淀粉酶混合使用.pdf

第3 5 卷第4 期 2 0 0 5 年1 2 月 工业微生物 I n d u s t i a M i c r o b i b 日 V d3 5 N o4 D e c2 0 0 5 复合淀粉酶酶解生淀粉机理探讨 姚卫蓉 姚惠源 江南大学食品学院 无锡2 1 4 0 3 6 摘要以生土豆淀粉为原料 考察了复合生淀粉酶水解机制 发现单个糖化酶的酶解遵循 M i c h a e l i S M t 机制 而 淀粉酶的酶解不遵循M c h a e l i s M t e n 机制 水解过程中复合酶酶解产物 d G d t 的变化说明 淀粉酶能很好地协同糖化酶水解生淀粉 其效果不仅仅是两者的简单相加 关键词 糖化酶 a 一淀粉酶 协同作用 生淀粉 根据作者的研究 发现用具有生淀粉活性的 糖化酶和 淀粉酶协同作用能很好地形成多孔淀 粉 其中人们对生淀粉糖化酶的作用机理已有了一 定的了解 生淀粉糖化酶水解生淀粉与水解糊化淀 粉的机理与方式有相同的地方 即都是从非还原末 端外切淀粉的a 一1 4 一葡萄糖苷键和a 1 6 葡萄糖苷 键 但也存在着很大的差别 J 生淀粉颗粒在水中 由于其表面与水分子形成氢键 从而形成水束 生淀 粉颗粒表面大量的水束形成了一层水分子无法通过 的水束层 只有当温度升高时水束层被破坏 水分 子渗人淀粉颗粒 使淀粉颗粒膨胀与糊化 人们称 之为 水束隔离模式 w a t e r c I u s t e rd l s s c i a t i n gm o d e 1 因此 酶是否能与生淀粉颗粒表面结合是水 解生淀粉的关键 1 生淀粉 淀粉酶即 淀粉酶 是内切型淀粉酶 它作用于淀粉时是从淀粉分子的内部任意切开a 一1 4 键 使淀粉分子迅速降解 失去了粘性以及和碘的 呈色反应 同时使水解物的还原力增加 虽然国外 研究人员已经将近5 0 种不同来源的a 一淀粉酶的肽 链进行了空间结构 氨基酸序列分析 并将相应的 D N A 序列破译 J 但是对n 一淀粉酶水解生淀粉的 作用机理还不十分清楚 国内外的报道很少 糖化酶和a 靛粉酶复合水解生淀粉能形成多孔 淀粉 但对其作用机理仍然不是十分清楚 很难用实 验数据来确切描述这一过程 本文试图从一些侧面 对糖化酶和 淀粉酶复合水解淀粉形成多孔淀粉的 机理作一些探索 考察单个糖化酶 单个 淀粉酶以 江苏省基础研究计划 自然科学基金 资助项目 编号 B K 2 0 0 3 4 0 作者简介 姚卫蓉 1 9 7 0 女 副教授 E 圳1 1 n g 4 鬯3 秽 及两者的复合形式分别作用生淀粉的情况 希望从 动力学机制上解释酶解机理 l 材料与方法 1 1 材料 黑曲霉糖化酶 购自S i g m a 公司 酶活6 0 0 0 U m L 在p H 4 5 5 5 条件下3 m i n 由淀粉释放1O n l g 葡萄糖为l u 杆菌 淀粉酶 购自S i g m a 公司 酶活 5 1U r n g 在p H 69 2 0 3 m i n 由淀粉释放1 O H 培 麦芽糖为1 u 土豆淀粉 荷兰产风车牌 1 2 单酶或复合酶酶解反应 分别取不同量或不同配比的糖化酶 淀粉酶 加入到不同底物浓度的1 0 m L 反应液中 4 2 下反 应不同时间 加4 的N a O H 溶液1 m L 终止反应 用N e I s o n S o m o g y i 方法 1 6 1 测定反应液中还原糖的 浓度 1 3 复合酶酶解的d G d t t 曲线 用本文附件 M a t h e m a t i c a l 源程序 分析复合 酶酶解反应 对葡萄糖浓度变化数据进行拟合 得到 复合酶酶解产物葡萄糖浓度随时间的变化规律 d G J d t t 2 结果与讨论 在本研究中利用生淀粉糖化酶作用生淀粉制备 多孔淀粉时 使用了a 一淀粉酶一起作用 水解能力得 到了提高 多孔淀粉的性能也得到了提高 a 一淀 粉酶的协同作用是如何体现的呢 下面试图从酶解 万方数据 第4 期I 业微生物 第3 5 卷 动力学方面阐述 一淀粉酶与糖化酶的协同作用 分 别考察单一糖化酶 单一a 淀粉酶以及两者的复合 形式作用生淀粉的情况 由于制备多孔淀粉时一直用工业酶制剂 而研 究酶解机理必须用纯酶 因此 选用了与所用工业 酶制剂同一菌种所产的纯酶进行实验 文献报 道 J 生淀粉酶水解生土豆淀粉的水解度最低 反应 速度最慢 能很好地呈现酶解初期的动力学 因此 决定选用土豆淀粉作为酶解底物 2 I 糖化酶的M i c h a e I i s M e t e n 常数 由于本研究所用复合酶主要为糖化酶 在研究 复合酶酶解时 首先要考察糖化酶水解动力学机制 用1 0 u 的糖化酶分别水解不同浓度土豆淀粉 5 至5 0 m d m L 以葡萄糖为指标测定水解速度 并 以L i n e w e a v 一B u r k 方式作图 即以1 V 对1 S 作 图 结果见图1 图1单一糖化酶的L i n e w e a v e r B u r k 图 1 0 U 糖化酶 由图1 可知 糖化酶水解生土豆淀粉的1 V 与 l Sj 成一直线 符合M i c h a e b M e t e n 方程陋7 该方 程的表达式为 1 0 7 v 6 3 6 9 r S 一O4 2 8 1 根据M i c h a e I j s M e t e n 方程 该直线在x y 轴上 的截距分别为一1 K 1 v n 根据方程 1 可得糖化 酶的M l c h a e l i s M e t e n 常数K V 经计算 K 1 4 86 4 m g m L V 23 3 l O7 m o l m I m i n 2 2 单一糖化酶 淀粉酶及其复合酶的水解曲线 研究a 一淀粉酶如何协同糖化酶作用生淀粉这一 过程 首先必须对单个酶的水解行为进行考察 下面 将单个糖化酶分别作用不同浓度生土豆淀粉 不同 酶活a 一淀粉酶以及不同酶活配比的复合酶作用生土 1 6 豆淀粉 得到水解曲线 结果见图2 反应时I 司 m m 1 0 m m L 土豆淀粉 2 0 m m L 土豆淀粉 十3 0 m m L 土豆淀粉 图2 单一糖化酶的水解产物随时间 变化曲线 1 0 U 糖化酶 图2 中单一糖化酶的水解产物随时间变化曲线 基本遵循M i c h a e l i s M e n t e n 机制 在本研究范围 内 对应于不同的底物浓度 水解产物的形成速度也 不同 底物浓度越高 产物的形成速度也越高 由于a 一淀粉酶的内切作用将淀粉链随机水解 形成新的非还原性末端 但大部分仍留在颗粒表面 而测定反应进程时以可溶性糖为指标 因此 图3 中 a 蓰粉酶的水解产物随时问变化曲线不遵循 M i c h a e M e n t e n 机制 但还是可以看出 起始反应 阶段 形成葡萄糖的速度较快 随后逐渐减慢 5 1 U 1 0 2 u 的n 淀粉酶酶活太低 产物浓度基本为 零 在本实验条件下无法检测到产物的形成 o g 面 刨 嚣 嚣 羽 反压时川 m l n 2 0 4 u 淀粉酶o1 0 2 u 淀粉酶 5 l u 淀粉酶 图3 单一a 一淀粉酶水解产物一时间曲线 2 0 m g m L 土豆淀粉 图4 为不同配比的复合酶作用生土豆淀粉的水 解曲线 发现加入n 一淀粉酶后 水解能力得到了不同 程度的提高 淀粉酶的加入量越多 复合酶的水解 能力越高 将图4 中的3 条水解曲线与图2 中生土 豆淀粉浓度为2 0 m g m L 的曲线相比较 酶解速度明 显提高 虽然在图3 中低酶活的a 淀粉酶作用生土 一一E高山J型艇耀婶醉 万方数据 第4 期姚卫蓉 等 复合淀粉酶酶解生淀粉机理探讨 第3 5 卷 豆淀粉检测不到葡萄糖浓度 但在复合酶体系中都 能明显提高糖化酶的水解能力 说明n 一淀粉酶能很 好地协同糖化酶水解生淀粉 3 3 E 面 E2 划 蠼 耀1 鞴 轻 u 2 0 0 4 0 06 0 08 0 0 反应时间f mJ n l 2 0 4 ud 一淀粉酶 一1 0 2 ua 一淀粉酶 5 l Uo 璇粉酶 图4 复合酶的水解产物随时问变化曲线 2 0 m g m L 土豆淀粉 1 0 u 糖化酶 2 3 复合酶的d G d t t 图 由于形成多孔淀粉的酶解反应远在颗粒结构消 失之前被结束 即反应过程中底物一直是以颗粒结 构存在 也就是说 淀粉酶与糖化酶对淀粉的反应 是持续存在的 根据酶解原理 a 一淀粉酶随机内切 淀粉分子链 为糖化酶提供非还原性末端 糖化酶不 仅作用淀粉颗粒上本来存在的非还原性末端 还作 用于 淀粉酶不断提供的非还原性末端 那么 最终 水解产物葡萄糖的形成速度受这两种底物浓度的影 响 因此 a 一淀粉酶和糖化酶混合体系的产物浓度方 程可用下列方程表示 d G 一v m 岛 s 1 F 一瓦了 哥r 诵 其中t 0 时 G o s o 方程 2 中 岛 为底物颗粒的起始质量浓度 对应于反应开始时暴露在颗粒表面的非还原性末端 的数量 即起始底物浓度 s 代表反应底物表观质量浓度增量 对应于 在颗粒表面新形成的非还原性末端数量的增加量 G 为可溶性糖的浓度 m m L v m 为糖化酶最大反应速度 K 为糖化酶的 M i c h a e l i M e t e n 常数 在结果与讨沦的21 中已经 得到具体数值 将图4 复合酶的水解产物随时间变化曲线中的 葡萄糖浓度根据本文附件 M a t h e m a t l c a l 源程序 进 行拟合 得到复合酶酶解的d G d t t 曲线 结果 见图5 至7 图中横坐标为时间t m n 纵坐标为d G d t m d m 1 m i n 值 图5 复合酶酶解的d G d t t 图 2 0 4 u a 一淀粉酶 2 0 m d m L 生土豆淀粉 图6 复合酶酶解的d G d t t 图 1 0 2 u a 一淀粉酶 2 0 m d m L 生土豆淀粉 图7 复合酶酶解的d G d t t 图 5 l U a 淀粉酶 2 0 m g m L 生土豆淀粉 由图5 至7 可知 3 种不同量的 淀粉酶加入 到反应体系中 产物的d G d t t 图形的基本形状 极其相似 即不论复合酶体系中a 一淀粉酶酶活所占 的比例如何 复合酶酶解得到的产物随时间的变化 d G d t 值随时间的变化是一致的 根据方程 2 d G d t 反映的是反应体系中 S s 随 时间的变化趋势 代表了反应体系中非还原性末端 数目的变化情况 由图5 至7 可知 反应刚开始时 非还原性末端 数目急剧减少 减少至7 0 m i n 左右 非还原性末端数 目开始急剧增多 1 2 0 m i n 左右 非还原性末端数目 又开始减少 然后渐趋稳定 据推测 刚开始反应时 非还原性末端的急剧减 少可能是由于颗粒外表面的非还原性末端造成的 由于淀粉颗粒表面的不规则结构 在制备淀粉颗粒 或储藏过程中 易在颗粒表面形成机械损伤或发生 1 7 万方数据 第4 期工业微生物第3 5 卷 氧化作用 使得颗粒的外表面暴露出了大量的非还 原性末端 酶与淀粉颗粒接触时 首先酶解的就是 那些突出在颗粒外表面的非还原性末端 由于暴露 在颗粒外表面的非还原性末端总数有限 因而随反 应时间的进行 非还原性末端的数目急剧减少 随着反应的进行 淀粉开始溶胀 使a 一淀粉酶开始 接触颗粒的内层 淀粉酶的随机作用将颗粒内的 淀粉链大量水解 暴露出大量的非还原性末端 因而 非还原性末端数目叉急剧增多 为糖化酶的作用提 供了大量的作用底物 随后 a 一淀粉酶不断为糖化酶 提供大量的非还原性末端 糖化酶不断水解这些非 还原性末端 两者协同作用 相互平衡 使非还原性 末端的数目逐渐趋向稳定 3 结论 通过上述研究 初步可以解释复合生淀粉酶协 同作用生淀粉的情况 生淀粉酶水解生淀粉得到多 孔淀粉这一过程中 首先糖化酶酶解突出在生淀粉 颗粒表面的不规则部分 以及较容易水解的元定形 区 沿着淀粉分子的非还原末端逐级水解 随着水解 的进行 淀粉的溶涨使 淀粉酶能接近颗粒内部舻 淀粉酶的随机内切作用为糖化酶提供新的非还原性 末端 两种酶的协同作用不仅提高了水解速度 也使 水解沿着更多的点逐级向淀粉分子内部推进 生淀 粉的天然立体结构支持了这种水解行为的连续性 其宏观效果就是首先在粒子表面形成一个个很浅的 凹坑 再分别沿着径向逐步向颗粒中心推进 然后在 中心附近相互熔融 形成一个中空的结构 但仍保持 颗粒基本形状 多孔淀粉的图片见文献 参考文献 1 姚卫蓉 姚惠源多孔淀粉的研究之I 酶和原料粒度对形成多 孔淀粉的影响中国粮油学报 2 0 0 1 1 6 1 3 63 8 2 诸葛斌 姚惠源 姚卫蓉 生淀粉糖化酶的结构和作用机理 工业微生物 2 0 0 1 3 1 1 4 95 1 3 S h l n 蛆k uH A Y A s H I D A K D l c N A K 艋n R A w e 淄I tK A N L A Y A K R I T 1 h a a c t e r l s t t a n dF u n c t l n0 fR a wS 妇托h a l t y S i t c n 几艘唧Z f sd t o r z 埘K a w a c h lG I y l a s eIM 0 l e c u l cA g r l eB I dc h m l 1 9 8 9 5 3 1 1 4 3 1 4 9 4 G u Q 1 a T D n g a a 腿v 1 e i l e A l e x e l 跏c 1 1 e n k 0 a n dJG r e 鲷一 r yz e l k A p 叫E n mM l 幽I l L 9 9 7 6 3 3 5 6 9 3 5 7 6 1 8 5 NN e l s nJ B l o lc h 哪 1 9 4 4 1 5 3 3 7 5 6 MS 0 n J 岛dc h 1 9 5 2 1 9 5 9 7 门间充c u a r a 衄d o x a 生淀粉分解酵素t 千力应用 二关 卞舀研究淀粉科学 只 L 9 9 1 3 8 1 4 5 5 0 8 王璋食品酶学北京 中国轻工业出版杜 1 9 9 0 附录 h t h t l 出源程序 感谢张金彪硕士提供此源程序 数据处理M a t h a t i c a I 源程序 f 1 1 I n t e r p 幽t l 1 1 0 0 3 0 54 0 5 6 6 0 85 1 2 0 2 23 3 3 3 2 4 0 2 94 3 8 9 l3 9 0 3 97 7 7 8 I 6 6 0 4 89 7 7 8 f 1 2 I n e r p h t i o n i O 0 3 0 1 51 8 3 3 印 1 91 3 3 3 1 2 0 3 28 7 2 2 j 2 4 0 3 93 2 2 2 j 3 9 0 5 4 0 5 6 6 0 8 19 8 8 9 1 n 3 I n t 螂 l a 6 0 o 3 0 2 07 1 1 1 i 6 0 2 4 6 7 2 2 I 1 2 0 4 3 3 5 2 4 0 5 31 4 4 4 3 9 0 7 4 0 9 4 4 f 6 6 0 l8 5 l 也1 I n t 目吲a 6 0 0 3 0 02 0 5 6 1 印 O2 5 5 6 l f 1 2 0 O4 5 5 6 f 2 4 0 02 5 5 6 3 9 0 05 3 3 3 f 6 6 0 18 5 I 3 l I m 蜘d a t i O 0 I 3 0 3 82 6 儿 印 3 59 8 3 3 1 2 0 4 91 9 4 4 2 4 0 7 30 1 6 6 7 3 9 0 9 2 2 3 8 9 6 6 0 1 4 5 f 3 2 I n t 甘洲a t 曲 0 0 3 0 3 16 4 4 4 6 0 3 65 9 l 1 2 0 4 55 5 i 2 4 0 6 22 3 3 3 3 9 0 8 59 4 4 4 6 6 0 1 2 33 6 1 1 f 3 3 i n p h t I o n 0 0 f f 3 0 2 58 8 8 9 f f 6 0 3 43 7 7 8 1 2 0 4 5 7 l 2 4 0 6 1 9 6 1 1 3 9 0 8 1 4 0 5 6 6 6 0 1 1 51 5 5 6 j s t e p O 5 P l o t f l l t 1 1 s t e p 一f l l t 1 1 一s t e p 2 s t 印 t 1 1 s t 印 6 6 0 s t 印 P I o t f 1 2 t s t 印 一n 2 s t 印 2 s t 印 l t s t 印 6 6 0 一s e p P l o 让 n 3 t s t 印 一f 1 3 t s t e p 2 s t 印 t s t 印 6 6 0 s t e p P b t f 2 1 t s t 印 一岔l o s t 印 2 s t 印 t s t 印 6 6 0 一s e 印 P l o t f 3 l t s t e p 一f 3 1 t s t 印 2 s t e p t s t 印 6 6 0 一s e p J P l o t f 3 2 t s t 印 f 3 2 t s t e p 2 s t 印 f t s t e p 6 6 0 一s t e p P l L f 3 3 t s t 印 一f 3 3 t s t 印 2 s t 印 l t s t 印 6 6 0 s t 印 下转第2 4 页 万方数据 第4 期工业微生物第3 5 卷 邦国爱 细菌乳酸脱氢酶的纯化及其性质研究生物技术 1 9 9 9 9 1 1 1 5 朱文淼 肖敏 刘复今枯草芽孢杆菌B s l 2 乳酸脱氢酶的分 离纯化与部分性质的研究生物技术 1 9 9 6 6 2 2 3 2 5 蒋传葵 金承德 吴仁龙等工具酶的活力测定上海 上海 科学技术出版杜1 9 8 2 汪家政 范明蛋自质技术手册北京 科学出版社 2 0 0 0 陈毓荃生物化学实验方法和技术北京 科学出版社 2 0 0 2 凌代文主编乳酸细菌分类鉴定及实验方法北京 中国轻 工业出版社1 9 9 9 布坎南RE 吉术斯NE 编著伯杰细菌鉴定手册北京 1 5 1 6 1 7 1 8 科学出版社1 9 8 4 G a n i eEI L 耻t i cd e h y d 蜒e r m s e0 fs n a i no ft h eg 曲u sL e u c n o s 鼬 J 蚰M l c H 出I d1 9 6 95 8 8 5 9 4 邹岳奇 阎静辉 刘玉翠等5 A q r 4 亲和层析法一步 纯化乳酸脱氢酶河北省科学院学报 1 9 9 1 3 7 2 7 5 邹群 孙小梅 李步海等用三嗪染料修饰吐温8 0 液一固萃 取乳酸脱氧酶的研究 中医药工业杂志 2 0 0 2 3 3 6 2 7 4 2 7 7 L 曲r L lNE a o m 3Y D s l m d 诅n u sP 血f 旧t 啪o fL M 如托D e h p 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