DNA重组的基本工具.ppt

基因工程 专题1 DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切 拼接 导入 表达 基因工程是指按照人们的愿望 进行严格的设计 并通过体外DNA重组和转基因等技术 赋予生物以新的遗传特性 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的 因此又叫做DNA重组技术 基因工程的概念 问题探讨 苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达 可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉 想一想需要做哪些关键工作 普通棉花抗虫棉 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具 分子手术刀 限制性核酸内切酶 分子缝合针 DNA连接酶 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 1 1 DNA重组技术的基本工具 一 限制性核酸内切酶 分子手术刀 1 主要来源 种类与命名 作用特点 4 限制酶识别序列5 作用结果 识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列 并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 主要从原核生物中分离纯化 产生黏性末端或平末端 Goon 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4 5或8个核苷酸组成 寻根问底 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗 原核生物易受自然界外源DNA的入侵 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制 以防止外来病原物的侵害 限制酶就是细菌的一种防御性工具 当外源DNA侵入时 会利用限制酶将外源DNA切割掉 以保证自身的安全 所以 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效 从而达到保护自身的目的 Goback 种类与命名 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶 限制酶 EcoR Sma 粘质沙雷氏杆菌 Serratiamarcesens 大肠杆菌 EscherichiacoliR Goback 练习 流感嗜血杆菌的d菌株 Haemophilusinfluenzaed 中先后分离到3种限制酶 则分别命名为 Hind Hind 和Hind 限制性内切酶与DNA解旋酶的区别 切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键 将DNA两条链的氢键打开形成两条单链 限制性内切酶与DNA水解酶的区别 切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键 形成片段的DNA 切割磷酸二酯键 形成单个的脱氧核苷酸 Goback EcoR 黏性末端 黏性末端 Goback EcoR 黏性末端 黏性末端 重复演示 Goback 什么叫黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口 带有几个伸出的核苷酸 它们之间正好互补配对 这样的切口叫黏性末端 Sma 平末端平末端 1 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口 可产生几个黏性 平 末端 要切两个切口 产生四个黏性 平 末端 2 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割 产生的末端会是什么关系 会产生相同的黏性 平 末端 思考 3 不同限制酶切割形成的粘性末端能发生黏合吗 借助什么方式来完成黏合 能 前提是不同限制酶切割形成的黏性末端要互补 通过碱基互补配对形成氢键的方式来完成黏合 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR 不同来源的DNA片段混合 将不同种来源的DNA片段连接起来 生物A基因片段 生物B基因片段 GAATTC CTTAAG 酶切 GAATTC CTTAAG 同一种 寻根问底 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么 1 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 1 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 2 以一条DNA链为模板 将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链 2 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来 不需要模板 可把黏性末端之间的缝隙 缝合 起来 E coliDNA连接酶或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙 缝合 起来 但效率较低 T4DNA连接酶 二 分子缝合针 DNA连接酶 作用 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA 即将脱氧核糖和磷酸连接起来 作用原理 催化磷酸二酯键形成 类型 E coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复磷酸二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端 效率较低 相同点 差别 三 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 载体需要的条件 有1 多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制 表达 有某些标记基因 便于鉴定和筛选 5 要大小适宜 常用运载体 细菌的质粒 酵母菌 真核 的质粒 噬菌体衍生物或某些动植物病毒 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录 转基因生物能有预想的效果吗 作为分子运输车 载体 如果没有切割位点将会怎样 霍乱菌的质粒多个限制酶切点 你会用它来做分子运输车吗 目的基因有没有进入受体细胞 如何去发现 常用的载体 质粒 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在 可用含氨苄青霉素的培养基鉴别 思考与探究P7 2 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA 通过长期的进化 细菌中含有某种限制酶的细胞 其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列 或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上 使限制酶不能将其切开 这样 尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断 并且可以防止外源DNA的入侵 3 天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗 为什么 提示 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒 plasmid 即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制 双链闭环的裸露的DNA分子 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢 不是 作为基因工程使用的载体必需满足以下条件 思考与探究P7 1 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点 以便目的基因可以插入到载体上去 这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置 还必须是在质粒本身需要的基因片段之外 这样才不至于因目的基因的插入而失活 2 载体DNA必需具备自我复制的能力 或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 3 载体DNA必需带有标记基因 以便重组后进行重组子的筛选 4 载体DNA必需是安全的 不会对受体细胞有害 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 5 载体DNA分子大小应适合 以便提取和在体外进行操作 太大就不便操作 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件 都要进行人工改造后才能用于基因工程操作 4 DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗 迄今为止 所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力 至于原因 现在还不清楚 也许将来会发现可以连接单链DNA的酶 思考与探究P7 1 在基因工程中 切割运载体和含有目的基因的DNA片段 需使用 同种限制酶B 两种限制酶同种连接酶D 两种连接酶 A 课堂练习 2 不属于质粒被选为基因运载体的理由是A 能复制 B 有多个限制酶切点C 具有标记基因D 它是环状DNA D 课堂练习 3 以下说法正确的是 A 所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B 质粒是基因工程中唯一的运载体C 运载体必须具备的条件之一是 具有多个限制酶切点 以便与外源基因连接D 基因控制的性状都能在后代表现出来 C 课堂练习 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 早期基础理论 达尔文提出生物进化论 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 早期基础理论 孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 早期基础理论 摩尔根证明基因在染色体上 并提出基因的连锁互换定律 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 艾弗里证明DNA是遗传物质 DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 沃森 克里克提出DNA的双螺旋结构模型 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 梅塞尔松 斯塔尔证明DNA的半保留复制 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 克里克等提出中心法则