生物技术制药第七章 酶工程制药.ppt

第七章酶工程制药 第一节概述 一 酶的特性 酶是生物催化剂 大多数酶的本质是蛋白质 有些酶是核酸 酶作为生物催化剂的 除具有一般催化剂的特性 加快反应速度 降低反应活化能 不改变反应平衡点 反应前后无数量和性质变化等外 还具有独自的特点 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性易受调节和控制 酶由国际酶学委员会分为六大类 氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 裂合酶类 异构酶类 合成酶类 二 酶工程简介 1 定义 是酶学和工程学相互渗透 发展而形成的一门新的技术科学 它是从应用的目的出发研究酶 应用酶的特异催化功能 并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术2 酶工程的内容 20世纪20年代初出现 当时主要是自然酶制剂在工业上的大规模应用 1953年提出固定化酶技术 1969年利用该技术成功拆分了混旋氨基酸 1971年第一届国际酶工程会议提出的酶工程主要内容是 酶的生产 分离 纯化 固定化 固定化的反应器 酶与固定化酶的应用 1 酶的分离 提纯 大批量生产及新酶和酶的应用开发2 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究3 酶生产过程中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究4 酶的分子改造与化学修饰 以及酶的结构与功能之间关系的研究5 有机相中酶反应的研究6 酶的抑制剂 开发及其应用研究7 抗体酶 核酸酶的研究8 模拟酶 合成酶 酶分子的人工设计 合成的研究用农杆菌做载体将外源基因导入植物基因组的方法比较成熟 3 现代酶工程的研究内容 第二节酶的来源和生产 一 酶的来源 酶普遍存在于生物体中 可直接从生物体中提取分离 化学合成方法目前还不成熟 早期是以动植物为原料进行提取 由于动植物生长周期长 来源有限 受地理 气候和季节等因素的影响 不适于大规模生产利用微生物来生产酶制品是一个更好的选择 优点1 微生物种类繁多 动植物体内的酶在微生物中几乎都可以找到2 繁殖快 生产周期短 培养简便 并可以通过控制培养条件来提高产量3 微生物具有较强的适应性 通过各种遗传变异手段能培育出新的高产菌株 二 酶的生产菌 1 对菌种的要求 产酶量高 酶的性能符合使用要求 最好是胞外酶 不是致病菌 在系统发育上与病源体无关 不产生毒素 稳定性好 不易变异退化 不易感染噬菌体 能利用廉价原料 发酵周期短 易于培养2 生产菌来源菌种保藏机构 有关研究部门 从自然界中分离筛选 土壤 深海 温泉 火山 森林都是菌种采集地 筛选包括菌样采集 菌种分离 初筛 纯化 复筛 生产性能鉴定 生产菌的改良 基因突变 基因转移 基因克隆 3 常用产酶微生物 大肠杆菌 一般属于胞内酶 需要经过细胞破碎才能得到 谷氨酸脱羧酶 用于测定谷氨酸含量或 氨基丁酸 天冬氨酸酶 催化延胡索酸加氨生成L 天冬氨酸 苄青霉素酰化酶 生成新的半合成青霉素或头孢霉素 半乳糖苷酶 用于分解乳糖 枯草杆菌 淀粉酶 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 碱性磷酸脂酶 青霉菌 产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶 青霉素酰化酶 橘青霉用于生产脂肪酶 葡萄糖氧化酶 凝乳蛋白酶 黑曲霉 有胞外酶和胞内酶 糖化酶 淀粉酶 酸性蛋白酶 葡萄糖氧化酶 脂肪酶 纤维素酶 米曲霉 糖化酶和蛋白酶 在传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用 木霉 纤维素酶 含有较强的17 羟化酶 常用于甾体转化 根霉 糖化酶 淀粉酶 转化酶 酸性蛋白酶 脂肪酶 纤维素酶 含有较强的11 羟化酶 常用于甾体转化 链霉菌 葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶 纤维素酶 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 含有丰富的11 羟化酶 可用于甾体转化 啤酒酵母 酿造啤酒 酒精 饮料酒和面包制造 可生产转化酶 丙酮酸脱羧酶等的生产 植物细胞 大蒜 超氧化物歧化酶 木瓜 木瓜蛋白酶 菠萝 菠萝蛋白酶 三 提高药用酶产量的措施 1 添加诱导物对于诱导酶的发酵生产 在发酵培养基中添加适当的诱导物 可使产酶量显著提高 如乳糖诱导 半乳糖苷酶 纤维二糖诱导纤维素酶诱导物可分为三种 酶的作用底物 酶的反应产物 酶的底物类似物2 控制阻遏物浓度有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用 应设法解除阻遏作用来提高酶的产量3 添加表面活性剂可分为离子型和非离子型 离子型对细胞有毒害作用 只能使用非离子型 可聚集在细胞膜上 增加细胞通透性 有利于酶的分泌 可增加酶的产量4 添加刺激剂在植物细胞培养生产次级代谢产物的过程中 添加某些刺激剂可显著提高次级代谢的物的产量5 添加产酶促进剂植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1 20倍 第三节酶和细胞的固定化 使用纯酶的缺点只能使用一次 成本高 产品分离困难 酶溶液很不稳定 容易变性和失活固定化酶的优点性能稳定 可反复使用 降低了成本 易与产品分离 简化下游操作 背景 一 固定化酶的制备 1 定义限制或固定于特定空间位置的酶 即经物理化学方法处理 使酶变成不易随水流失即运动受到限制 而又能发挥催化作用的酶制剂 2 特点 可以多次使用 而且在多数情况下 酶的稳定性提高 反应后 酶与底物和产物易于分开 产物中无残留酶 易于纯化 产品质量高 反应条件易于控制 可实现转化反应的连续化和自动控制 酶的利用效率高 单位酶催化的底物量增加 用酶量减少 比水溶性酶更适合于多酶反应 1 载体结合法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 2 交联法 3 包埋法 网格型 微囊型 4 选择性热变性法 专门用于细胞固定化的方法 即将含酶的细胞在适当温度下处理 使细胞膜蛋白变性 但酶蛋白不变性而使酶固定于细胞内 3 酶和细胞的固定化方法 二 固定化细胞 1 定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法2 特点无需进行酶的分离纯化 细胞保持酶的原始状态 固定化工程中酶的回收率高 固定化酶比细胞内酶稳定性高 细胞内酶的辅因子可自动再生 细胞本身含多酶体系 可催化一系列反应 抗污染能力强 第五节酶工程在医药工业中的应用 工艺简单 效率高 生产成本低 环境污染小 产品收率高 纯度好 还可制造出化学方法无法生产的产品 酶工程的优点 一 酶在疾病预防和治疗方面的应用 1 蛋白酶临床上使用最早 用途最广的药用酶之一 消化剂用于治疗消化不良和食欲不振 如胃蛋白酶使用时常常与淀粉酶 脂肪酶等一起制成复合酶制剂 以增加疗效 片剂 可口服 消炎剂对各种炎症有很好的疗效 它能分解一些蛋白质和多肽类炎性物质 蛋白酶经组织注射可治疗高血压由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原的部分肽段水解生成运动迟缓素和胰血管舒张素 从而使血压下降 2 淀粉酶消化药3 脂肪酶消化剂 假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒 可用于预防和治疗高血脂病4 右旋糖苷酶水解右旋糖苷生产小分子产物 对龋齿有显著的预防作用 可加到牙膏和漱口水中5 溶菌酶抗菌 消炎 镇痛作用 作用于细胞壁 使其受到破坏 而使病原菌 腐败性细菌等溶解死亡6 超氧化物歧化酶抗氧化 抗辐射 抗衰老 保护机体的DNA 蛋白质和细胞膜免受超氧负离子的破坏 对红斑狼疮 皮肤炎 结肠炎 白内障 风湿性关节炎 氧中毒等疾病有显著疗效 对辐射有防护作用7 乳糖酶治疗乳糖缺乏症 有些人或婴儿肠道中缺乏乳糖酶 饮用含有乳糖的牛奶等食品时 由于不能分解乳糖 在肠道中 乳糖会因为细菌分解而产生有机酸 刺激肠道引起呕吐8 链激酶可催化纤维蛋白酶原 激活成纤维蛋白酶 将纤维蛋白水解 使血栓溶解9 尿激酶溶解血栓 二 固定化细胞法生产6 氨基青霉烷酸 青霉素G或V经青霉素酰化酶作用 水解除去侧链后的产物称为6 氨基青霉烷酸 6 APA 也称无侧链青霉素 6 APA是生产半合成青霉素的最基本原料 目前从6 APA的数万种衍生物中已筛选出数十种半合成的耐酸 低毒的广谱抗生素 1 技术原理 E Coli斜面细胞固定化细胞青霉素G V转化液滤液6 APA 培养 固定 转化 过滤 抽提 2 工艺路线 1 大肠杆菌的培养斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基 发酵培养基的成分为蛋白胨 氯化钠 苯乙酸 自来水 用氢氧化钠调酸度为7 0 在55 16kP下灭菌30分后备用 在250毫升摇瓶中加入发酵液培养液30毫升 将斜面接种后培养18 30小时的大肠杆菌D816 产青霉素酰化酶 用15毫升无菌水制成菌细胞悬液 取1毫升悬浮液接种至装有30毫升发酵液培养基的摇瓶中 在摇床上28 170转每分振荡培养15小时 如此依次扩大培养 直至1000 2000升规模通气搅拌培养 培养结束后用高速管式离心机收集菌体 备用 2 大肠杆菌固定化取湿菌体100公斤 置于40度反应罐中 在搅拌下加入50升10 戊二醛5升 在转移至搪瓷盘中 使之成为3 5厘米厚的液层 室温放置2小时 再转移至4度冷库过夜 待形成固体凝胶后 通过粉碎和过筛 使其成为直径为2毫米左右的颗粒状固定化大肠杆菌细胞 用蒸馏水以酸度7 5和0 3摩尔每升磷酸缓冲液先后充分洗涤 抽干 备用 3 固定化大肠杆菌反应堆制备将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中 即成为固定化大肠杆菌反应堆 反应器规格为直径70 160厘米 4 转化反应取20公斤青霉素G钾盐 加入到1000升配料罐中 用0 03摩尔每升 pH7 5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素G钾盐浓度为3 用2摩尔每升氢氧化钠溶液调pH至7 5 7 8 然后将反应器及pH调节罐中反应液温度升刀0度 维持反应体系的酸度在7 5 7 8范围内 以70L min流速使青霉素G钾盐溶液通过固定化大肠杆菌反应堆进行循环转化 直至转化液酸度不变为止 循环时间一般为3 4小时 反应结束后 放出转化也8 再进入下一批反应 5 6 氨基青霉烷酸的提取上述转化液经过滤澄清后 滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100升左右 冷却至室温后 于250升搅拌罐中加50升醋酸丁脂充分搅拌提取10 15分 取下层水相 加1 克每毫升活性炭于70度搅拌脱色30分 滤除活性炭 滤液用6摩尔每升盐酸调酸度至4左右 5度放置结晶过夜 次日滤取结晶 用少量冷水洗涤 抽干 115度烘2 3小时得成品6 氨基青霉烷酸 收率为70 80 三 固定化酶法生产5 复合单核苷酸 1 技术原理5 复合单核苷酸可用于治疗白血球下降 血小板减少以及肝功能失调等疾病 核糖核酸经磷酸二脂酶作用 可分解为腺苷 胞苷 尿苷 鸟苷等一磷酸化合物 该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞 谷氨酸发酵菌细胞 麦芽根等生物材料中 本法以麦芽根为材料制备磷酸酶 2 工艺路线 1 磷酸二脂酶的制备取干麦芽根 加9 10倍体积的水 用2mol L的HCl调酸度至5 2 于30 条件下浸泡15 20小时 然后加压去渣 浸出液过滤 滤液冷却至5 加入2 5倍体积的5度95 冷工业酒精 5度静置2 3小时后 吸去上层清夜 回收乙醇 下层离心收集沉淀 用少量丙酮以乙醚先后洗涤2 3次 真空干燥 粉碎得到磷酸二脂酶 备用 2 固定化磷酸二脂酶的制备取上述磷酸二脂酶200克 用1 5 硫酸铵溶液溶解 过滤得到酶液 另取湿ABXE 纤维素40公斤 加入0 5度蒸馏水至80升 搅拌下先后加入1摩尔每升盐酸和5 亚硝酸钠溶液各10升 搅拌均匀 于0 5度下反应 150分 抽滤 滤饼迅速用预冷的0 05摩尔每升盐酸和蒸馏水各洗3次 抽干后 将滤饼投入上述磷酸二脂酶溶液中 搅拌均匀后用1摩尔每升碳酸钠溶液调pH8 0 搅拌反应30分 用冷水洗3 4次 抽干 得到固定化磷酸二脂酶 备用 3 转化反应取2公斤核酸 缓慢加至预热至60 70度的360升 pH5 00 001摩尔每升氯化锌溶液中 用摩尔每升氢氧化钠溶液调至pH5 0 5 5 滤除沉淀 将清液升温至70度 加入上述湿的固定化磷酸二脂酶40公斤 于67度维持pH5 0 5 5 搅拌反应1 2小时 根据增色效应 用紫外吸收法判断转化平衡点 转化完成后 滤出转化液 用于分离5 单核苷酸 固定化酶再继续用于下一批转化反 4 5 复合单核苷酸的分离纯化将上述转化液用6摩尔每升的盐酸调酸度至3 滤除沉淀 滤液用6摩尔每升氢氧化钠调酸度至7 进入已处理好的氯 型阴离子交换树脂柱 流速为2 2 5升每分 吸附后 用250 300升去离子水洗涤柱床 然后用3 氯化钠溶液以1 1 2升每分流速洗脱 当流出液pH达到7时开始部分收集 直至洗脱液中不含核苷酸为止 合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制 5 精制及灌封上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器浓缩后 测定核苷酸含量 再用无热源水稀释至20毫克每毫升 加入0 5 1 0 药用活性炭 煮沸10分 脱色和除热源 滤除活性炭 滤液经除6号菌漏斗或0 45微米孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封 即为5 复合单核苷酸 四 固定化酶法生产L 氨基酸 1 概述氨基酸可用于医药 食品以及农业 合适比例的混合液可直接注入体内补充营养 氨基酸作为增味剂 可增加香味促进食欲 还可作为饲料制造人造纤维 塑料等L 氨基酸可化学合成 但化学合成得到的是混旋体 还需拆分 拆分方法有物理化学法 酶法等 其中酶法最为有效 产生的产物纯度较高 2 工艺路线 1 固定化氨基酰化酶的制备将预先用pH7 0 0 1摩尔每升磷酸缓冲液处理的DEAE 葡聚糖 A 25溶液1000升 在35度下与1100 1700升的天然氨基酰化酶水溶液一起搅拌10小时 过滤后 得DEAE 葡聚糖 酶复合物 再用水洗涤 所得固定化酶的活性可达16 7万 20 0万单位每升 活性得率为50 60 2 L 氨基酸的制备上述制得的氨基酰化酶装柱 将化学合成的混旋氨基酸上柱 根据拆分的对象不同 选用不同的流速 通常进料流向采用自上而下为宜 将酶柱流出液蒸发浓缩 然后调节pH 使L 氨基酸在等电点条件下沉淀析出 通过离心分离后 可收集得到L 氨基酸粗品和母液 粗品在水中进行重结晶 可进一步纯化 而在母液中可加入适量乙酐 加热盗0度 其中的乙酰 D 氨基酸就会发生为消旋反应 产生乙酰 DL 氨基酸混合液 在酸性条件下 pH1 8 析出的外消旋混合物可重新作为底物进入酶柱水解用固定化法连续生产L 氨基酸 产物的纯化比较简单 收率也比游离酶法要高 因此生产单位量L 氨基酸所用的底物量少 固定化酶很稳定 用于酶的费用大大减少 生产工艺可自动控制 改善了劳动强度 大大减少了用于劳动力方面的费用 因此经济意义很大 第六节酶工程研究进展 一 酶的化学修饰 1 目的和意义 1 天然酶的缺陷 易于变性失活 酸 碱 有机溶剂 热 容易受产物和抑制剂的抑制 工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内 底物不溶于水 或酶的米氏常数过高 酶作为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用 2 酶的化学修饰 对酶在分子水平上用化学方法进行改造 即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团 特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接 从而改变酶分子的酶学性质的技术 3 目的 提高酶的稳定性 降低或消除酶分子的免疫原性 医药 4 意义 扩大了酶制剂的应用范围 同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段 2 常用化学修饰剂 1 要求 较大相对分子量 良好的生物相容性和水溶性 分子表面有较多的反应活性基团 修饰后酶的半衰期较长 2 常用修饰剂 糖及糖的衍生物 右旋糖苷 右旋糖苷硫酸酯 糖肽 葡聚糖凝胶 聚乳 高分子多聚物 聚乙二醇 聚乙烯醇 生物大分子 肝素 血浆蛋白质 聚氨基酸 双功能试剂 戊二醛 二胺 其他 固定化酶载体 糖基化试剂 甲基化试剂 乙基化试剂和小分子有机化合物 3 修饰方法 1 修饰酶的功能基团 酶分子中可解离的基团 如氨基 羟基 羧基 巯基等都可以修饰 如脱氨基可消除酶分子表面氨基酸的电荷 通过碳二亚胺反应 可以改变侧链羧基的性质 通过酰化反应可改变侧链羟基的性质 2 酶分子内或分子间进行交联 应用某些双功能试剂可将酶蛋白分子之间 亚基之间或分子内部不同肽链部分进行共价交联 3 修饰酶的辅因子 可将辅因子共价结合在酶分子上 或引入新的或修饰过的具有强反应性的辅因子 4 酶与高分子化合物结合 蛋白质或多糖结合后可提高稳定性如 淀粉酶在65 时半衰期仅为25min 用右旋糖酐修饰后 其半衰期可延长至63min 稳定性提高抗各类失活因子的能力提高抗原性消除体内半衰期延长最适酸度扩宽酶化学性质改变 绝大多数经修饰后Vm不变 但有的修饰后Km会增大 对组织分布能力改变如 葡萄糖苷酶经Alb修饰后 有利于肝细胞对其摄取利用 辣根过氧化物酶被聚赖氨酸修饰后 对细胞的穿透能力增加100倍 4 修饰酶的特性 5 前景 酶分子经过化学修饰后 并不是所有的缺点都可以克服了 并且修饰的结果难以预测 今后 应选用更多的 合适的修饰方法 如使用基因工程法 蛋白质工程法 人工模拟法和某些物理修饰法等 使酶的性质进一步改善 二 人工模拟法 人工模拟酶的概念又称为人工酶或模拟酶 是根据酶的作用原理 用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物人工模拟酶的特点结构简单 具有高效和高适应性的特点如丝氨酸蛋白水解酶的模拟酶能同时结合两分子底物分子在合成的聚乙烯亚胺上引入十二烷基和咪唑基 形成的芳香硫酸酯酶比天然酶活力高100倍 1 模拟酶 环糊精 1 结构由几个D 吡喃葡萄糖残基通过 1 4糖苷键连接而成 每个葡萄糖残基呈现椅式构象 整个分子类似环柱形分子 2 作用原理由于环糊精分子空穴边缘有许多羟基 能溶于水 而空穴内部基本是疏水的 所以能从水溶液中抽提出有机小分子 并将其束缚在空穴中 这种现象类似于酶的活性中心与底物的结合 当然环糊精对其束缚的分子有选择性 被束缚的分子必须有适当的形状与疏水性 3 催化特点参与反应的底物分子先被环糊精分子包接 再与其发生反应 与酶促反应十分相似 已成功模拟了转氨酶 核糖核酸酶 碳酸苷酶等 2 分子印迹 指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程 该特定分子称为印迹分子或模板 1 分子印迹的过程 选定印迹分子和功能单位 让它们之间发生互补作用 形成印迹分子 功能单位复合物 用交联剂在印迹分子 功能单位复合物周围发生聚合反应 形成交联的聚合物 从聚合物中除去印迹分子 得到对印迹分子具有选择性的聚合物 2 印迹方法 非共价分子印迹首先是印迹分子与功能单位相混合 二者以非共价键发生反应 然后功能单位与交联剂发生共聚合 形成高交联的刚性聚合物 最后使印迹分子从聚合物上脱离 并留下一个在形状和功能基团位置上与印迹分子相互补的识别部位共价分子印迹印迹分子与功能基团形成共价键 在与交联剂发生共聚合后 用化学方法将印迹分子从这个高度交联的聚合物上除去 3 应用范围 分子印迹聚合物可作为剪裁分离