总RNA提取常见问题分析.doc

总RNA提取常见问题分析Q：RNA降解 A：1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。Q：OD260/OD280比值偏低A：1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。Q：RNA提取得率低A：1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4g/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2g/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量0.05g/mg)。2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。质粒DNA提取常见问题分析Q: 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？A:1. 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。2. 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。5. 溶液使用不当：溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。6. 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。8. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。9. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。10. 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60后使用，有利于提高洗脱效率。11. 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。12. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。Q: 质粒纯度不高，如何解决？A:1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。2. 混有RNA：RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。3. 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。4. P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5和Top10。6. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。1）分离外周血中的单个核细胞（PBMC） 1抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含510IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上(按常规配制聚蔗糖-泛影葡胺液，比重1.077)，室温中，水平离心500g 20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黄层。 2吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加12倍量含5IU/ml肝素、2灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液.无Ca2+、Mg2+的Hanks液的配制甲液：氯化钠80g，氯化钾4g，加双馏水至500ml；乙液：磷酸氢二钠1.52g，磷酸二氢钾10g，0.4%酚红水溶液50ml，加水至500ml。取甲液25ml，乙液25ml，加水至500ml；用5.6%碳酸氢钠溶液调节pH值为7.47.6后热压灭菌，即得），混匀后离心200g 10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。3再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500g 10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞.2如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。3计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）计数的全部活细胞数10 00021/4)。再用含10小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得11062106PBMC。巨噬细胞的纯化1）用帖壁法纯化巨噬细胞1用含2040小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成21064106/ml的浓度。以每平方厘米21054105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37 5 CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。2040的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。/P2摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞34次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mmol/L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37 1530分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250g 10分钟，去上清液。3用预冷的Hanks液洗涤细胞34次，每次离心250g 10分钟，去上清液。最后用含10小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力，将细胞配成所需的浓度。2）用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞1 取15ml离心管