基因重组与基因工程基因重组与基因工程.ppt

第十四章基因重组和基因工程 授课教师郑志竑 第一节DNA的重组DNARecombination 一 同源重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组 homologousrecombination 又称基本重组 是最基本的DNA重组方式 通过链的断裂和再连接 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换 二 细菌的基因转移与重组 一 接合作用 conjugation 当细胞或细菌通过菌毛相互接触时 质粒DNA从一个细胞 细菌 转移至另一细胞 细菌 这种类型的DNA转移称为接合作用 质粒 细菌染色体外的环状双链DNA分子 可接合质粒 如F因子 Ffactor 二 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型 三 转导作用 transduction 当病毒从被感染的 供体 细胞释放出来 再次感染另一 受体 细胞时 发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用 第二节重组DNA技术 一 重组DNA技术相关概念 一 DNA克隆 也称基因克隆或重组DNA 应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分子 再通过转化或转染宿主细胞 筛选出含有目的基因的转化子细胞 经扩增提取获得大量同一DNA分子 生物技术工程 基因工程 蛋白质工程 酶工程 细胞工程等 基因工程 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作称基因工程 又称重组DNA工艺学 目的 1 分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列2 获得感兴趣基因的表达产物 蛋白质 二 工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶I逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶 限制性核酸内切酶 restrictionendonuclease 识别DNA的特异序列 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 BamH 类酶识别序列特点 回文结构 BamH Hind 平端切口 粘端切口 三 目的基因 又称外源DNA cDNA 经反转录合成的 与RNA mRNA或病毒RNA 互补的单链DNA 基因组DNA 在真核生物体 基因组是指一套完整单倍体DNA 染色体DNA 和线粒体DNA的全部序列 四 基因载体 克隆载体 为携带目的基因 实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体 cloningvector 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体 表达载体 expressionvector 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体 二 重组DNA技术基本原理及步骤 1 目的基因的获取2 基因载体的选择与构建3 目的基因与载体的拼接4 重组DNA分子导入受体细胞5 筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子 转化子 一 目的基因的获取 1 化学合成法要求 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 2 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 3 cDNA文库 以mRNA为模板 利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA 再复制成双链cDNA片段 与适当载体连接后转入受体菌 即获得cDNA文库 cDNAlibrary 组织或培养细胞 载体 mRNA cDNA cDNA与载体连接 导入大肠杆菌 鉴定cDNA文库的克隆数与特征 二 克隆载体的选择常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 载体的选择标准 能自主复制 具有两个以上的遗传标记物 便于重组体的筛选和鉴定 有克隆位点 外源DNA插入点 常具有多个单一酶切位点 称为多克隆位点 分子量小 以容纳较大的外源DNA 三 外源基因与载体的连接 1 粘性末端连接 同一限制酶切割位点连接配伍末端连接 2 平端连接适用于 限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端3 同聚物加尾连接由末端转移酶作用下 在DNA片段末端加上同聚物序列 制造出粘性末端 再进行粘端连接 4 人工接头 由平端加上新的酶切位点 再用限制酶切除产生粘性末端 而进行粘端连接 四 重组DNA导入受体菌 受体菌条件 安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 导入方式 转化 transformation 转染 transfection 感染 infection 五 重组体的筛选 1 直接选择 抗药性标记选择插入失活法标志补救分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 原位杂交 2 非直接选择法 免疫学方法 如免疫化学方法酶免检测法重组DNA技术简单概括为 分 切 接 转 筛 第三节重组DNA技术与医学的关系 一 疾病基因的发现与克隆 二 生物制药 三 基因诊断 四 基因治疗 五 遗传病的预防 小结 自然界基因转移伴发重组的形式有多种 细菌的基因转移包括接合 转化 转导作用等 在这些过程中不同DNA分子间发生的共价连接即为