Austin.FJ380671-Frullania brasiliensis RaddiFJ380700-Frullania brittoniae A. Evans.FJ380592-Frullania californica (Austin ex Underw.) A. EvansFJ380658-Frullania cf. madothecoides Davis AY607942-Frullania chevalieri (R.M. Schust.) R.M. Schust. FJ380616-Frullania congesta (Hook.f. & Taylor) Hook.f. & Taylor ex Gottsche et al.FJ380645-Frullania cuencensis TaylorFJ380636-Frullania deplanata Mitt.FJ380568-Frullania depressa Mitt.FJ380634-Frullania diptera (Lehm.) Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380570-Frullania duthiana Steph.FJ380593-Frullania eboracensis GottscheAY688827-Frullania eboracensis subsp. Parvistipula (Steph.) R.M. Schust.FJ380588-Frullania ecklonii (Spreng.) Spreng.FJ380622皱叶耳叶苔Frullania ericoides (Nees ex Mart.) Mont.FJ380550波叶耳叶苔Frullania eymae S. Hatt.FJ380562-Frullania falciloba Taylor ex Lehm.FJ380544-Frullania fengyangshanensis R.L. Zhu & M.L. So FJ380596-Frullania ferdinandi-muelleri Steph.FJ380575-Frullania fragilifolia (Taylor) Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380667-Frullania fugax (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380609-Frullania fulfordiae S.Hatt.FJ380608暗绿耳叶苔芽胞变种Frullania fuscovirens var. gemmipara (R.M.Schust. & S.Hatt.) S.Hatt. & P.J.Lin FJ380590短瓣耳叶苔Frullania gaudichaudii (Nees & Mont.) Nees & Mont.() FJ380665-Frullania gibbosa Nees FJ380638-Frullania glomerata (Lehm. & Lindenb.) Nees & Mont.FJ380613-Frullania gracilis (Reinw., Blume & Nees) Dumort.FJ380674-Frullania grossiclava Steph.FJ380656-Frullania hamata Steph.FJ380651-Frullania hattorii von Konrat & Braggins FJ380678-Frullania holostipula S.Hatt. & D.G. Griffin FJ380627-Frullania howeana Steph. FJ380559细瓣耳叶苔Frullania hypoleuca NeesFJ380639-Frullania incumbens Mitt.FJ380610石生耳叶苔Frullania inflata GottscheFJ380670-Frullania intermedia (Reinw., Blume & Nees) Dumort.FJ380652-Frullania intumescens (Lehm. & Lindenb.) Lehm. & Lindenb. FJ380690-Frullania jackii Gottsche FJ380595-Frullania kunzei Lehm. & Lindenb. FJ380697-Frullania lobulata (Hook.) Dumort. FJ380619-Frullania magellanica F.Weber & Nees FJ380618-Frullania meyeniana Lindenb. FJ380693-Frullania microcaulis Gola FJ380620-Frullania microphylla (Gottsche) Pearson FJ380668-Frullania mirabilis J.B.Jack & Steph.FJ380685列胞耳叶苔Frullania moniliata (Reinw., Blume & Nees) Mont.AY507484-Frullania monocera (Taylor) Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380574-Frullania moritziana Lindenb. & Gottsche FJ380691-Frullania multilacera Steph.FJ380673尼泊尔耳叶苔Frullania nepalensis (Spreng.) Lehm. & Lindenb.FJ380580厚角耳叶苔Frullania nodulosa (Reinw., Nees & Blume) NeesFJ380650-Frullania obcordata Lehm. & Lindenb.FJ380641-Frullania obscurifolia Mitt. FJ380604-Frullania patula Mitt. FJ380567-Frullania peruviana Gottsche FJ380704-Frullania pittieri Steph. FJ380692-Frullania plana Sull.FJ380583-Frullania polysticta Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380660-Frullania ptychantha Mont.FJ380644-Frullania purpurea Steph.FJ380672-Frullania reflexistipula Sande Lac.FJ380573-Frullania regularis Schiffner FJ380654-Frullania repandistipula Sande Lac. FJ380646-Frullania reptans Mitt.FJ380603褶瓣耳叶苔Frullania riojaneirensis (Raddi) SpruceFJ380628-Frullania riparia Hampe ex Lehm.FJ380598-Frullania rostrata (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. & Nees FJ380615齿叶耳叶苔Frullania serrata Gottsche FJ380683-Frullania sheana S.Hatt.FJ380675-Frullania solanderiana Colenso FJ380614-Frullania sp. Pocs & PocsFJ380679-Frullania sphaerocephala Spruce FJ380621-Frullania spinifera Taylor FJ380560-Frullania spinigastria S.Hatt.FJ380566-Frullania squarrosula (Hook.f. & Taylor) Hook.f. & Taylor ex Gottsche et al. FJ380547-Frullania subcaduca S.Hatt. FJ380597-Frullania subdentata Steph. FJ380682-Frullania subincumbens S.Hatt. FJ380605-Frullania subnigricaulis var. subtruncata S.Hatt FJ380565-Frullania subrostrata S.Hatt. FJ380677欧耳叶苔Frullania tamarisci (L.) Dumort.AM396284-Frullania tamarisci subsp. asagrayana (Mont.) S.Hatt. FJ380657-Frullania tamarisci subsp. Nisquallensis (Sull.) S.Hatt.FJ380661塔拉大克耳叶苔Frullania taradakensis Steph.FJ380591-Frullania tetraptera Nees & Mont.FJ380633-Frullania trinervis (Lehm.) Lehm. & Lindenb. FJ380647-Frullania usamiensis Steph FJ380589-Jubula bogotensis Steph.AM396281毛耳苔Jubula hutchinsiae subsp. javanica (Steph.) Verd.AY507492-Jubula hutchinsiae subsp. pennsylvanica (Steph.) Verd.AY607954-Lejeunea cancellata Nees & Mont. ex Mont.EF011810-Lejeunea cavifolia (Ehrh.) Lindb. Emend. BuchAM396279-Lejeunea cerina voucher Wilson et al.EF011820-Lejeunea cladogyna EvansAY607958-Lejeunea flava (Sw.) NeesEF011789-Lejeunea pallescens Mitt.EF011772-Lejeunea paucidentata (Steph.) GrolleEF011826-Nipponolejeunea pilifera AM396291-Nipponolejeunea subalpinaAM3962901.3 序列变异程度分析 用BioEdit version 35将核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列并进行比对。根据公式 H(l) = -Sf(b,l)ln(f(b,l) 计算各氨基酸位点的熵值（Entropy value）并绘制熵图（Entropy plot）。每个位点的熵值与其他位点的状态无关，只取决于该位点上各类氨基酸残基出现的频率。熵值的大小反映该位点变异程度的高低36,37。1.4 适应性进化分析采用进化分析软件PAML 4.113中的位点模型、分支模型以及分支-位点模型（A模型）分析耳叶苔科D1蛋白各位点在适应性进化过程中经受的选择压力：位点模型假定系统树不同分支所经受的选择压力相同，但同一分支上的不同氨基酸位点经受的选择压力不同。本研究选用位点模型中的3 对模型：M0 (单比率模型)和M3 (离散模型)、 M1a (近中性模型)和M2a (正选择模型)以及M7 (beta模型)和M8 (beta&模型) 14-15。其中模型M0、M1a以及M7是空模型，假设条件中不允许 1，而模型M2a、M3以及M8的假设条件允许 1。模型M2a、M3以及M8和他们各自的空模型（M0、M1a以及M7）是相互嵌套的，可以对它们进行似然比检验 (likelihood ratio test, LRT),检验统计量为2 ( = 10，1、0分别表示两个模型下的最大似然值)，依2分布检验其显著性, 自由度为两个模型参数数目的差值。分支模型15,16允许不同分支所经受的选择压力不同。其中单比率（one-ratio）模型是最简单的模型，假设进化树上所有分支经受的选择压力相同，即所有分支具有相同的值；自由比率（free-ratio）模型假设不同的分支经受不同的选择压力，即不同分支具有不同的值。分支-位点模型17,18中的A模型把所有分支分为两类：前景分支和后景分支，只有前景分支可能受到正选择作用。该模型中假设存在四类位点：0类位点在所有分支中都是保守的，其值（0）介于0到1之间；1类位点在所有分支中受到中性选择的作用，其值（1）等于1；2a类位点在背景分支中受到负选择，但在前景支中受到正选择；2b类位点在背景支中受到中性选择，但在前景支中受到正选择。该模型包括两种似然比检验：检验1和检验2，根据Yang的建议，本研究采用检验213。此外，将耳叶苔科psbA基因序列提交在线服务器Datamonkey（/）19采用FEL（Fixed Effects Likelihood model)模型分析各氨基酸位点经受的选择压力。最后将序列信息提交在线服务器SWISS-MODEL（/repository/）进行同源建模21-23。2 结果2.1 耳叶苔科系统发育重建与分歧时间估计图1为基于贝叶斯法构建的耳叶苔科各物种psbA基因的系统发育关系。由构建的系统发育树可以看出，耳叶苔科较明显的分为两大支（后验概率为1.00）：第一支由毛耳苔属的Jubula bogotensis Steph.、Jubula hutchinsiae subsp. javanica (Steph.) Verd.和日鳞苔属的Nipponolejeunea pilifera、Nipponolejeunea subalpina组成，这与Jrn Hentschel等24所报道的一致；第二支由毛耳苔属Jubula hutchinsiae subsp. pennsylvanica (Steph.) Verd.和所有耳叶苔科的物种组成。其中Jubula hutchinsiae subsp.pennsylvanica (Steph.) Verd.处于基部位置。为准确估计耳叶苔科各主要支系的分歧时间，本研究采用Jochen Heinrichs等25报道的日鳞苔科与耳叶苔科的分歧时间进行单点校正。分析结果显示，耳叶苔科第一次分化发生在约121百万年前，进入新生代（约65.0百万年前）之后分化速度明显加快，分析可能是与白垩纪被子植物的兴盛以及古新世-始新世最热地质事件有关。图1 基于耳叶苔科psbA基因序列数据和UCLD分子钟模型构建的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of Frullaniaceae established from psbA gene sequences with uncorrelated lognormal distributed relaxed clock model2.2 序列变异程度分析图2 耳叶苔科D1蛋白各位点的熵值图Fifure 2 Entropy plot for amino acid residues in D1 protein of Frullaniaceae 图2为耳叶苔科D1蛋白各位点的熵值图。熵值为零表示该位点高度保守，熵值越大说明该位点发生的改变越多，变异程度越高。由图我们可以看出耳叶苔科psbA基因中大部分位点是高度保守的，只有少数的位点在进化过程中发生了改变。经统计，全长为353个残基的D1蛋白前体共有18个位点发生了变异，占序列全长的5.1%；其中有6个位点位于C末端的非功能区，该区域只存在于D1蛋白前体中，在成熟D1蛋白中被剪切除去5；其他12个变异位点则分散分布在D1蛋白的功能区中。这些变异位点的变异程度普遍较低（熵值介于0.04和0.35之间），只有位点30I和155T的变异度较高（熵值分别为0.66781和0.64956）。2.3 耳叶苔科psbA基因正选择位点的鉴定 用PAML 4.0b10软件计算得耳叶苔科psbA基因在位点模型、分支模型以及分支-位点模型下的对数似然值和各参数估计值（表2）。在位点模型中，第一对模型M0-M3用于检测作用于各位点上的选择压力是否存在差异。模型M3的似然值= -3907.386458，模型M0的似然值= -3985.506892，似然比检验统计量2 =156.240868，明显大于d.f.=4、P=95%时2检验的临界值9.49，模型M3统计上显著优于M0（表3），由此可推断耳叶苔科psbA基因各位点上经受的选择压力显著不同，即不同位点的值显著不同。模型M2a以及M8的假定条件中均允许1，并同时检测到同一个氨基酸位点，即155 T（P99%），受到正选择，LRT检验结果显著。在分支模型中，通过比较自由比率模型和单比率模型共检测出A、B、C三个分支可能发生正选择 (图1)，其值均为999.00。在分支-位点模型中分别以这三个分支作为前景分支进行分析，结果只在分支A和分支C检测到一个正选择位点：19 N。但在随后的LRT检验中，分支A和分支C的检验统计量2 分别为0.423062和0.422382，均小于d.f.=4、P=95%时2检验的临界值3.84，检验结果并不支持位点19N是一个统计上显著的发生正选择的氨基酸位点，推测可能是由于前景分支选择压力放松造成的假阳性结果。表2 各类位点间可变比值模型下的参数估计值和对数似然值Table 2 Parameter estimates and log-likelihood values under models of variable ratios among sites模型Modelsnp似然值参数估计值Estimated value of parameters正选择位点Positive selection sites位点模型Site modelsM0（单一比值） M0：One ratio175-3985.506892= 0.02650无 NoneM1a（近中性）M1a：Near neutral176-3933.082580p0=0.97603, 0=0.02397P1=0.00810, 1=1.00000不允许Not allowedM2a（选择）M2a：Positive selection178-3924.066915p0=0.97656, P1=0.02060，P2=0.00284 0=0.00844, 1=1.000002=6.08838 155 T*M3（离散）M3：Discrete179-3907.386458p0=0.92026, p1=0.07690, p2=0.002840=0.00000，1=0.23603，2=5.74112155 T*M7（beta）M7：beta176-3928.684116p=0.00500，q=0.10114不允许Not allowedM8（beta &）M8：beta &178-3907.890409p0=0.99716，p=0.01082，q=0.26453, p1=0.00284，w=5.74080155 T*分支模型Branch models单比率（one-ratio）175-3985.506892= 0.02650无 None自由比率(free-ratio)347-3925.532334A=999.0000，B=999.0000，C=999.0000无 None分支-位点模型Branch-site models分支a零假设A0Null model A0177-3929.967965p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000，0=0.00812，1 = 1.00000，2 =1.00000不允许Not allowed备选假设AAlternative model A178-3929.756434p0= 0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000，0=0.00812，1=1.00000，2=84.3396919 N （0.755）分支b零假设B0Null model B0177-3932.680023p0=0.97597，p1=0.02403，p2a+p2b=0.00000，0=0.00811，1=1.00000，2=1.00000不允许Not allowed备选假设BAlternative model B178-3932.680023p0=0.97596，p1=0.02404，p2a+p2b=0.00000，0=0.00811，1=1.00000，2=1.00000无 None分支c零假设C0Null model C0177-3929.970251p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000，0=0.00812，1=1.00000，2=1.00000不允许Not allowed备选假设CAlternative model C178-3929.759060p0=0.00000，p1=0.00000，p2a+p2b=1.00000，0=0.00812，1=1.00000，2=96.2103919N (0.873)此外，位点模型检测到大量的负选择位点，说明耳叶苔科植物的psbA基因非常保守。模型M0由序列数据估计得各位点的平均值为0.0265，表明净化选择在psbA基因的进化过程中起主导作用。模型M2a和M8均允许位点受到正选择作用，在统计上也显著优于它们各自对应的空模型M1a和M7。模型M2a的结果显示psbA基因中有97.7%的位点受到负选择的作用（=0.00844）。同时模型M8也检测到99.7%的位点处于负选择压力下。所有的分析结果均支持耳叶苔科psbA在进化上是高度保守的。表3 似然比值检验统计量（2）Talbe 3 Likelihood ratio statistics (2)模型比较Comparion2 2 自由度d.f.位点模型Site modeM0 vs. M3156.24086849.49M1a vs. M2a18.03133025.99M7 vs. M841.58741425.99M8 vs. M8a22.24697613.84分支模型Branch modelM0 vs. F119.949116172206.87分支-位点模型Branch-site modelA0 vs. A0.42306213.84B0 vs. B0.00000013.84C0 vs. C0.42238213.84.注：np表示模型中参数的数目；“*”和 “*”分别表示在95%和99%水平上检测到的正选择位点。Note: np stands for the number of parameters in different models. “*”and“*”stand for the positively selected sited were founded under 95% and 99% credible level, respectively. 应用在线分析软件Datamonkey的FEL模型分别检测P=0.1、P= 0.05、P=0.01时psbA基因上的选择压力变化。P=0.1时共检测到4个正选择位点（155T、203I、345A、351V）和84个负选择位点；P=0.05时共检测到1个正选择位点（155T）和65个负选择位点；P=0.001时检测到1个正选择位点（155T）和30个负选择位点（图3 A）。在FEL模型下检测到的正选择位点的值都接近于无限大，统计结果显著，表明这些位点几乎没有发生同义替换（图3 B）。除检测到正选择位点外，在P=0.1、P= 0.05、P=0.01时还分别检测到84、65、30个高度保守的位点（分别占氨基酸残基总数的23.80%、18.41%、8.50%），推测这些保守位点与维持D1蛋白的结构和功能有关，表明耳叶苔科psbA基因相当保守。AB图3 耳叶苔特psbA基因在Datamonkey中的分析结果A:Datamonkey检测到的正负选择位点数；B：30个高度保守位点的dN以及dS值Figure 3 The Datamonkey analysis result for the psbA gene of FrullaniaceaeA: The numbers of negatively and positively selected sites in Datamonkey; B: The dN and dS values of 30 highly conserved sites.2.4 正负选择位点的定位由SWISS-MODEL预测得到D1蛋白第10到344号位点的三维结构，用Raswin软件将检测到的正选择位点和高度保守位点在三维结构上进行定位。正选择位点155T和203I分别定位在跨膜-螺旋B和D上(图4)，另两个正选择位点345A和351V位于C末端的九个氨基酸残基的延长区（该区域在成熟的D1蛋白中被切除）。将FEL模型检测到的30个高度保守的位点在D1蛋白的三维结构上进行定位发现，这些位点大多在维持D1蛋白的结构稳定和电子的传递方面扮演重要的角色。有 11个位点（33F、115I、130E、132E、133L、162P、163I、205V、270S、271L、286T）定位在跨膜-螺旋上（图5），由此可见这些跨膜-螺旋对于维持D1蛋白结构和功能非常重要；另有8个位点（77I、130E、228T、252H、263A、270S、271L、323R）是D1蛋白与D2蛋白间发生相互作用的位点；另有两个位点（252H、271L）还参与了QB结合“口袋”的形成，而QB在D1蛋白上的结合位点正是多种有机农药的作用位点，这些位点的突变与植物各种抗性特征的形成有关33。其他的位点参与了D1蛋白膜两侧结构域的形成，可能在维持D1蛋白结构和电子的快速传递方面发挥作用。图4 psbA基因编码D1蛋白三维结构以及正选择位点的空间位置（基质侧在上，类囊体腔侧在下） Figure 4 The 3-D structure of D1 protein encoded by psbA gene and the position for the positively selected sites(The cytoplasmic side is on top,the lumenal side on the bottom).图5 psbA基因编码D1蛋白比对结果 (用红色阴影标出部分表示五处跨膜结构域，分别用H1、H2、H3、H4、H5表示)。Figure 5 The alignment result for D1 protein encoded by psbA gene(Five transmembrane regions are highlighted, signed by H1、H2、H3、H4、H5, respectively)3 讨论本研究利用已报道的耳叶苔科与细鳞苔科的分歧时间（155.9 10.3百万年前）进行单点校正，估计得耳叶苔科psbA基因第一次分化事件，即毛耳苔属和耳叶苔属的分化，发生在距今约121百万年的白垩