外源性DNA残留量检测.doc

外源性DNA残留量检测1.目的描述外源性DNA残余量检定（地高辛法）的操作过程和注意事项。2.材料及设备2.1试剂试液无水乙醇。Tris饱和酚。三氯甲烷。异戊醇。吐温20。20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，用盐酸调pH至7.2。0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）。3mol/L醋酸钠溶液。20SSC溶液：0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/L NaCl,调pH至7.0。Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCI，用固体NaOH调pH7. 5)。Buffer (100mmo1/L Tris-HCl 100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2，pH9. 5)。TE缓冲液（pH8.0)：量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2ml, 加灭菌水至1000ml。ECORI内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）BamHI内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）2.2材料和用具细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生物）批号H6611琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物）批号I7908外源DNA残留量检测试剂盒（Roche）货号：11745832910和1109365791尼龙膜（PALL 0.45微米）点样器（Bio-RAD;Model No:Bio-Dot SF Cell;Serial No:160BR07680）、移液器、tip头、恒温水浴锅、超净工作台、冰盒、离心机、三维旋混仪、电磁炉3.操作原理用随机启动法，将地高辛甙元标记的脱氧尿苷三磷酸掺入未标记DNA，通过一个手臂将dUTP与载体半抗原地高辛甙元连接起来（dig-dUTP）。与目的DNA杂交后，杂交分子用酶联免疫法检测；应用抗体酶联接物（抗地高辛甙元碱性磷酸酶复合物）和随后用酶促颜色反应使5溴4氯3吲哚磷酸（BCIP）和氮蓝四唑（NBT）显色。流程图探针效率确定酶切 获得DNA片段 探针标记 纯化探针 基因组DNA提取 阳性DNA 变性DNA点膜预杂交 杂交过夜 样品终止保存 显色 抗体杂交 封闭 严谨洗涤4.操作过程4.1探针制备4.1.1提取后的基因组DNA用等体积的饱和酚溶液（饱和酚：三氯甲烷：异戊醇=25：24：1）混合均匀，12000rpm离心（4）5分钟。轻轻吸取上层液体到另一EP管，在上清液中加入1/10体积3mol/L乙酸钠，稍微震荡或轻弹混匀，然后加入2倍体积（加入乙酸钠后的体积）冰无水乙醇，混匀后置于-204小时或-702小时。12000rpm离心（4）5分钟，弃液体，加入70%冰乙醇10000rpm离心（4）5分钟，弃去液体，室温晾干。加入适量无菌水或TE缓冲液，-20保存。4.1.2纯化后的基因组DNA进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收小片段。取1g 回收DNA用灭菌双蒸水加至16微升，然后放入沸水浴中将DNA变性，水浴10分钟后，立即放入冰水浴中，冰浴5分钟。4.1.3冰浴后加入试剂盒中的1#试剂5微升，轻轻摇晃混匀，37培养过夜。4.1.4次日，将探针取出，向其EP管内添加0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2微升，3mol/L醋酸钠溶液2微升，无水乙醇50微升。4.1.5将EP管放于-70环境中2小时以上。4.1.6取出探针，15000rpm离心（4）15分钟，倾倒上清，用50微升灭菌双蒸水溶解探针，放于4环境中备用（不宜超过一周）。4.2供试品，阳性，阴性及对照处理 4.2.1用纯化后的基因组DNA，稀释梯度为10ng/100l、 1ng/100l、100pg/100l、10pg/100l，1pg/100l的阳性对照。阴性对照为稀释液。4.2.2将供试品、阳性对照、阴性对照置100水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却5分钟，以8000转/分离心5秒甩水。4.3点膜及杂交4.3.1用抽滤加样器将100l样品全部点样于的杂交膜上。4.3.2取下杂交膜，点样面向上，置紫外灯下照射30分钟。4.3.3取无菌培平皿，加10ml已预热（37）杂交液，并将杂交膜全部浸泡于其中，置37水浴孵育30分钟进行预杂交。4.3.4预杂交完毕后，倒掉预杂交液加入10ml新鲜预杂交液（50）及全部探针（探针置100水浴加热10分钟，冰浴5分钟），然后置37水浴孵育过夜。4.4洗脱及显色4.4.1低严谨性洗脱：取无菌培养平皿，加10ml2X SSC（含0.1%SDS）,将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，洗次，每次5分钟。4.4.2高严谨性洗脱：取无菌培养平皿，加10ml0.5X(0.1%SDS)(68预热),将杂交液全部浸泡其中，置68摇动，洗次，每次15分钟。4.4.3平衡：取无菌平皿，加10mlBuffer1（含0.3%吐温20）,将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡。4.4.4封闭：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI稀释过的封闭液，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床震荡30分钟。4.4.5抗体孵育：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI稀释过的封闭液，同时加入试剂盒中的4#试剂2微升，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，30分钟。4.4.6洗脱：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferI（0.3吐温20）,将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，15分钟，次。4.4.7平衡：取一次性无菌培养平皿，加10mlBufferIII，将杂交膜全部浸泡其中，室温下置水平脱色摇床，分钟。4.4.8显色：取一次性无菌培养平皿，加10ml BufferIII（含200l 5#），将杂交膜全部浸泡其中，室温下避光静置0.5小时以上至显色完毕。4.4.9终止反应：将杂交膜置无菌水中分钟。4.4.10