酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望.doc

酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望酶抑制法快速检测食品中农药残留及重金属的研究现状及展望摘 要：本文综述了酶抑制法测定食品中农药和重金属残留的原理，检测中常用的酶类、检测技术以及酶抑制法在实际应用过程中的问题。酶抑制法具有检测时间短、成本低、操作简便等特点，是目前我国农药残留及重金属检测的一种有效的初筛方法。关键词：酶抑制；农药残留；重金属；快速检测前言对日益严峻的全球化环境污染问题，环境工程技术与生物技术的结合发展，为环境保护污染治理提供了新的技术手段。传统的污染治理方法存在着诸多的自身缺陷。主要表现在：处理效率低下、占地广、浪费土地资源和能源、处理成本高、效果不尽理想、容易产生新废弃副产物，甚至产生新的污染源。所以以环境生物技术为新技术体系解决环保污染成为当今乃至未来发展的方向。而酶与酶技术的开发与应用是环境生物技术中重要的部分。现代研究表明，酶与酶技术与环境保护的关系十分密切。酶与酶技术以实际应用的要求为目的，利用酶的催化特性对对象进行有用物质的生产或有害废物的分解。几年来，环保用酶制剂与酶技术已经开始引起学术界的关注。由于农药和化肥的滥用或使用不当，蔬菜中农药和重金属残留严重影响了人们的健康1。随着人们生活水平的提高和环境意识的不断加强，食品中农药和重金属残留问题越来越受到人们的关注。为了保障消费者的安全和健康，提高农产品的质量安全水平，增强农产品的国际竞争力，我国政府决定加强蔬菜中农药和重金属残留的监控，建立健全农药及重金属残留的监测体系2。目前我国已经发展了很多切实可行的检测技术，其中，酶抑制技术具有快速、简便、灵敏及成本低等优点，深受广大基层监督部门、生产基地及市场的欢迎。1 酶抑制速测技术原理简介酶抑制法是一种简便、灵敏、经济的快速检测方法，目前在有些国家已经推广应用，在我国一些大城市，如北京、上海、南京、厦门等城市的蔬菜批发市场也建立了快速检测试验室。对上市的蔬菜进行粗筛，严禁农药和重金属残留明显超标的蔬菜销售。1.1酶抑制法检测农药残留原理有机磷酸酯类（OPs）、氨基甲酯类（CBs）和拟除虫菊酯类是我国目前杀虫剂的三大支柱。其中，有机磷和氨基甲酸酯类占杀虫剂总量的70 %以上3，也是对人畜毒性较强的两类杀虫剂，是目前蔬菜中农药残留的控制重点。有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂具有相同的作用靶标乙酰胆碱酯酶(AchE) 。它们抑制动物体内的乙酰胆碱酯酶(AchE) 的活性，从而导致神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常的神经传导，甚至引起动物的中毒或死亡。根据这一昆虫毒理学原理，用在对农药残留检测中，通过测定蔬菜提取液对AchE 的抑制之后，酶与底物结合状况，可以用来表征蔬菜提取液对酶活性的抑制作用，从而判断蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药是否超标。酶抑制法通常是根据测定酶水解底物后产物的含量与标准品相比来进行定量测定，主要方法有以下4 种：1）p H 法。测定底物水解后产生的乙酸；2）电位滴定法。将底物经水解后产生的乙酸进行电位滴定；3） 压力测定法。测定底物水解后的产物乙酸与碳酸氢钠反应所放出的CO2气体压力；4）比色法。测定底物水解产物与显色剂反应后的颜色变化。以比色法为例，如果提取液中含有有机磷类或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就会被抑制，酶就无法水解底物，产生的水解产物就没有或很少，从而不显颜色或颜色变化很小。反之，如蔬菜提取液中无有机磷类或氨基甲酸酯类农药残留或很低，酶的活性就不会被抑制或抑制很少一部分，加入的底物就会被水解，与显色剂反应就会产生颜色或随时间变化颜色变化较大。用分光光度计测定吸光值随时间变化，计算抑制度，就可以判断蔬菜中有机磷类或氨基甲酸酯类农药的残留情况。1.2 酶抑制法检测重金属原理酶是维持生物体新陈代谢的重要催化剂，进入生物体内的重金属离子与体内某些酶的活性中心具有特别强的亲和力，使酶失去活性。酶抑制法测定重金属的基本原理就是进入生物体内的重金属离子与体内某些酶的活性中心具有特别强的亲和力，使酶失去活性。重金属离子与形成酶活性中心的巯基或甲巯基结合后，改变了酶活性中心的结构与性质，引起酶活力下降，从而使底物酶系统产生一系列变化，诸如使显色剂的颜色、pH、电导率和吸光度等发生改变，这些现象可以直接用肉眼加以区别或通过电信号、光信号被检测到，这样就可以判断样品中是否有重金属存在4。2 检测用酶2.1 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7）是一种催化乙酰胆碱分解的水解酶，具有能被OPs和CBs类农药强烈抑制的特性。乙酰胆碱酯酶以多种分子形式存在，按其分子特征可分为球型（对称型）及尾型（不对称型）。球型又可以分为两个亚类，即与膜结合的疏水性蛋白及可溶性蛋白。不同分子型一线胆碱酯酶具有相同的催化活性及Km值，但电泳迁移率及氨基酸组成有差别5。乙酰胆碱酯酶是多分子型糖蛋白，来源于不同种属的乙酰胆碱酯酶其一级结构差异较大。不同生物来源和不同分子型的乙酰胆碱酯酶在结构上的差异，使得它们在被有机磷农药抑制方面有不同的选择性和灵敏度6。乙酰胆碱酯酶主要存在于神经元和神经肌肉接头处，为膜结合蛋白7，广泛存在于动物的组织、血液、昆虫组织及植物中。在生态毒理学研究中，常采用双分子速率常数（Ki）来评价AChE对有机磷农药的敏感性。Ki值越大，表明农药的抑制作用越强，或酶的敏感性越高。不同酶源对农药的Ki值存在很大差异，表明不同来源的乙酰胆碱酯酶存在敏感性差异。同种昆虫不同品系的AChE结构和性质有所不同，因此对不同杀虫剂的敏感性也不同。无论采用何种检测方法，酶都是决定检测方法灵敏度和可靠性的最关键因子。使用高活性、高敏感性、性质稳定的乙酰胆碱酯酶不仅可以提高检测灵敏度，而且可提高检测的准确性，降低测定误差。2.2 植物酶利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的特异抑制作用发展的酶化学分析法，已广泛应用于痕量和微量有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测，但是乙酰胆碱酯酶来源于动物体，材料昂贵，且保存困难。近年来发展了用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法8。该方法的原理是利用植物水解酶水解2，6 - 二氯乙酰靛酚，根据反应溶液在水解前后颜色的变化，用眼睛或仪器辨别农药对酶的抑制程度。在有机磷或氨基甲酸酯类农药存在时，植物水解酶的活性受抑制，靛酚的蓝色变浅。植物酶法在测定过程中无需使用有机溶剂，预处理方法简单，测定速度快，成本低廉，因此有推广应用的价值。2.3 脲酶土壤酶活性大小可以敏感地反映土壤重金属污染状况，许多学者先后提出了脲酶、蔗糖酶、磷酸酶等作为土壤污染水平的指标9，其中最为敏感的是脲酶( urease) 。脲酶广泛存在于自然界中，主要来源于豆类植物，如刀豆脲酶、黄豆脲酶等。脲酶可催化尿素水解，产生CO2 和NH3，反应速度比无脲酶催化快104 倍10。当样品中存在重金属离子时，脲酶活性受到抑制，作为其分解产物的氨也相应减少。样品中的重金属离子对脲酶活性抑制率的高低，可以反映重金属离子量的多少，根据指示剂颜色或反应液pH 值的变化，就可以对样品中的重金属离子进行定性或半定量分析。和文祥等11通过对脲酶与Hg2+、Cd2+间关系的研究，表明：不同状态脲酶对Hg2+、Cd2+的反应表现出类似的规律性变化，即Hg2+、Cd2+抑制脲酶活性，其中Hg2+、Cd2+复合污染的影响幅度最大，Hg2+的生态毒性最强；相关分析显示脲酶活性均可表征样品Hg2+、Cd2+污染的程度。2.4 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（GOD）是一种需氧脱氢酶，它能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。利用金属离子对葡萄糖氧化酶辣根过氧化物酶（POD）催化体系酶活的抑制作用检测重金属已见报道。刘京萍等12利用葡萄糖氧化酶抑制法检测食品中镉、锡、铅的残留，对葡萄糖氧化酶过氧化物酶反应体系条件进行优化，选择2，4-二氯酚为显色剂，做了温度、试剂用量、反应时间等试验，确定了最佳反应条件；利用金属离子对酶活的抑制作用，测定了重金属离子镉、锡、铅对葡萄糖氧化酶活力的影响。所测Cd2+、Sn2+、Pd2+检出限分别为1.3、0.4、1.4 g/mL。2.5 磷酸酯酶磷酸酯酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。在许多生物体中都普遍存在的一种磷酸酶是碱性磷酸酶。周礼恺13研究了不同用量重金属Hg2+，Cd2+和Pb2+对脲酶和磷酸酯酶等酶活性的影响，重金属对酶抑制作用顺序为Hg2+Cd2+Pb2+，且随金属浓度的增大而增强。余寿娜等14研究了重金属Cd2+、Hg2+复合污染对脲酶和酸性磷酸酶活性的影响。结果表明Cd2+、Hg2+单一及复合污染都对脲酶和酸性磷酸酶的活性具有明显抑制作用，且随重金属浓度增强而增强（浓度1 mg/kgCd2+除外）。与单一Cd2+或Hg2+污染相比，Cd2+和Hg2+复合污染对脲酶和酸性磷酸酶活性的抑制作用均表现为一定的协同作用。除此之外，蛋白酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、转化酶、丁酰胆碱脂酶和异柠檬酸脱氢酶等也可用于痕量重金属的测定。3 酶抑制检测技术3.1 农药残留酶抑制检测技术农药残留酶抑制法检测方法主要包括：酶片法、比色法、胆碱酯酶生物传感器法。3.1.1 酶片法酶片法是将敏感生物的胆碱酯酶和乙酰胆碱类似物2，6-二氯靛酚乙酸酯经固化处理后加载到滤纸片上，2，6-二氯靛酚乙酸酯在胆碱酯酶的催化作用下迅速分解，生成靛酚（蓝色）和乙酸。若样品中含有机磷和氨基甲酸酯类农药，胆碱酯酶活性被抑制，不发生水解反应，无蓝色物质生成。根据颜色变化可直接判断有机磷、氨基甲酸酯类农药是否存在，蓝色示农药残留，浅蓝色或白色示无农药残留。目前使用的农药速测卡和农药残留速测箱都属于酶片法。3.1.2 比色法比色法是将待测样品提取液与敏感生物中提取的胆碱酯酶作用，以碘化硫代乙酰胆碱或碘化硫代丁酰胆碱等为底物，以5，5-二硫代-2，2二硝基苯甲酸为显色剂，反应一定时间后，用分光光度计在波长412 nm处比色，根据吸光值变化计算胆碱酯酶抑制率，判断有机磷和氨基甲酸酯类农药残留是否超标。市场上使用的酶主要是以敏感家蝇头部提取纯化的乙酰胆碱酯酶（AChE）和从动物血清中提取的丁酰胆碱酯酶（BuChE）。农业部药检所提供的BuChE检测农药残留的方法己在各地推广使用，其测定时间为40 min。3.1.3 胆碱酯酶生物传感器法胆碱酯酶生物传感器是利用农药对靶标酶活性的抑制作用研制的生物传感器，它是将酶（如AChE）固定在载体上，如将AChE 固定在石英晶体表面，随着酶反应的速率和程度的改变，电流频率随着发生变化，通过测定电流频率判断AChE 被抑制的程度。3.2重金属酶抑制检测技术3.2.1 生物传感器法重金属含量酶抑制检测技术生物传感器法和胆碱酯酶生物传感器法原理相同，已有很多学者做了相关研究。Tadeusz 等15研制的酶传感器是将脲酶包埋在pH敏感铱氧化电极表面的PVC 膜上构建而成的，通过将反应系统电势下降的初始速率（与酶初始反应速率成正比）转化为抑制率，来检测汞和其他重金属离子。不同形式的汞离子 Hg（NO3）2、HgCl2、PhHgCl、Hg2（NO3）2抑制效应不同，无机汞的检测范围可达0.05 mol/L-1.0 mol/L。Compagnone16使用氧化酶传感器来测定重金属离子，发现Hg2+对酶活性的抑制最为明显，尤其是甘油-3-磷酸氧化酶，可使Hg2+测定范围达到0.05 mg/L0.5 mg/L。他们还发现了几组金属离子氧化酶系统的最佳抑制对：Se4+/谷胱甘肽氧化酶、Ni2+/肌氨酸氧化酶、V5+/谷胱甘肽氧化酶、Cu2+/乙醇氧化酶和Cd2+/D-氨基酸氧化酶。利用此法无论酶是否采用固定化形式，上述金属离子的测定范围都可以到达0.1 mg/L10mg/L。3.2.2 酶反应器检测技术流动注射分析（FIA）与传感器相结合的酶反应器也被用于痕量重金属离子的检测，这一技术实现了连续自动测定的要求。Renbing Shi 等17在带有电位检测的流动注射分析（FIA）系统中利用固定化脲酶膜反应器测定痕量汞。这种技术在测定德国两个地区的饮用水中的Hg2+时与商用系统FIMS （flow injectionmercurysystem）的测定值相近，误差小于4 g/L。S. Pirutoiu等18将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶联合固定在可控微孔玻璃珠CPG 上偶联了带有连续流测温传感器的FIA 系统来跟踪酶的活性变化。Hg2+抑制酶的活性，使葡萄糖氧化酶过氧化氢酶的反应减弱，对应于100%的酶活性给出一个温度变化，用热敏传感器进行测定，这可在5 g/L80 g/L 的浓度范围内检测Hg2+，并且测定一个样品只需2 min6 min。除此之外，也有研究者开发出了利用酶抑制法检测重金属离子的试纸条、热量计、便携式检测皿等。4 酶抑制法检测技术在实际使用中存在的问题酶抑制法检测技术虽具有方便、快速、成本低等优点，但在使用过程中也存在一些亟待解决的问题。4.1 酶源的选择19动物体内的酯酶是十分复杂的类群，如乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）等，不同酯酶对农药的反应大不相同。如马血清中丁酰胆碱酯酶对异六甲磷的抑制率比乙酰胆碱酯酶高11 300 倍，而对丙胺氧磷的抑制率却高达4 200 倍。在昆虫体内AChE 的异构体有10 多种，不同异构体对农药反应也千差万别。据研究，苍蝇体内头部、胸部的AChE 异构体对农药的反应截然不同，用对氧磷分别点滴头、胸部发现，头部AChE 不受抑制，而胸部的AChE 则非常敏感。同样，胸部3 种不同异构体对马拉硫磷反应也相差好多倍；不同昆虫、不同抗药性种群中的AChE 对农药反应更是南辕北辙。因此，敏感酶源的选择与提取是检测准确性的关键，同一批次样品必须选用同一批次酶源。4.2 酶促条件20酶是一种特异性的蛋白质，酶促反应要求十分严格，温度、酸碱度、氧化还原电位是左右酶促反应的重要条件。另外，酶的固定与贮存、酶的浓度、反应底物剂量、显色剂的选配及稳定等等都会影响测试结果，而这些条件的控制与掌握，不是一般速测环境所能确保的，所以测试结果就难有重现性，也会出现差错。4.3某些农产品种类不能检测或有影响21芹菜、韭菜、洋葱等有刺激味的蔬菜样品含有过多的叶绿素、花青素、植物次生物质，对检测结果有干扰作用，造成检测结果呈假阳性。桑圆圆等22人选用实际检测中易出现假阳性现象的韭菜、蒜苗、蒜黄、大蒜4 种蔬菜为材料，利用酶抑制法检测农药残留，并对样品前处理步骤进行改进，发现对样品提取液进行适当加热可以起到消除假阳性的作用，且不会造成残留农药的损失。样品提取液的pH 值对胆碱酯酶的活性有影响，如农药速测卡使用的最佳pH 值为7.5，若样液的pH值偏离太大就会产生错误的结果。另外，反应过程中的时间、温度等均对检测结果有影响。4.4酶抑制法测定农药种类有限23目前，主要用于蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测的酶抑制法，不能检测其他类型的农药，且不能给出定性和定量结果，最低检出浓度偏高，导致某些农药品种的检测结果出现假阴性，因此，其只能用于市场上对蔬菜的初筛。当检测到有农药残留的蔬菜时，还需用色谱仪器进行定性定量分析，方能作出最终结论。5 前景与展望随着我国经济的发展和生活质量的提高，人们对农产品安全的要求越来越高。农药及重金属残留快速检测技术不仅是政府监管部门和生产企业的需要，而且是广大消费者的迫切需要。酶抑制法速测技术以其准确性高、检测快速、简便及不需大型设备、成本低等优点，在卫生检疫和环境监测方面也有广泛的使用价值。虽然这种快速检测方法还存在稳定性、灵敏度等问题而无法代替传统的仪器测定方法，但它的快捷、操作简单及实用性是传统仪器方法所不具备的。国内外实践证明，酶抑制法快速检测农药残留技术是控制有毒蔬菜产品进入市场和餐桌的有效手段，也是进行无害化生产的有力措施。酶抑制法快速检测农药残留的方法可作为传统仪器分析方法的有益补充，针对市场、农场蔬菜中农药残留进行快速选育检测，再用精密的色谱分析法确定阳性或可疑样品，不仅可保证上市蔬菜的安全性，有效预防急性中毒，而且大大减少了分析工作量，提高分析效率，达到全面监控农药残留的目的。参考文献1 赵建庄，柴丽娜，李元珍，等. 农药残留速测研究的现状及展望J. 北京农学院学报，2001，16（2）：76-80.2 徐暄，蔬菜中农药残留检测技术研究进展J. 贵州农业科学，2009，37（1）：178-1813 乙酰胆碱酯酶的结构与功能研究进展J. 生物化学与生物物理进展，1992，19（5）：358-3424 华银锋，痕量重金属离子的脲酶抑制法快速检测技术研究D上海交通大学环境工程专业2004 年硕士学位论文，2004：13-145 徐恩斌，张忠兵，谢渭芬，等. 乙酰胆碱酯酶的研究进展J. 国外医学生理、病理与临床分册，2003，23（1）：73-756 Foumier D，Mutem A. 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