食品免疫学 7食品检测技术及其进展.pdf

曹林 南京农业大学食品科技学院 曹林 南京农业大学食品科技学院 免疫技术在食品分析 检验 检疫 上的应用 免疫技术在食品分析 检验 检疫 上的应用 第七章第七章 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 概述概述 免疫检测技术免疫检测技术 案例分析案例分析 免疫检测新技术和趋势免疫检测新技术和趋势 食品免疫检测技术及其进展食品免疫检测技术及其进展 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 食品行业食品行业 产业大产业大 谷类 肉类 蔬菜 水果 饮料谷类 肉类 蔬菜 水果 饮料 2007年 中国肉类生产增加值初 步核算约为1万亿元 肉品加工销 售收入2701亿元 食品行业总产值食品行业总产值6万亿元 相当于万亿元 相当于4倍汽车产业倍汽车产业 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 食品安全的几个热点问题 瘦肉精 氯霉 素 苏丹红 孔雀 石绿 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 生物危害生物危害 人畜共患病 食品源性致病菌 微生物 食品质量安全食品质量安全 危害存在于原料 加工过程 储运危害存在于原料 加工过程 储运 化学危害化学危害 药残 激素 有害生成物 添加剂 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 第二节 免疫检测技术第二节 免疫检测技术 ELISA 侧向流动试纸条侧向流动试纸条 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 免疫检测技术免疫检测技术 1 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法 ELISA ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定 方法中有三个必要的试剂 1 固相的抗原或抗体 即 免疫吸附剂 immunosorbent 2 酶标记的抗原或抗体 称为 结合物 conjugate 3 酶反应的底物 最常见的检测方法是夹心法 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定 方法中有三个必要的试剂 1 固相的抗原或抗体 即 免疫吸附剂 immunosorbent 2 酶标记的抗原或抗体 称为 结合物 conjugate 3 酶反应的底物 最常见的检测方法是夹心法 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 免疫检测技术免疫检测技术 基本原理基本原理 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 免疫检测技术免疫检测技术 加样时应将所加物加在加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部 避免加在 孔壁上部 并注意不可溅出 不可产生气泡 板孔的底部 避免加在 孔壁上部 并注意不可溅出 不可产生气泡 加样 温育 洗涤 显色 抗原抗体完成反应的保温过程 应注意温育的温度和 时间应按规定力求准确 清除残留在板孔中游离的物质 以及非特异性地吸 附的干扰物质 洗涤是最主要的关键技术 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应 反应的温度和时间仍是影响显色的因素 抗原抗体完成反应的保温过程 应注意温育的温度和 时间应按规定力求准确 清除残留在板孔中游离的物质 以及非特异性地吸 附的干扰物质 洗涤是最主要的关键技术 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应 反应的温度和时间仍是影响显色的因素 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 定量测定定量测定 免疫检测技术免疫检测技术 ELSIA操作步骤复杂 操作步骤复杂 影响反应因素较多影响反应因素较多 特别是固相载体 的包被难达到各个体之间的一致 因此在定量测定中 每批 测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制 作标准曲线 特别是固相载体 的包被难达到各个体之间的一致 因此在定量测定中 每批 测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制 作标准曲线 测定大分子量物质的夹心法ELISA测定大分子量物质的夹心法ELISA 标准曲线的范围一般较 宽 曲线最高点的吸光度可接近2 0 绘制时常用半对数纸 以检测物的浓度为横坐标 以吸光度为纵坐标 将各浓度的 值逐点连接 所得曲线一般呈S形 其头 尾部曲线趋于平 坦 中央较呈直线的部分是最理想的检测区域 标准曲线的范围一般较 宽 曲线最高点的吸光度可接近2 0 绘制时常用半对数纸 以检测物的浓度为横坐标 以吸光度为纵坐标 将各浓度的 值逐点连接 所得曲线一般呈S形 其头 尾部曲线趋于平 坦 中央较呈直线的部分是最理想的检测区域 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 根据转基因标准物质绘 制的标准曲线 根据转基因标准物质绘 制的标准曲线 根据外源蛋白标准绘制 的标准曲线 根据外源蛋白标准绘制 的标准曲线 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 96微孔板 用于用于RR大豆 和大豆 和Bt 玉米玉米ELISA检测检测 Agdia转基因产品内毒素蛋白 检测试剂盒 转基因产品内毒素蛋白 检测试剂盒 免疫检测技术免疫检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 2 侧向流动型免疫试纸条方法 侧向流动型免疫试纸条方法 Lateral Flow strips 根据抗原抗体特异性结合根据抗原抗体特异性结合的原理工作 的原理工作 硝化纤维硝化纤维代替代替聚苯乙烯聚苯乙烯反应板为固相载体 反应板为固相载体 免疫检测技术免疫检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Lateral Flow Strip ProtocolLateral Flow Strip Protocol 1 Tests for CryI Ab CP4 EPSPS 2 Plant seeds 3 More coming soon 1 2 3 1 Punch leaf disc 2 Add buffer and grind in tube 3 Insert flow strips for testing 免疫检测技术免疫检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 免疫检测技术免疫检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Canola Cotton Soybean Lateral Flow Strip Lateral Flow Strip 检测应用检测应用检测应用检测应用 免疫检测技术免疫检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 目前应用方法的比较目前应用方法的比较目前应用方法的比较目前应用方法的比较 蛋白检测 ELISA 蛋白检测 Lateral Flow 基因检测 PCR 检测时间少于 10 分钟 否 是 否 成本便宜 是 是 否 灵敏 准确 重复性 好 好 好 得出定量结果 是 否 是 检测所有商品化品种 否 否 是 否 检测不同转化体 否 否 是 否 原料 是 是 是 对于加工产品 否 否 是 标准物质 否 是 是 免疫检测技术免疫检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 特异性与灵敏度特异性与灵敏度 只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号 需要测试不同植物品种需要测试不同植物品种 需要测试不同的转基因植物需要测试不同的转基因植物 足够低的检测灵敏度 满足转基因标识的要求足够低的检测灵敏度 满足转基因标识的要求 检测极限 LOD 定量极限 LOQ Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 正 确 度正 确 度 高精度 但是远离真实值 高精度 但是远离真实值 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 接近真实值 但是精度较低 接近真实值 但是精度较低 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 接近真实值 高精度 接近真实值 高精度 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 重复性重复性 在实验室内部不同 重复下的精度 在实验室内部不同 重复下的精度 同样的方法同样的方法 r Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 重复条件下的精度重复条件下的精度 同样的方法同样的方法 不同实验室不同实验室 国际间的实验室 国内不同 实验室 国际间的实验室 国内不同 实验室 R 重复性重复性 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 四 转基因产品检测新技术和趋势四 转基因产品检测新技术和趋势 芯片检测技术 复合 芯片检测技术 复合PCR技术 等温扩增技术 传感器技术 光谱学技术 技术 等温扩增技术 传感器技术 光谱学技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 什么是基因芯片技术 什么是基因芯片技术 简单的概括就是将大量探针分子固定于支持物上 根据碱基互补配对原理 与标记的样品分子进行杂交 通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品 中靶分子的数量和序列信息 简单的概括就是将大量探针分子固定于支持物上 根据碱基互补配对原理 与标记的样品分子进行杂交 通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品 中靶分子的数量和序列信息 基因芯片的基本原理 基因芯片的基本原理 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法 southern northern 一致一致 应用已知的核酸序列作为探针与互补的靶序列杂交 通过随后的信号检测进 行定性与定量分析 应用已知的核酸序列作为探针与互补的靶序列杂交 通过随后的信号检测进 行定性与定量分析 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 基因芯片发展历史基因芯片发展历史基因芯片发展历史基因芯片发展历史 Southern Northern Southern Northern 杂交杂交杂交杂交 斑点杂交斑点杂交斑点杂交斑点杂交 宏芯片宏芯片宏芯片宏芯片MacroarrayMacroarray 微芯片微芯片微芯片微芯片MicroarrayMicroarray 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 低密度芯片低密度芯片 探针数量一般在几十或者几百个之间 主要用于少数 目的基因和序列检测及确认 根据已知的靶序列设计针对 性的探针 高密度芯片高密度芯片 探针数量可以达到几千甚至数万 主要用于大规模的 基因检测 筛选等 根据生物体全基因组的已知基因信息 甚至只根据序列信息设计探针 该芯片技术要求复杂 价 格昂贵 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only i 提取样品 裂解细胞 提取DNA 或者RNA 并纯化 iii 杂交和冲洗 按碱基配对原理DNA cDNA样品与芯 片探针进行杂交 然后对芯片进行清洗 非特异性的结 合可以部分的冲洗掉 iv 扫描和成像 用适当的方法使标记底物激发荧光或 者显色 扫描仪器记录每个样点的信号值 样点信号的 强度取决于杂交的样品DNA cDNA的量 v 数据处理与分析 读取芯片样点的信号值 对信号进 行标准化等处理 通过计算机分析得出结果 工作流程工作流程 ii 样品的扩增与标记 样品DNA RNA通过PCR扩增 反转录等技术扩增并掺入荧光标记分子或放射性同位素 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 基因芯片在转基因检测中的应用基因芯片在转基因检测中的应用 目前报道的基因芯片用于转基因检测的应用包括以下方面 目前报道的基因芯片用于转基因检测的应用包括以下方面 利用低密度芯片进行定性检测 利用低密度芯片进行定性检测 该方法是目前研究和应用最广泛的芯片检测方法 将针对特异序列设计的 探针用点样法点在芯片上 一张芯片可以检测几种甚至十几种转基因品系 该方法是目前研究和应用最广泛的芯片检测方法 将针对特异序列设计的 探针用点样法点在芯片上 一张芯片可以检测几种甚至十几种转基因品系 利用低密度芯片进行半定量或定量检测 利用低密度芯片进行半定量或定量检测 该方法基本原理与定性检测方法相同 不同的是采取特殊设计的样品扩增 方法 建立起DNA样品的起始量与扩增后样品荧光量的关系 通过检测芯片杂交 的信号强度确定起始样品量 该方法基本原理与定性检测方法相同 不同的是采取特殊设计的样品扩增 方法 建立起DNA样品的起始量与扩增后样品荧光量的关系 通过检测芯片杂交 的信号强度确定起始样品量 利用覆瓦式芯片检测未知的转基因样品 利用覆瓦式芯片检测未知的转基因样品 目前仍在发展阶段 该方法利用转基因相关载体设计探针 使探针覆盖大 量的转化载体序列 从而达到检测未知样品的目的 目前仍在发展阶段 该方法利用转基因相关载体设计探针 使探针覆盖大 量的转化载体序列 从而达到检测未知样品的目的 下面对这三种应用分别举例说明 下面对这三种应用分别举例说明 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 利用低密度芯片检测食品中转基因成分利用低密度芯片检测食品中转基因成分 Serge Leimanis et al Plant Molecular Biology 2006 可以同时检测9种转基因品系 确定5种植物物种以及三种 转基因的筛选元件 DNA样品在扩增时标记生物素 扩增产物直接与芯片杂交 通过随后的显色步骤检测芯片杂交情况 确定样品中所含 的成分 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 芯片探针的设计 第一部分 品系特异性芯片第一部分 品系特异性芯片 针对品系特异性的探针针对品系特异性的探针 第二部分 物种特异性芯片第二部分 物种特异性芯片 针对内标基因的探针针对内标基因的探针 第三部分 筛选特异性芯片第三部分 筛选特异性芯片 针对筛选元件的探针针对筛选元件的探针 第四部分 对照探针第四部分 对照探针 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 利用基因芯片定量检测转基因成分利用基因芯片定量检测转基因成分 通过特殊设计的样品DNA扩增方法实现定量检测的目的 芯片PCR技术 1 在芯片上固定反向引物作为探针 2 特异性靶标与引物退火结合 3 固定引物延伸 4 变性后正向引物退火延伸 5 特异性序列在芯片上扩增 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 利用利用Tiling芯片检测未知的转基因产品芯片检测未知的转基因产品 根据一系列的转化载体作为参考序列设计高密度的基因芯片 然后将全基因 组DNA直接与芯片杂交 以检测未知的转基因物种 设计25bp长度的探针对235个植物转化载体的双链序列 约2兆个碱基 进行覆 盖 通过筛选得到37257个探针 利用该芯片检测出了3种转化载体或者T DNA序列未知的转基因拟南芥和水稻 品系 该方法的灵敏度仅要求样品DNA中含有一段大于140bp的与参考序列匹配的 片段存在即可得到阳性结果 Torstein Tengs et al BMC Biotechnology 2007 7 91 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 图中粗黑线为部分检测结果 以及该序列在基因组上的位置 但 该结果表明此方法目前只能检测离散的转基因通用元件 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 基因芯片技术在转基因检测中的应用前景基因芯片技术在转基因检测中的应用前景 集成芯片 集成芯片 利用一块芯片可以检测目前商业化的转基因品 系 定量芯片 定量芯片 更加精确和高通量的定量检测芯片技术 Tiling芯片 芯片 检测未知转基因样品并可对其分子特征进行 描述 高密度基因组芯片 研究转基因事件的非预期效应 包括 在基因组水平上的DNA的插入 缺失 扩增 位移等以及 转录组水平上基因表达的沉默 激活 上调 下调等 基因芯片检测技术基因芯片检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 定义定义 是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对 从 而同时扩增多个序列 是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对 从 而同时扩增多个序列 复合复合PCR检测技术检测技术 方法分类方法分类 Multiplex PCR conventional PCR Multiplex PCR CGE Multiplex PCR Microarray Multiplex PCR SYBR Green I Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Multiplex PCR 传统复合定性PCR的方法传统复合定性PCR的方法 通过优化各个引物对之间的浓度比 达到同时特异性扩增的目的 同时扩增8种转基因玉米的多重PCR Hari k et al 2008 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 检测LOD可以达到0 25 这种方法快速 灵敏 高特异性 价格低廉 方便操作 可用于日常转基因产品的检测 Hari k et al 2008 复合复合PCR检测技术检测技术 Multiplex PCR conventional PCR Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Multiplex PCR CGE 多重PCR结合酶切分析 毛细管电泳检测多重PCR结合酶切分析 毛细管电泳检测 基于多重PCR产物的扩增 其特异性引物在一 端都标记了6 FAM的荧光基团 PCR产物通过特异性的内切酶进行酶切消化 从 而产生特异性的酶切片段 酶切片段进行毛细管电泳 CGE 的荧光检测 通过产生预期的荧光信号 从而确定转基因陈 分的存在 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Multiplex PCR CGE LIF 分析同时含有转基因玉米 MON863和GA21的混合样品 Virginia et al 2008 这种方法可以同时检测多个目 的片段 高通量 高灵敏度 唯一的缺点在于设备比较昂贵 这种方法可以同时检测多个目 的片段 高通量 高灵敏度 唯一的缺点在于设备比较昂贵 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Sidney et al 2008 复合复合PCR检测技术检测技术 同时检测12个靶序列 Multiplex PCR Microarray 多重PCR结合基因芯片技术多重PCR结合基因芯片技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Multiplex PCR Microarray Sidney et al 2008 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Multiplex PCR Microarray Sidney et al 2008 这种方法也是 高效的 并且 高通量 唯一 不足在于所需 仪器设备比较 昂贵 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 根据PCR产物Tm值不同对多重PCR产物进行检测 根据PCR产物Tm值不同对多重PCR产物进行检测 复合复合PCR检测技术检测技术 Multiplex PCR SYBR Green I Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 用染料 ava green 对1445 531 88913 15985 sad I PCR 产物进行熔解曲线分析 1445 413bp Tm 95 24 531 351bp Tm 88 0 88913 231bp Tm 79 2 15985 175bp Tm 78 1 Sad I 107bp Tm 83 6 复合复合PCR检测技术检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 15985 175bp 78 1 Sad I 107bp 83 6 88913 231bp 79 2 531 346bp 86 0 1445 413bp 95 4 复合复合PCR检测技术检测技术 这种方法对于仪 器要求相对较低 操作简单 实验 时间短 但是不 能检测太多的目 的靶序列 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only LAMP loop mediated isothermal amplification LAMP即环介导等温PCR 是由Notomi T等在2000年发明 的一种新颖的恒温核酸扩增方法 LAMP的基本原理是针对靶基因的6个区域 设计4条特异 性引物 利用一种链置换DNA聚合酶 在恒温65 左右反 应1小时 B2 B3 F3FIP F2 F1C B3 B2 B1F1CF2CF3C B3C B2C B1CF1 F2 F3 BIPB1C 等温扩增技术等温扩增技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 第一阶段 茎环产生阶段第一阶段 茎环产生阶段 第二阶段 循环扩增阶段第二阶段 循环扩增阶段 等温扩增技术等温扩增技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Lectin Mon89788的的3 RRS 特异性和灵敏度特异性和灵敏度 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 Mon89788的的5 LaneM 11M mark 1 空白 2 89788 3 5 RRS 3 MON810 4 GT73 5 棉花 6 转基因番茄 7 非转大豆 8 烟草 9 花生 10 芝麻 11 荞麦 LaneM 12M mark 1 空白 2 89788 3 RRS 4 MON810 5 GT73 6 棉花 7 转基因番茄 8 非转大豆 9 烟草 10 花生 11 芝麻 12 荞麦 等温扩增技术等温扩增技术 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only LAMP的优点 1 操作简便 不需要复杂的仪器 不需要特殊试剂 只需 用水浴锅就可完成反应 2 高特异性 LAMP由4条引物扩增靶序列的6个区段 3 快速 高效 整个扩增30分钟即可完成 4 灵敏度高 扩增模可仅为1拷贝 等温扩增技术等温扩增技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only LAMP技术应用 目前LAMP技术广泛应 用于细菌 病毒的检测 中 LAMP技术在转基因检 测中应有极少 等温扩增技术等温扩增技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 等温扩增技术等温扩增技术 Nucleic Acid Sequence Based Amplification NASBA Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only WP5 meeting 11 12 May Ljubljana ssRNA ss cDNA second specific primer Reverse Transcription RNAse H activity T7 specific primer 100 1000 copies NASBA principle Primer extension Transcription T7 RNA polymerase promoter sequence specific sequence Second target specific sequence 3 5 RNA 3 c DNA Reverse Transcription 5 5 ds cDNA 3 RNA pol Primer extension 5 3 3 5 ss DNA 5 5 3 RNA 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 55 转基因产品检测中应用转基因产品检测中应用 4 amplicons were assayed for singleplex qualitative and quantitative detection IVR 35S tNOS Mon810 Specificity successfully assayed on wild type maize Mon810 Mon863 and GA21 maize RRSoya EH592 527 1 potato and food and feed samples High amplification 1 106 in singleplex 25 min amplification sufficient Amplicons tested Samples35SIVRtNOS GA21 RRS EH92potato G004 07 soy skins G090 09 negative oilseed rape G033 07 feed only IVR Mon810 DNA Mon863 DNA a trace was detected presence confirmed with quantitative PCR Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Quantitative aspects Linear amplification in a short time 5 to 25 min Assessment of the sensitivity and linearity of amplification serial dilution Good sensitivity absLOD between 2 and 11 copies Broad linear range 3 log10 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only Triplex sensitivity and linearity Screening IVR P35S tNOS and Mon810 IVR P35S Mon810 Assessed on serial dilutions Same linear range as for singleplex 3 log10 Same sensitivity as for singleplex down to 2 copies Same amplification profile as for singleplex Mon863 ctl IVR R2 0 9868 IVR R2 0 9353 ctl 35S R2 0 9984 35S R2 0 9029 tNOS R2 0 9548 ctl tNOS R2 0 9992 0 00 5 00 10 00 15 00 20 00 25 00 30 00 35 00 40 00 45 00 50 00 110100100010000 copy nb Ct ctl IVR ctl 35S ctl tNOS IVR 35S tNOS Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only NASBA操作简单 是一个恒温反应 反应温度为41C 不 需要热循环仪 同PCR相比 以RNA为模板 不受背景中DNA的干扰 不易发生交叉污染 整个反应过程由三种酶控制 循环次数少 忠实性高 其 扩增效率高于PCR 特异性好 优点 优点 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 广泛用于禽流感病毒 新城疫病毒 口 蹄疫病毒 狂犬病病毒和产单核细胞李 斯特菌的检测和研究中 国家发布这次发布的8 项禽流感系列标 准中 有两项应用了NASBA 检测方法 NASBA的应用 等温扩增技术等温扩增技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 展望 尽管PCR有着各种各样的优点 但在应用方面 还有其自身的缺点 例如 循环中需要高精度的 温度循环 扩增抑制剂对灵敏度的影响等 等温扩增技术高灵敏度 高特异性 操作简便 不需要昂贵的仪器和试剂 花费时间少 所有这些技术使快速 准确 简便 高效 低消 耗和适用面广的转基因检测技术成为可能 等温扩增技术等温扩增技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 传感器传感器 Biosensor 表面等离子共振式传感器表面等离子共振式传感器 Optical biosensors 压电式传感器 Piezoelectric biosensors 电化学式传感器 Electrochemical biosensors 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 表面等离子共振式传感器表面等离子共振式传感器 Optical biosensors 原理 当入射光以临界角入射到两 种不同折射率的介质界面时 可引起金 属自由电子的共振 使反射光在一定角 度内大大减弱 其中 使反射光在一定 角度内完全消失的入射角称为 原理 当入射光以临界角入射到两 种不同折射率的介质界面时 可引起金 属自由电子的共振 使反射光在一定角 度内大大减弱 其中 使反射光在一定 角度内完全消失的入射角称为SPR角 角 SPR随表面折射率的变化而变化 而折 射率的变化又和结合在金属表面的生物 分子质量成正比 因此可以通过获取生 物反应过程中 随表面折射率的变化而变化 而折 射率的变化又和结合在金属表面的生物 分子质量成正比 因此可以通过获取生 物反应过程中SPR角的动态变化 得到 生物分子之间相互作用的特异性信号 将目标 角的动态变化 得到 生物分子之间相互作用的特异性信号 将目标DNA和固定在传感器表面 的探针杂交 使得溶液表面的折射率 改变 该折射率的改变和杂交的目标 和固定在传感器表面 的探针杂交 使得溶液表面的折射率 改变 该折射率的改变和杂交的目标 DNA的质量成正比 的质量成正比 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 不同长度探针的结果比较不同长度探针的结果比较 从图中可以看到 从图中可以看到 13mers 和和15mers的探针能够有效的和 目标序列杂交 相反 的探针能够有效的和 目标序列杂交 相反 11mers 的探针效果偏低 且稳定性也 较低 的探针效果偏低 且稳定性也 较低 优点 灵敏度高 无需标记 实时监测 优点 灵敏度高 无需标记 实时监测 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 压电式传感器压电式传感器 Piezoelectric biosensors 压电晶体表面微小的压力变化会引 起其振动谐振频率的改变 依据这一原 理 可以通过测量其谐振频率的变化来 测定出晶体表面的压力变化 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 图中是传感器对转基因玉 米 图中是传感器对转基因玉 米Bt176的一个检测 达到平衡 状态时 共振频率的变化 的一个检测 达到平衡 状态时 共振频率的变化 f 为 为18Hz 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 优点 优点 PCR产物无需标记 快速 成本低 产物无需标记 快速 成本低 图中显示的是由传感器分 析的不同百分含量的玉米标准 物质的一个结果 转基因的百 分含量和频率的变化值的线性 关系 显示了转基因的定量检 测 图中显示的是由传感器分 析的不同百分含量的玉米标准 物质的一个结果 转基因的百 分含量和频率的变化值的线性 关系 显示了转基因的定量检 测 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 电化学式传感器电化学式传感器 Electrochemical biosensors 使用的电极 金电极 碳电极 玻 璃电极等 电化学方法 使用的电极 金电极 碳电极 玻 璃电极等 电化学方法 酶联免疫法 亚甲基蓝 反应法等 酶联免疫法 亚甲基蓝 反应法等 以酶联方法为例 生物素标记的以酶联方法为例 生物素标记的PCR产物与固定在传 感器上的探针杂交 然后加入抗生物素蛋白链菌素和 碱性磷酸酶的复合物 碱性磷酸酶可以催化奈基水解 成有活性的奈酚 然后通过循环伏安法检测 产物与固定在传 感器上的探针杂交 然后加入抗生物素蛋白链菌素和 碱性磷酸酶的复合物 碱性磷酸酶可以催化奈基水解 成有活性的奈酚 然后通过循环伏安法检测 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 将巯基丙酸将巯基丙酸 MPA 自组装于金电极表面形成单分子膜 再利用自组装于金电极表面形成单分子膜 再利用1 3 二甲氨基丙基二甲氨基丙基 3 乙基碳二亚胺盐酸盐乙基碳二亚胺盐酸盐 EDC 和和N 羟基琥珀酰亚胺羟基琥珀酰亚胺 NHS 的活化作用将的活化作用将ssDNA探针序列固定于金电极表面 探针序列固定于金电极表面 将将ssDNA修饰的电极与待测溶液中人工合成的转基因食品中常有的 根癌农杆菌终止子 修饰的电极与待测溶液中人工合成的转基因食品中常有的 根癌农杆菌终止子 NOS 基因片段进行杂交 在基因片段进行杂交 在 Fe CN 6 3 4 溶液中进 行循环伏安 表征 溶液中进 行循环伏安 表征ssDNA固定及杂交过程 固定及杂交过程 传感器检测技术传感器检测技术 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software For evaluation only 定量检测NOS基因片段 将不同浓度的将不同浓度的NOS基因基因cDNA溶液滴加到溶液滴加到 ssDNA Au电极表面进行杂交 电极表面进行杂交 2 h后记录 电极表面循环伏安峰电流值差值 检出限为 后记录 电极表面循环伏