心肌肥厚 神经递质.doc

荞麦花叶总黄酮对压力负荷大鼠脑神经递质的影响储金秀 韩淑英 朱丽莎 白静 杨瑞娴（华北煤炭医学院药理学教研室 唐山 063000）【摘要】目的 探讨荞麦花叶总黄酮（TFBFL）对压力超负荷大鼠脑内神经递质5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）及乙酰胆碱（Ach）的影响和意义。方法 药物干预组分别予TFBFL高剂量（0.4gkg-1-1）、低剂量（0.2gkg-1d-1）、卡托普利（60mgkg-1d-1）灌胃（ig），模型对照组和假手术组给予等量的生理盐水，每日1次(o.d.)，连续给药1周后用银夹造成腹主动脉狭窄从而导致大鼠心脏超负荷，于手术后1小时、3小时、12小时立即取脑组织，用分光光度法测定脑组织内神经递质NA、5-HT和Ach的含量。结果 手术后1小时、3小时、12小时模型对照组5-HT及NA的含量相对于正常对照组均有较显著的升高（P0.05 ，P0.01），升高的程度随手术时间的延长而增加。TFBFL高低剂量均能降低5-HT和NA的含量，以高剂量作用更强。各组Ach含量改变不显著。结论 TFBFL对压力超负荷大鼠脑内Ach的影响不明显，但能显著降低5-HT和NA 的含量，这可能是TFBFL抑制心肌肥厚的机制之一。【关键词】荞麦；总黄酮；5-羟色胺；去甲肾上腺素；乙酰胆碱；心肌肥厚Effects of Total Flavones of Buckwheat Flowers and Leaves on the Neurotransmitters in Brains of Pressure Overload RatsChu Jinxiu，Han Shuying, Zhu Lisha, Bai Jing, Yang Ruixian（Department of Pharmacology, North China Coal Medical College, Hebei, China 063000）【Abstract】Objective To explore the influence and significance of total flavones of buckwheat flowers and leaves (TFBFL) on the neurotransmitters i.e. 5-hydroxytryptamine (5-HT), noradrenaline (NA), acetylcholine (Ach) in brains of pressure overload rats. Methods Rats were given TFBFL (0.4gkg-1-1、0.2gkg-1d-1) and captopril （60mgkg-1d-1） by intragastric administration （ig）in drug interference groups once daily (o.d.) for 1 week, meanwhile, normal saline of the same volume was administrated to the rats in model control group and sham-operated group. Then, cardiac pressure overload model was set by coarctating the abdominal aorta with a silver clip. The brains were collected at 1h, 3h and 12h after operation and homogenated, and the contents of 5-HT, NA and Ach were detected with the spectrophotometric method. Results Compared with normal control group, the content of 5-HT and NA in model control group at 1、3、12 hours after operation increased remarkably （P0.05 ，P0.01） and showed time dependence. TFBFL at the two dosages could both lower the content of 5-HT and NA and showed dosage dependence. However, the content of Ach had no significant change in both model and drug treatment groups. Conclusion TFBFL had little effect on Ach in brains of pressure overload rats, but they could remarkably decrease the content of 5-HT and NA, which might be one of the mechanisms TFBFL inhibited myocardial hypertrophy.【Key words】Buckwheat; Total flavones; 5-hydroxytryptamine; Noradrenaline; Acetylcholine Myocardial hypertrophy荞麦是具有较高的营养价值和医疗保健作用的粮食作物之一，它含有丰富的黄酮类化合物。已有研究表明，荞麦花提取的总黄酮及主要成分槲皮素有抑制心肌肥厚的作用1,2。我室前期研究也发现荞麦总黄酮对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚有一定的保护作用2。目前，心肌肥厚的发病率正成逐年上升，它不仅是高血压的病症，而且是引起猝死、心律失常、心肌梗塞等的危险因素之一，是心血管病患者死亡的重要原因之一。本实验在前期研究的基础上，通过观察TFBFL对心肌超负荷大鼠脑内神经递质5-HT,NA,Ach含量的影响来进一步探讨TFBFL对心肌肥厚的影响及机制，旨在为开发防治心肌肥厚的药物提供理论依据。材料与方法1. 主要试剂和仪器：TFBFL(由华北煤炭医学院药理教研室提取)；Ach标准品氯化乙酰胆碱（北京市东环联合化工厂）；5-HT标准品5-羟色胺磷酸肌酐、NA标准品(上海化学药品采购供应站分装) ； 722分光光度计（北京）；850荧光分光光度计（日立）；MP200A型电子天平（上海第二天平仪器厂）；800型离心沉淀机（上海手术器械十厂）；LXJ-型离心沉淀机（上海医用分析仪器厂）2. 动物模型的建立：参考Anversa方法，取体质量（17525）g雄性SD大鼠，以3%戊巴比妥钠腹腔注射（300mgkg-1）麻醉后，行腹正中切口，分离两肾动脉上方的腹主动脉，用一内径为0.7mm的银夹造成腹主动脉狭窄。对照组仅分开腹主动脉，但不予置银夹。3. 分组及给药：取75只大鼠，随机分为5个组：假手术组（SOG）、模型对照组（MCG）、荞麦花叶总黄酮高（HCMG，0.4g kg-1 d-1）、低剂量组(LCMG，0.2gKg-1d-1)、卡托普利组(60mgKg-1d-1)，每组15只，三个药物组于手术前给予相应剂量药物灌胃，对照组给予相同容积的生理盐水，每天一次，所有大鼠均饲以常规固体饲料及瓶装饮用水。术前12h禁食，最后一次药物灌胃1h后进行手术，分别于术后1h，3h，12h从各组动物中随机处死5只，立即取脑进行5-HT，NA和Ach的测定。4. 脑内5-HT及NA含量测定： 4.1 NA的含量测定：参考文献3,4，将大鼠迅速断头取脑500mg，放入预冷的生理盐水中洗去残留血，加入5ml的正丁醇和0.4ml 0.01mol/L HCl ，放入预冷的冷玻璃匀浆器中匀浆后离心10min(1500r/min)，取上清液2ml，加入1.5ml 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，用力振摇10min后，再次离心10min(3000r/min)。分离有机相和水相。吸取提取后的磷酸盐缓冲溶液1ml，再加入碱性硫酸钠0.4ml，放入30水浴中准确反应2min后，迅速用冷水冷却至室温以终止反应，用荧光光度计测定NA荧光（激发波长385nm，发射波长485nm）。取NA标准品2mg，用10ml H2O溶解，再用0.1mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲溶液将其稀释成浓度为200ng/ml , 160ng/ml , 100ng/ml, 50ng/ml, 20ng/ml的标准溶液，用同样方法测定荧光强度，用荧光强度对浓度做标准曲线，利用标准曲线计算NA浓度。4.2 5-HT含量测定：参考文献3，将大鼠迅速断头取脑500mg，放入预冷的生理盐水中洗去残留血，加入5ml的正丁醇和0.4ml 0.01mol/L HCl ，放入预冷的冷玻璃匀浆器中匀浆后离心10min(1500r/min)，取上清液2ml，加入5ml正庚烷，再加入0.5ml 0.1mol/L HCl，用力振摇10min后，再次离心10min(3000r/min)。分离有机相和水相。吸取提取后的HCl溶液0.5ml，加入OPT-HCl溶液3.2ml，摇匀后放入沸水浴中反应20min。迅速用冷水冷却至室温终止反应，用荧光光度计测定荧光强度（激发波长360nm，发射波长470nm）。取5-羟色胺磷酸肌酐作为5-HT标准品6mg，加10ml H2O溶解，用0.1mol/L HCl稀释成浓度为600ng/ml，300 ng/ml，150 ng/ml，60 ng/ml，30 ng/ml标准溶液，用同样方法测定荧光强度，用荧光强度对浓度做标准曲线，根据标准曲线计算5-HT含量。5. 脑内Ach含量测定：参考文献5,6，将大鼠断头，迅速取出脑组织放入液氮中冻存。测定时取出脑组织按1：10的比例加入生理盐水，玻璃匀浆器中匀浆后，准确移取匀浆液0.8ml，加入1.4ml蒸馏水混匀，再加入0.2ml 1.54mmol/L水杨酸毒扁豆碱，缓慢滴加0.8ml 1.84mol/L三氯乙酸，充分混匀后，离心10min（3000r/min）,取上清液1.0ml。另设标准管与空白管：标准管加Ach应用液0.1ml，蒸馏水0.65ml，1.84mol/L三氯乙酸 0.25ml；空白管加蒸馏水0.75ml，三氯乙酸0.25ml。测定、标准、空白三管操作如下：加碱性羟胺1.0ml，混匀后置室温15min，加入4mol/L HCl 0.5ml，0.37mol/L三氯化铁0.5ml。对照管加试剂顺序是：0.37mol/L三氯化铁0.5ml，4mol/L HCl 0.5ml，碱性羟胺1.0ml。（加入试剂后，均须猛烈振摇，否则在比色时会有气泡附着于杯壁，影响比色）。混匀后蒸馏水调零点，用721型分光光度计（波长540nm，光径1cm）测定，读取各管吸光度值（A）。计算脑内Ach含量。脑内Ach含量=测定A/（标准A-空白A）50（1/0.25）6. 数据统计：所有实验数据均用instat软件进行处理，结果以均数标准差（xs）表示。 结 果 1. TFBFL对脑内5-HT含量的影响：由表一可知，术后1、3、12h MCG脑内5-HT含量均明显高于NCG（P0.05，P0.01）。与MCG比较， LCMG和HCMG 各时间点5-HT含量均有下降，以术后3h降低最为明显（P0.05，P0.01）。各时间点都以HCMG作用较好。表一 术后1、3、12小时5-HT的含量比较分组样本数1h含量(mg/ml)3h含量(mg/ml)12h含量(mg/ml)NCG50.41830.080000.41830.080000.41830.08000MCG50.58240.09000a0.82660.04013b0.98220.1491bLCMG50.57100.085000.63500.09393c0.94600.1408HCMG50.44830.080000.61830.1344d0.94000.1427CCG50.25320.05000c0.47170.05457d0.52150.04256c注：与NCG比较，aP0.05 bP0.01 与MCG比较，cP0.05 dP0.012. TFBFL对脑内NA的影响：表二结果显示，术后1、3、12h MCG脑内NA含量均高于NCG，以3h（P0.05）和12h增高明显（P0.01）。与MCG比较， LCMG和HCMG 各时间点NA含量均有下降，以术后3h降低最为明显（P0.05，P0.01）。表二 术后1、3、12小时NA的含量比较分组样本数1h含量(mg/ml)3h含量(mg/ml)12h含量(mg/ml)NCG50.57430.044090.59290.078510.59290.07851MCG50.59290.078510.80200.04400a0.93330.06895bLCMG50.38700.02900d0.58400.08325c0.92230.07632HCMG50.42570.07000c0.67800.085000.59400.06523dCCG50.51750.089000.33580.07851d0.51300.04484d注：与NCG比较，aP0.05 bP0.01 与MCG比较，cP0.05 dP0.013. TFBFL对脑内Ach的影响：表三结果显示，与NCG相比，术后1、3、12h MCG脑内Ach含量变化不明显（P0.05），LCMG和HCMG各时间点Ach含量与MCG相比变化无统计学意义（P0.05）。表三 术后1、3、12小时Ach的含量比较分组样本数1h含量(mg/ml)3h含量(mg/ml)12h含量(mg/ml)NCG50.62990.053000.62990.053000.62990.05300MCG50.58320.059820.61370.059120.63780.03643LCMG50.58950.052170.64230.028920.58500.05362HCMG50.58120.026040.59150.052460.64000.07725CCG50.66430.06213a0.64150.051370.65700.07523注：与NCG比较，aP0.05 讨 论研究表明，5-HT和NA对心脏超负荷心肌肥厚有直接或间接的影响。临床发现，应用5-羟色胺受体拮抗剂ketanserin治疗高血压，可显著降低高血压病逆转心肌肥厚的症状7,8，这一治疗作用有力的提示了5-HT参与心肌肥厚的发生和发展。研究表明，采用腹主动脉缩窄法建立的压力超负荷心肌肥厚模型中5-HT作为一种内源性体液因子参与了心肌肥厚的发生和发展9。NA作为儿茶酚胺类物质，可以刺激心肌细胞上的肾上腺素受体，使心率加快，心肌耗氧量增加。而5-HT又可以间接加强NA的正性频率的作用。Ach是副交感神经兴奋后，其末梢释放的一种神经递质，Ach可使NA的释放受到抑制。本次试验首次对大鼠压力超负荷所致的脑内神经递质的含量变化进行研究。结果表明，模型对照组5-HT及NA的含量相对于正常对照组均有较显著的升高，升高的程度随手术时间的延长而增加。提示了心肌超负荷对大鼠脑内5-HT和NA均有显著影响。各个时间段的TFBFL两个剂量组与模型对照组比较，在3小时两个剂量均能显著降低大鼠脑内5-HT，对NA的降低在三个时间段中，两剂量组作用有差异：高剂量的降低在1小时和12小时较为显著，而低剂量组则在1小时和3小时的影响显著。其余各时段TFBFL两个剂量组的影响虽不显著，但对5-HT和NA仍有降低作用。脑内乙酰胆碱酯酶活性很高，在实验中虽进行了严格控制以最低限度减少Ach的损失，但模型对照组脑内Ach的含量较空白对照组并无明显差异，而TFBFL两个剂量对脑内Ach的含量也无显著影响。近年来，对荞麦的研究越来越深入，已有研究表明荞麦具有多种药理学活性10。本次实验发现TFBFL能抑制5-HT和NA的表达，表明其对心肌超负荷心肌肥厚有一定的预防及保护作用。今后将进一步研究其对Ach的影响，为心肌肥厚的药物开发提供理论依据。参考文献1 Dlay MJ, Elz JS, Nayler WG. Contracture and the Calcivan Paradox in the Rat HeartJ