knock_in法建立Cre重组酶表达鼠系_cropped.doc

knock2in 法建立 Cre 重组酶表达鼠系董铭1 , 于澎2 , 饶明俐1 , 于涌3(11 吉林大学第一医院 神经内科 , 吉林 长春 130021 ; 21 吉林大学第二医院 眼科 ,吉林 长春 130023 ; 31 哈尔滨医科大学 , 黑龙江 哈尔滨 150086) 摘要 目的 建立神经特异性表达的 Cre 重组酶鼠系 ,以便在特定的组织中 ,于某一特定的时间段 ,用条件性基因剔除技术在活体状态下研究基因功能 。方法 用 knock - in 技术 ,以微小管相关蛋白 1a (Map la) 启动子控制 Cre重组酶表达 。结果 PCR 检测结果表明 ,Cre 重组酶基因已成功植入该鼠系中 。结论 本研究为配合条件性基因 剔除技术 ,研究在脑神经细胞发育的后期各个相关基因的功能提供了一种新的手段 。 关键词 Cre 重组酶 ;微小管相关蛋白 1a ; knock2in 中图分类号 Q784 文献标识码 A 文章编号 1000 - 1905 (2002) 01 - 0035 - 03A mouse l ine that express Cre recombina se by gene knock - in strategyDONG Ming , YU Peng , RAO Ming2li , et al( Department of Neurology , The First Hospital , J i L in University , Changchun 130021 , China)Abstract : Objective To generate a neuron specific mouse line that expresses Cre recombinase and to studythe gene functions in a specific tissue and temporal period in vivo using conditional gene knock out . MethodsUsing the knock2in skill to express Cre recombinase under the control of murine microtubule associate protein1a ( Map1a) gene promoter . Results One of the mouse lines expressed the Cre recombinase by PCR. Con2 clusion It will be a new tool for studying functions of genes during the late phase of brain nerve cells develop2 ment using conditional gene knock out strategy.Key words : Cre recombinase ;microtubule associate protein 1a ; knock - inCre 重组酶表达 ,用 knock2in 技术建立了神经特异性表达的 Cre 重组酶鼠系 ,以配合条件性基因剔除技 术 ,研究在脑神经细胞发育的后期各个相关基因的 功能 。研究某一特定基因于活体情况下的功能时 ,基因打靶技术无疑是首选 。不过 ,如果在剔除某一基 因之后 ,鼠在胚胎发育期即因此而死亡 ,那么 ,就不 能进一步研究该基因在成年和老年期的作用 。为克 服这个困难 ,条件性基因剔除技术应运而生 。P1 噬菌体重组酶 Cre 可以识别含 34 个碱基对的 loxp 位 点 ,并在不需要任何辅助因子的情况下在此位点完 成酶切 。利用这个特点 ,把 loxp 位点导入目的靶基 因中 ,在适当的时间 ,用组织特异性表达启动子启动 Cre 表达 ,可以完成条件性基因剔除 ,并避免鼠在胚胎发育期死亡 。微小管相关蛋白 1a ( microtubule as2 sociate protein 1a , Map1a) 是在神经系统特异性表达 的蛋白质 ,随着神经细胞的发育 ,Map1a 蛋白的表达 量逐渐增加 , 在成熟的神经细胞中 , 可以发现大量 Map1a 蛋白表达1 。我们用 Map1a 蛋白启动子控制1材料和方法1. 1Map1a Cre knock2in 载体构建p FRT 载体以 Not I 酶切 , 然后用 Klenow 补成 平端 , 再 用 Spe 切 , 凝 胶 电 泳 , 回 收 3 . 0 Kb 片 段 ;PGKneo 载体以 Xba 及 EcoR 酶切 ,回收 1 . 5 Kb 片段 ;将二者连接 , 再插入 Kpn 2Srf 2Kpn linker 。合成 PCR 引物 : 以 pCrepac 载体为模板 , 合成0 . 4KbATGnls ( 含在引物中) 及 Cre 基因上游部分 , 并测 序无误 。用 Apa 及 Not 酶切该片段及 pBluScript SK( + ) ,并完成连接 。 将 PBS185 载体及上述连接好的 用 BamH 及 Hind 酶切 , 回收 2 . 3 Kb 及3 . 5 Kb 片 段 并 连 接 。 将 重 建 的 pBluScript SK ( + ) 载体 ( gene targeting 用 , 上游为 pMCI2DTA ,下游 收稿日期 2001 - 12 - 31 作者简介 董 铭 (1968 - ) ,男 ,吉林长春人 ,博士研究生 。为 AT pausing signal) 及 Map1a 基因组 DNA 分别用 Srf和 Nco 酶切 , 回收 4 . 0 Kb 及 5 . 8 Kb 片 段 , 并 连 接 。 将 中载体及 中载体分别用 Srf 、Sal 酶 切并连接 ,完成 knock2in 载体的构建 (见附图) 。1 . 2 电击法 ( Electroporation , E/ P) 将外源 DNA 导入胚胎干细胞 (embryonic stem cell , ES cell)将构建完成的 knock2in 载体以 Srf 酶切过夜 使之线形化 ,取 2040g DNA ,与适当条件2 培养 并经胰酶消化成单个细胞的 2 107 ES cell 重悬浮 于 800l E/ P 缓 冲 液 中 , 在 400volt , 25F 条 件 下 用 gene pulser (Bio2Rad Laboratories , Cambridge ,MA) 完成 E/ P 。ES 细胞培养 36h 后 , 加入 175g/ ml geneticin ,1 周后挑选抗 geneticin 克隆 500 个 ,每个克隆传代分 成 2 份 ,于 96 孔培养板中培养 ,1 份再培养 37 天 后冻存 ,另 1 份用作 Southern blot 检验 。1 . 3 Southern blot96 孔培养板中培养的 ES 细胞基因组 DNA 经BamH 酶切 ,Southern blot 检验 。1 . 4Germline 传递5 个单独生长的同源重组克隆按 Harada 等3 的 方 法 , 进 行 胚 泡 ( blastocyst ) 注 射 , 杂 合 子 雄 鼠 与 C57BL/ 6J 雌鼠交配 ,得到 agouti 后代 ,表明 Germline传递完成 。1 . 5鼠尾 DNA 的提取鼠 尾 经 溶 解 液 ( 1 % SDS , 10mmol/ L Tris2HCl ,25mmol/ L EDTA , 75mmol/ L NaCl , 100g/ ml 蛋 白 酶K) 消化 ,取上清用酚 ,酚2氯仿与氯仿2异戊醇依次抽 提 ,上清液加 2 . 5 倍体积 99 %乙醇沉淀 DNA ,70 %酒精洗涤 ,晾干后溶于 TE 中 ,4 保存备用 。1 . 6PCR 扩增 Cre 重组酶基因引物设计 :Cre1 :52AGGTTCGTTCACTCATGGA23Cre2 :52TCGACCAGTTTAGTTACCC23PCR 反 应 设 计 为 : 94 1min , 56 1min , 72 2min ,30 个循环结束后 ,72 保温 8min 。附图 Cre knock2in 模式图定的组织和适当的时间条件性激活或剔除基因的比 较成熟的系统4 ,5 。虽然已有一些可表达 Cre 重组2结果酶转基因的鼠系产生6 ,7 ,但很少有关于 Cre 重组酶knock2in 鼠系的研究报道 。转基因鼠和 knock2in 鼠 各有其优缺点 ,转基因方法由于实验周期短 ,工作量 相对少而受到青睐 ,但在表达的准确性上 , knock2in 方法由于采用同源重组完成 ,其表达更易于控制和 准确 。Map1a 蛋白是神经特异性表达的蛋白质 , 其表 达量随神经细胞的发育而逐渐增加 ,在成熟的神经 细胞 中 , 可 以 发 现 大 量 Map1a 蛋 白 表 达 。我 们 用 Map1a 蛋白启动子控制 Cre 重组酶表达 ,用 knock2in 技术建立了神经特异性表达的 Cre2重组酶鼠系 ,当 该鼠系和含介于两个 loxP 之间的目的靶基因的鼠 系交配后 , 就可以在神经细胞的发育晚期表达 Cre 重组酶 ,完成对靶基因的条件性基因剔除 ,研究在脑 神经细胞发育的后期各个相关基因的功能 。由于探针为载体以外的基因组序列 ,长度 585 碱基 ,经 BamH 酶切 , 该探针可以探测 8 . 5 Kb 的野生型 DNA 片段 ,同源重组时则出现 8 . 5 Kb 和 5 . 0 Kb 两个 片段 。在 500 个克隆中 ,同源重组者为 13 个 , 同源 重组 率 约 为 2 . 5 % 。选 4 个 同 源 重 组 克 隆 注 射 入 C57BL/ 6J 小鼠胚泡 , 其中 2 个克隆 (B27 , C14) 的杂 合子雄鼠 (毛色纯度分别为 85 % ,90 %) 与 C57BL/ 6J 雌鼠交 配 后 , 成 功 建 立 Cre 重 组 酶 knock2in 鼠 系 。 用 PCR 检测 Cre 重组酶基因 , knock2in 鼠系可见到235bp 的片段 , 野生型则没有此片段出现 。通过用 特殊设计的引物 ,检测 Cre 基因的存在 ,做 PCR 可以 发现 235bp 的片段 ,证实 Cre 重组酶基因已经存在 。3讨论Cre2loxP 系统是目前得到广泛应用的 ,可以在特are structurally related microtubule associated proteins with distinct de2velopmental patterns in the CNSJ . J Neuroscience , 1989 ,9 : 1712 21730 .Thomas KR ,Capecchi MR. Site2directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo2derived stem cellsJ . Cell ,1987 ,51 :503 2512 . Harada A , Oguchi K ,Okabe S , et al . Altered microtubule organiza2tion in small2calibre axonsof mice lacking tau protein J . Nature ,1994 ,369 :4882491 .Rajewsky K , Gu H , Kuhn R , et al . Conditional gene targetingJ . J Clin Invest ,1996 ,98 :6002603 .E Dale Abel , Odile Peroni , Jason K Kim , et al . Adipose2selective tar2geting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liverJ . Nature , 2001 ,409 :729 2733 .Dragatsis I , Zeitlin S. CaMKIIalpha2Cre transgene expression and re2combination patterns in the mouse brain J . Genesis , 2000 , 26 : 133 2135 .Kask K ,Jerecic J , Zamanillo D , et al . Developmental profile of kai2 nite receptor subunit KA1 revealed by Cre expression in YAC trans2 genic mice J . Brain Res , 2000 ,876 :55 261 .1 . 5 Kb 的 PGKneo 片段可能会干扰 Cre 重组酶的表达 ,还要将 Cre 重组酶 knock2in 鼠系与表达 Flp 的鼠 系交配 ,除去连入 FRT 之间的 PGKneo 片段 。knock2in 和基因剔 除 技 术 , 都 要 把 已 经 改 变 了 的靶基因转入 ES 细胞 ,再把 ES 细胞注射入宿主胚泡 ,如果恰好 ES 细胞能够参与生殖腺的形成 ,那么 , 此改变了的靶基因就会进入由宿主胚泡发育成的杂 合鼠的生殖腺中 ,从而建立起 knock2in 或基因剔除 鼠系 。此 时 选 择 适 当 毛 色 纯 度 的 agouti 后 代 与 C57BL/ 6J 雌鼠交配是比较关键的 , 以我们的经验 ,毛色纯度在 60 % 100 %之间都有成功的可能 , 其 中又以 80 %95 %为好 ,而 100 %纯度的常有不明 原因的不育发生 。234578 参考文献 1 Schoenfeld TA , Mckerracher L , Obar R , et al . Map1A and Map1B牙颌正畸与美学初探陆晓丽 , 侯禄(哈尔滨医科大学第二临床医学院 正畸修复科 , 黑龙江 哈尔滨 150086)1 牙颌正畸中的审美认识 。牙颌正畸学与美学的关系十分 密切 ,都是把人当作中心问题加以探讨 。在人际交往中 ,牙 齿和容貌的美观对于人的魅力有很大的作用 。牙颌面的畸 形不仅影响咀嚼 、发音 、吞咽等功能 ,而且影响人的容貌 ,同 时又可引起性格畸形和心理障碍 。因为人们在彼此交往中 , 最易注视的部位就是牙齿和容貌 ,它的缺陷不易被掩饰 。随 着社会的发展 ,人类的进步 ,社会人群文化素质的不断提高 和求新求异的审美趋向 ,使人们更渴望容貌完美无缺 。牙颌 正畸可以改善人的面形 ,上下颌骨的位置及牙齿的排列 ,从 而改善人的容貌 。使人们渴望改变牙颌畸形和追求容貌美 的良好愿望变为现实 。2 错颌畸形的临床矫治 。1977 年 Engel GL 指出 : 旧的生物 医学模式把人体看成一部机器 , 医生的任务 仅 仅 是 修 理 机 器 ,而忽视了心理 、行为 、社会等过程 ,现时的医学正处于从 生物医学模式向“生物 心理 、社会模式”过渡时期 。笔者认 为正畸医生应首先了解各类错颌患者求治 的 心 理 状 态 、动 机 、目的 、审美观点及要求达到的矫治标准 ,然后对下列诸因 素进行分析 。 一般资料分析 ,包