（药物分析学专业论文）分子印迹聚合物毛细管涂层的制备及电色谱评价.pdf

学位论文原创性声 本人郑重声明 所呈交的论文是我个人在 研究工作取得的研究成果 除了文中特别加以 谢的地方外 论文中不包含任何其他个人或集 的研究成果 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意 学位论文作者签名 日期 叫户年f 月乙夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留 使用学位论 文的规定 即 学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数 k 据库进行检索 并采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编以 供查阅和借阅 同意学校向国家有关部门或机构送交论文 并编入 有关数据库 保密 u 在 年解密后适用本授权书 本论文属于 不保密圈 请在以上方框内打 4 作者签名 叠遗邀日期 矽卜年户月护日 导师签名 垄 塾i 圣日期 矽f c 7 年期切e l 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 分子印迹 m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s m i p 是合成预定选择性固定相的 新兴技术 电色谱 c a p i l l a r ye l e e t r o e h r o m a t o g r a p h y c e c 是一种新型的高效微分 离技术 因此c e c 与m p 的结合是c e c 的高效率及m 的高选择性集成 更 有助于充分发挥各自的特点 是当前的前沿课题之一 本文的第一部分我们发展了新型的三元致孔剂 甲苯 异辛烷 d m s o 解 决了传统的一元和二元致孔剂无法克服的极性分子溶解问题 我们利用原位热 引发聚合的方法 一步反应合成了小佐匹克隆印迹毛细管涂层柱 在电色谱分 离模式下实现了佐匹克隆对映异构体的分离 系统考察了合成条件以及电色谱 操作参数对分子识别和手性分离的影响 在优化电色谱条件下 佐匹克隆外消 旋体达到了基线分离 最大分离度r s 5 3 9 d 佐匹克隆的最高柱效达到了2 1 4 0 0 p l a t c s m 本文的第二部分我们以 一萘普生为模板分子 一单体 2 甲基丙烯酰胺丙基 丙烯酸酯 为功能单体 偶氮二异丁腈 a i b n 为引发剂 利用原位热引发聚合 进行一单体分子印迹毛细管薄层的制备研究 所得的分子印迹毛细管用电色谱 模式考察其柱效及不同p h 值 不同进样浓度等色谱条件对手性分离效果的影响 并考察了各种电色谱操作参数对电渗流 e o f 的影响 在优化电色谱条件下 萘普生外消旋体达到了基线分离 最大分离度r s 4 1 6 s 一萘普生的最高柱效 达到了1 3 7 0 0p l a t e s m 结果显示 新型一单体分子印迹聚合物与传统的二单体 分子印迹聚合物相比 不但有效的简化了实验设计 并且证明一单体分子印迹 聚合物对印迹分子有更强的分子识别能力 是非常有前途的新型功能单体 关键词 分子印迹 电色谱 涂层柱 一单体 a b s t ra c t m 0 1 e c u l a r l vi m p r i n t e dp o l y m e r m i p i san e wt e c h n i q u ef o rs y n t h e s i z i n gt h e s t a f f o n a r yp h a s e w i t ht h ea b i l i t yo fp r e d e t e r m i n e ds e l e c t i v i t y c 印i l l 叫 e l e c t r o c h r o m a t o 鲫h y c e c i sa n e ws e p a r a t i o nt e c h n i q u ew i t hh i g he f f i c i e n c y t h e c e c b a s e dm i pi s 也ec o m b i n a t i o no ft h eh i g he f f i c i e n c yo fc e ca n dt h e h i g h s e l e c t i v i t yo fm i p w h i c h i sap r o m i s i n gm e t h o d i n 也e 龟 s tp a r to ft h i sp a p e r i no r d e rt op r e p a r em i pc a p i l l a r yc o a t i n g sf o r ap o l a r t e m p l a t e an e wt e r n a r yp o r o g e nw a sd e v e l o p e d t o l u e n e i s o o c t a n e d m s o t h e d z o p i c l o n e i m p r i n t e dc o a t i n g s w a ss y n t h e s i z e db ya l l i n s i t ut h e r m o m a t c d p o l y i i l d z a t i o nm e t h o da n de v a l u a t e db yc e c t h es y n t h e s i sc o n d i t i o n sa n d t h ec e c s 印嬲吐0 np a r a m e t e r st h a ti n f l u e n c e dt h em o l e c u l a rr e c o g n i t i o n a n dc h i r a ls 印a r a t l o n w e r e 咖d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h eb a s e l i n es e p a r a t i o n o fr a c e m i cz o p i e l o n ew a u s 0 b t a i n e d u n d e rt h e0 p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h er sv a l u ew a s5 3 9 a n dt h ec o l u m n e f f i c i e n c yo f d z o p i e l o n ew a su p t o2 1 4 0 0p l a t e s m i np 撕t 7 旧 o n em o n o m e r 2 m e t h a e r y l a m i d o p o p y lm a t h a e r y l a t e m o l e c u l a r l y i m 研n t c dp o l y m e rc o a t i n g s w e r es y n t h e s i z e db y a l li n s i r et h e r m o i m t i8 眦 p o l 皿耐z a t i o nm e t h o d o nt h er e s u l t a n tm i p sc o a t i n g s t h ec o l u m ne 伍c l e n c y t h e v a l u eo fp ha n dt h es a m p l ec o n c e n t r a t i o nw o r ei n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t s o fc e c p a r 锄e 储so ne o fw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h eb a s e l i n e s e p a r a t i o n o fr a c e m l c n a p r o x e nw 嬲a c h i e v e d u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h er s v a l u ew a s4 16a n d m ec 0 l 啪ne 伍c i e n c yo f s n a p w a su pt o13 7 0 0p l a t e s m r e s u l t ss u g g e s t e dt h a t o n em o n o m e rm o l e c u l a d yi m p r i n t e dp o l y m e r c a l le f f e c t i v e l ys i m p l i f y t h e e p 甜m a 删d e s i g n w i t hh i g h e l s e l e c t i v i t y a n dr e s o l u t i o nt h a n仃础t i o n 甜 m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r k e y w o rd s m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s m i p s c a p i l l a r yd e c t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c c o a t i n g s o n em o n o m e r 天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要 i a b s t r a c t i i 符号说明 v 前言 1日u 舌 l 研究现状 成果 1 研究目的 方法 1 3 第一章d 一佐匹克隆印迹涂层柱的制备以及电色谱研究 1 5 1 1 试剂及仪器 1 5 1 2d 一佐匹克隆印迹涂层柱的制备和表征 1 6 1 2 1 毛细管的预处理 1 6 1 2 2d 一佐匹克隆印迹涂层柱的制备 1 6 1 3 结果与讨论 1 8 1 3 1 致孔剂 1 9 1 3 2 预聚合混合物中模板浓度对手性分离的影响 3 0 1 3 3 单体交联剂比例对手性分离的影响 3 4 1 3 4 毛细管印迹涂层中电渗流 e o f 的表征 3 7 1 4 小结 4 0 第二章一单体分子印迹涂层柱的制备以及表征 4 2 2 1 s 一萘普生分子印迹聚合物的制备 4 3 2 1 1 仪器与试剂 4 3 2 1 2 毛细管内壁的预处理 4 4 2 1 3 一单体分子印迹涂层柱制备方案 4 4 2 2 实验结果 4 5 2 2 1 合成条件对印迹涂层柱制备的影响 4 5 2 2 2 电色谱条件对分子印迹效果的影响 4 9 2 2 3p h 值及分离电压对电渗流的影响 5 5 2 2 4 一单体印迹电色谱涂层柱的柱效研究 5 9 2 3 讨论 6 2 2 3 1p h 值对印迹识别效果的影响机理 6 2 i i i 天津医科大学硕士学位论文 2 3 2p h 对一单体聚合物电渗流的影响与m 从单体聚合物的对比 6 2 2 4 小结 6 3 结论 6 4 参考文献 6 5 发表论文和参加科研情况说明 7 3 综述 7 4 分子印迹聚合物毛细管电色谱整体柱的研究进展 7 4 综述参考文献 9 1 致谢 9 4 i v 天津医科大学硕士学位论文 m i p s c e c 正z o p 二 z o p r a c z o p e d m a m a a a i b n s e m d m s o 足 n a p s 忒a p r a c n 心 m p s 符号说明 m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s c a p i l l a r ye l e e t r o c h r o m a t o g r a p h y d z o p i c l o n e l z o p i e l o n e r a c z o p i e l o n e e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e m e t h a c r y l i ea c i d 2 2 a z o b i s 2 一i s o b u t y r o n i t r i l e s c a ne l e c t r o nm i c r o s c o p e d i m e t h y ls u l p h o x i d e r n a p r o x e n s n a p r o x e n r a c n a p r o x e n y m e t h a c r y l o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e o m n i m i p so n em o n o m e rm o l e c u l a r l yi m p r i n t e d p o l y m e r s v 分子印迹聚合物 毛细管电相色谱 左旋佐匹克隆 右旋佐匹克隆 混旋佐匹克隆 二甲基丙烯酸乙二醇酯 甲基丙烯酸 偶氮二异丁腈 扫描电镜 二甲基亚砜 右旋萘普生 左旋萘普生 外旋萘普生 产甲基丙烯酸氧丙基三甲 氧基硅烷 一单体分子印迹聚合物 天津医科大学硕士学位论文 研究现状 成果 上 一 刖吾 毛细管电色谱的基本原理 毛细管电色谱 c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t p h y c e c 是近十几年来综合了高效 液相色谱 h i g hl i q u i dp e r f o r m a n c ec h r o m a t o g r a p h y h p l c 和毛细管电泳 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e 的优势而发展起来的一种新型高效微分离技术 毛细管电色谱是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布 键合色谱固定相 用高压 直流电源 或辅加一定的压力 代替高压泵 即依靠电渗流 e o f 来推动流动相 使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间分配系数的不 同 和自身电泳淌度的差异而达到分离分析的一种电分离模式 毛细管电色谱 相对于常规的液相色谱而言 不仅克服了高效液相色谱中压力流本身流速不均 匀引起的峰扩展 而且柱内无压降 使得峰扩展只与溶质扩散系数有关 因而 使毛细管电色谱的理论塔板数大幅高于高效液相色谱 能达到接近于毛细管电 泳的高理论塔板数 同时由于引入了高效液相色谱固定相 使毛细管电色谱具 备了其选择性 使它不仅能分离带电物质 也能分离中性化合物 另外 毛细 管电色谱是微柱分离分析技术 很容易实现与其他分析技术的联用 如c e c m s c e c i r 和c e c n m r 的联用 因此 概括的说 c e c 具有以下优点 1 高灵 敏度 高分辨率 高速度 2 所需样品少 运行成本低 3 应用范围广 毛细管电色谱的发展 毛细管电色谱的发展可追溯到2 0 世纪5 0 年代 m u o l d 等将电场引入薄层色 谱系统 成功分离了胶棉中的多糖成分 l p r e t o r i u s 等将电场引入到h p l c 中 显示了以电渗流作为流动相的推动力进行分离的巨大优势 2 但由于采用的柱直 径较大 未能将毛细管电色谱的优越性充分发挥 j o g e n s o n 等发表了在毛细管电 泳史上具有里程碑意义的论文 在1 7 0 1 x m 内径的毛细管中填充1 0 1 a m 粒径的 p a r t i s i lo d s 2 成功地分离了9 甲基葸等多环芳烃 获得了3 1 0 0 0p l a t e sm 以的 柱效 第一次向世人展示了毛细管电色谱的巨大潜力 3 t s u d a 等采用3 0 p r o 内 径o d s 键合的开管柱 在1 3 k v 电压下成功分离了毛细管区带电泳难以分离的 苯 萘 联苯 葸等芳香化合物 4 随后 m a r t i n 等研究了开管柱电色谱的轴向 天津医科大学硕士学位论文 扩展及峰展宽 从理论上证实了用电渗流推动流动相的优越性 5 k n o x 等进一 步研究了大量有关填充柱电色谱的理论问题 弄清了填充柱电色谱中峰展宽的 影响因素 从理论和试验上证明了c e c 的分离效率明显高于h p l c t f 丌 b a y e r 等首次实现了毛细管电色谱与核磁共振的联用 8 阎超等研制了世界上第一台专 用梯度加压电色谱仪 c h e l a 等实现了毛细管电色谱与电感耦合等离子体 质谱的 联用 9 尽管毛细管电色谱的发展历史并不很长 但在理论 技术和应用方面均 已取得长足发展 毛细管电色谱柱 在c e c 系统中 最重要的组成部分是c e c 毛细管柱 根据固定相的存在形 式 c e c 毛细管柱可分为填充柱 开管柱和整体柱三类 1 0 d 1 1 c e c 填充柱就是 在各种不同孔径的毛细管内填充高效液相色谱常用填料 并以此为分离基质 用电渗流或电渗流结合压力推动流动相 进而实现样品分离 目前最常用的填 料为多孔o d s 其粒径为3 岬或5i t r n e l 2 开管柱模式是用各种硅烷化试剂对 毛细管内壁进行修饰 形成一层硅烷化的涂层 分析物通过在涂层上的分配 用电渗流或电渗流与压力一起驱动流动相进行分离 如果不加压力驱动 在普 通毛细管电泳仪上就可以进行开管柱毛细管电色谱操作 整体柱毛细管电色谱 是通过原位聚合在毛细管中形成连续 多孔的固定相的一种电色谱模式 1 3 1 该 柱模式不仅避免了填充柱中封口的制各 同时又可以克服开管柱相比较小的不 足 因此 在近几年颇为引人注目 毛细管电色谱的应用 从目前文献报道的情况看 毛细管电色谱的应用研究主要围绕以下几个方 面 多环芳烃及药物中间体的分离分析 氨基酸 肽 蛋白质 核酸及相关化 合物等的分离分析 当采用梯度洗脱技术 与质谱联用技术 新型检测器以及 无孔o d s 快速分析等方法时 毛细管电色谱可成功地实现氨基酸分析 毛细管 电色谱还被应用于手性对映体拆分 样品富集和预浓缩等 例如 电色谱的手 性拆分主要有两种模式 手性固定相一非手性流动相和手性流动相一非手性固定 相 目前常用的手性固定相有环糊精 分子印迹固定相 c h i r a s i l d e x 涂层或修 饰的固定相 奎宁修饰的固定相 大环抗生素固定相 聚丙烯酰胺和多糖衍生 的手性固定相 纤维素涂层 聚合物固定相和蛋白质 常用的流动相手性添加 2 天津医科大学硕士学位论文 剂有环糊精和奎宁氨基甲酸盐等 除选择适当的手性固定相或添加剂外 各类 操作参数 如电压 流动相中有机相改性剂含量 电解质浓度等都会对对映体 的分离度产生影响 此外 毛细管电色谱还在离子分析 染料分析 食品分析 中得到了应用 柱效和分离度均达到令人满意的效果 毛细管电色谱技术所存在的问题及展望 尽管c e c 的研究与应用飞速发展 但还存在着诸如气泡产生 柱子易断 检测灵敏度低 填料种类有限等问题 特别是在分离生物大分子样品 如d n a 蛋白质时 尚存在方法匮乏 重现性差等问题 而这恰是c e h p l c 的优势 因此 预计在很长一段时间内 三种方法将呈互相补充及相互验证的关系 c e c 能否成为一种实用的分离分析技术主要取决于c e c 试验技术的发展 目前来看 c e c 技术还有很大的改进和发展空间 目前 随着填充柱技术 联用技术 梯 度洗脱技术等的发展和完善 毛细管电色谱研究已进入实际分析应用研究阶段 分子印迹聚合物研究进展 分子印迹技术是合成具有预定选择性的固定相的新兴技术 它将要分析的 目标分子 印迹分子 作为模板 与功能单体 交联剂 引发剂等混合 在一定 条件下发生聚合反应 形成聚合物后再将印迹分子从中洗脱出来 制得分子印 迹聚合物 分子印迹聚合物是根据印迹分子定做的 它具有特殊的分子结构和 官能团 能选择性的识别印迹分子 另外 它与天然的分子识别系统如酶与底 物 抗体与抗原 受体与激素相比 具有抗恶劣环境的能力 此外 它对印迹 分子的立体结构具有 记忆 功能 当印迹分子为d 一或三 构型对映体时 m m 便 具备了对预定对映体的选择性 并可预示其洗出顺序 这一特性是一般手性固 定相所不具备的 早在1 9 4 0 年 p a u l i n g 就提出了可利用抗原作为模板 来构造抗体的空间结 合位点理论 1 9 4 9 年 d i c k e y 首次提出了 分子印迹 这一概念 但在很长时间 并没有引起人们的重视 直到1 9 7 2 年 德国的w u l f f 研究小组首先报道了人工 合成的有机分子印迹聚合物 这项技术才逐渐为人们所认识 尤其是1 9 9 3 年 m o s b a c h 1 4 等在 n a t u r e 上发表有关茶碱分子的印迹聚合物的报道后 这一技 术开始飞速发展起来 如今在制备方法 印迹机理及在各个领域中的应用等方 面的研究都有了很大的进展 每年公开发表的论文几乎呈直线上升 包括环境 3 天津医科大学硕士学位论文 o s 医药 1 6 1 食品分析 1 刀等 其具体应用如图1 1 8 所示 图1 分子印迹聚合物的应用示意图 分子印迹聚合物的基本原理 分子印迹聚合物是指在模板分子存在下 功能单体和交联剂在模板分子周 围发生聚合反应 印迹分子与一个或几个功能单体复合 形成一种空间固定的 具有预定选择性的三维网状结构的高度交联的 交联度通常高达8 0 以上 固 体聚合物 然后除去模板分子 其在形状 大小和功能基团上与模板分子相匹 配 对模板分子有永久记忆力 可以从混合物中与模板分子选择性的重新结合 其合成过程一般分为三步 首先以具有适当功能基团的功能单体与模板分子相 结合 形成模板一单体复合物 然后加入交联剂 在一定条件下经引发剂引发 发生聚合反应 形成高度交联的聚合物 最后 通过一定的方法 如水解或者 温和萃取 把模板分子洗脱下来 这样便制得分子印迹聚合物 其制备过程如 图2 1 9 所示 根据印迹分子与功能单体形成复合物时作用力性质的不同 分子 印迹分为共价型和非共价型两种 合成方法也可分为两类 1 共价法又称为预组织法 p r e o r g a n i z e da p p r o a c h 主要由w u l f f 等创立 模板分子与功能单体通过可逆的共价键 如形成可逆的酯 2 0 1 缩醛 酮 2 1 2 3 1 希 夫碱 2 4 2 s 金属配合物 2 6 0 1 等 形成复合物 形成的复合物在交联剂的作用下聚 4 天津医科大学硕士学位论文 合形成聚合物 它主要通过化学作用力 如水解等 断开共价键才能除去印迹 分子 目前该方法已被用于制备各种具有识别功能的聚合物 如糖类及其衍生 物 甘油酸及其衍生物 氨基酸及其衍生物 扁桃酸 芳香酮 二醛 三醛 铁转移蛋白 联辅酶及甾醇类物质 但是由于该方法难以寻找合适的功能单体 并且过程复杂 洗脱印迹分子也较困难 使得该方法缺乏普遍性 a 图1 2 分子印迹聚合物的制备示意图 2 非共价法又称为自组织法 s e l f a s s e m b l ya p p r o a c h 该方法研究工作 的代表是瑞典的m o s b a c h e l 4 d 组 单体与模板分子之间是通过弱的相互作用力 如氢键 偶极 离子作用 金属螯合 静电作用 p p 作用 疏水作用 范德华 力等形成单体一模板复合物 而且是在聚合前在溶液中自发形成的 聚合反应 完成后 用适当的溶剂进行温和萃取 除去模板分子 此法已被用于下列物质 印迹聚合物的制备中 染料 二胺 维生素 氨基酸衍生物 多肽 肾上腺素 功能药物阻抑剂 茶碱 二氮杂苯 核苷酸碱基 非甾醇类抗感染药萘普生和 苄胺等 由于非共价型印迹聚合技术具有较广泛的目标分子的范围 分子间作 用力形 印迹技 的m 口则依据静电引力 氢键作用等弱的作用力对物质进行识别 更接近天然 的分子识别系统 如酶与底物 但以共价方式制得的m p 稳定性好 为了将两 种方式的优点全部结合起来加以利用 w h i t e c o m b e 3 l 等巧妙的将共价印迹与非 共价印迹两种技术结合起来 用4 一乙烯基苯基碳酸酯作单体 首先通过共价作 用使印迹分子与单体形成碳酸酯的共价复合物 聚合反应完成后 用碱水解除 去印迹分子 随着羰基的水解 打开了单体和印迹分子之间的共价键 此m m 上就产生了一个非共价型的分子识别位 识别位点上的酚羟基可以通过氢键进 行分子识别 这一种印迹聚合物既具有了共价型m m 的稳定性 也具有了非共 价型m 口的分子识别性能 分子印迹聚合物的制备 模板分子 模板分子也叫目标分子 印迹分子或烙印分子 目前研究较多的印迹分子 有糖类 甘露糖 半乳糖 果糖 氨基酸及其衍生物 3 2 1 蛋白剧3 3 1 核苷酸及其 衍生物 嘌呤 嘧啶等生物碱 羧酸 二醛 胆固醇 维生素 酶 抗原 神 经递质如乙酰胆碱 杀虫剂 除草剂 染料 药物等 功能单体 共价型分子印迹中可选用的功能单体有限 目前常用的有硼酸 二醇 含 硼酸酯的硅烷混合物等 如4 乙烯基苯硼酸 4 乙烯基苯甲醛 4 乙烯基苯胺和 4 乙烯基苯酚等 非共价型印迹中常用的单体较多 如甲基丙烯酸 m a a 丙 烯酸 三氟甲基丙烯酸 t f m a a 甲基丙烯酸甲酯 m m a 甲基丙烯酸丁 酯 b m a 甲基丙烯酰胺 丙烯酰胺 1 一乙烯基咪唑 4 乙烯基吡啶 4 一v p y 2 乙烯基吡啶 2 v p y 和氨基甲酸乙酯等 最常用的单体是甲基丙烯酸 m a a m a a 主要通过羧基与印迹分子发生作用 可以与胺类发生离子作用 同酰胺和 羧基发生氢键作用 常用于极性较低的溶剂中 而t f m a a 有很强的吸电子效 应 羧基酸性较强 有利于和碱性印迹分子形成离子作用复合物 2 v p y 4 v p y 因可以和底物中的羧基发生离子作用而受到重视 6 天津医科大学硕士学位论文 交联剂 交联剂的作用是使模板分子和功能单体形成高度交联的刚性聚合物 固化 单体的功能基团在模板分子周围特定的位置上 目前应用较多的交联剂有二甲 基丙烯酸乙二醇酯 e d m a 三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯 t r j m 季戊四 醇三丙烯酸酯 p e t i 认 季戊四醇四丙烯酸酯 p e t e a n n 一亚甲基双 丙烯酰胺 二乙烯基苯 d v b 等 因为这些交联剂稳定性好 容易除去 有 高选择性而被广泛应用 它们在有机溶剂和亲水溶剂中均可使用 并按照 e d m a t r i m p e t r a p e t e a 的顺序 对映异构体的分离能力下降 e d m a 有较强的对映异构体选择性 矧 以e d m a 为交联剂时 模板与功能单体及交联 剂的比例为l 4 2 0 时 可达到最佳识别分离效剁3 5 1 以t r i m 为交联剂时 模 板与功能单体及交联剂的比例为1 4 1 6 时 可达最佳识别分离效果 3 6 1 色谱研 究表明 选用p e t r a 和t r i m 作交联剂制备的m 印迹分子氨基酸衍生物和 肽的柱容量及选择性优于e d m a 3 6 致孔剂 致孔剂的选择在分子印迹手性整体柱的制备中尤为重要 选择的致孔剂要 满足以下三个要求 1 能溶解模板分子和功能单体 2 能形成大的流通孔 从而保证流动相能在较低的压力下流过色谱柱 3 对模板分子和功能单体之 间的相互作用干扰小 一般情况下 在与致孔剂一致的溶剂中合成的m 口具有 最佳的选择性 因为聚合时致孔剂有可能影响模板与单体之间的相互作用 常 用的致孔剂有乙腈 氯仿 异辛烷 甲苯等 也有一些极性溶剂如四氢呋喃 t h f 甲醇 环己醇 1 一十二醇等 但极性溶剂对非共价印迹不利 聚合方法 常用的聚合方法为自由基引发聚合 常用的引发剂为偶氮二异丁腈 a i b n 也可用偶氮二异庚腈 a i h n 引发形式有高温热引发聚合和低温光引发聚合 两种形式 热引发聚合一般在高温下 3 5 8 0 进行 形成一种较密的聚 合物 而光引发聚合则在低温下 2 0 4 进行紫外光 3 5 0n m 3 6 6a m 范围内照射下引发 s h a n n e s y 3 9 等认为低温光引发具有下述特点 1 一般光引 发所得印迹聚合物有更高的印迹能力 定印迹分子与单体可形成的稳定的聚合 物 2 它可对热不稳定的化合物进行印迹 3 并可以改变聚合物的物理性 7 天津医科大学硕士学位论文 质以获得更好的选择性 因此 低温光引发获得了更广泛的应用 一般情况下 光聚合的m p 的分离因子高于热引发聚合的 这与热聚合方式下聚合速度快且 受热不均匀 模板分子与单体形成的配合物不稳定 造成印迹孔穴有所失真有 关 对于那些易热分解的物质 光聚合的方式更为合适 另外 也可利用弘辐射 聚合的方式 如利用少射线引发制备了以薄荷醇为模板分子的m i p 1 6 1 该方法 的优点是不需要使用引发剂 并且可在适当的温度下进行聚合反应 制备方式 分子印迹聚合物的制备方法主要有 1 本体聚合法 b u l kp o l y m e r i z a t i o n 4 0 4 1 1 在分子印迹技术发展之初 大多数m 口采用这种本体聚合法 其优点在于其对印迹分子具有良好的选择性 和识别性 而且合成操作条件易于控制 实验装置简单 便于普及 迄今仍为 m p 的主要制备方法 但此法制备的聚合物 必须经过研磨 筛分等处理 因 此 该方法不但操作手续繁琐 而且损失严重 一般只有5 0 的收率 且其不 规则的形状还会影响色谱分离的效果 使柱效降低 2 另外又发展了球形聚合物的制备方法 主要有四种 即悬浮聚合法 s u s p e n s i o np o l y m e r i z a t i o n 4 2 多步溶胀法 m u l t i s t e ps w e l l i n gp o l y m e r i z a t i o n 4 3 4 6 1 沉淀聚合法 p r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o n 4 3 和表面印迹聚合法 s u r f a c e i m p r i n t i n gp o l y m e r i z a t i o n 4 4 采用这几种方法制得的m i p 球形聚合 物 主要用作柱色谱和毛细管色谱固定相的填充材料以及免疫分析的吸附材料 3 最近又发展了一种新的聚合方法 原位聚合法 i n s i t up o l y m e r i z a t i o n 4 5 删 1 9 9 3 年 m a t s u i 4 7 1 等首先将原位聚合法引入m i p 的制备中 在色谱柱的 管内直接合成m p 固定相 原位聚合是将印迹分子 功能单体 交联剂和致孔 剂放在某些容器 如不锈钢管 毛细管 p e e k 管 中或固体表面上直接聚合的 方法 该方法所得聚合物不需研磨 筛分等手续 可直接用于分析 该方法具 有直接 简便等优点 分子印迹技术在毛细管电色谱手性分离中的应用 实验证明分子印迹聚合物对印迹分子有显著的选择性 并且m i p s 具有低成 本 良好的物理化学稳定性的优势 近年来 m i p s 被广泛的应用于各个领域 例如 酶催化 4 8 1 生物传感器 4 9 1 生物抗体刚 固定相提取 5 1 1 药物载体圈和色谱 8 天津医科大学硕士学位论文 5 3 m i p s 的这些优势促使其广泛的被用于手性分离的固定相 5 4 5 5 尤其是在 h p l c 中应用较多 与传统的手性固定相相比 m i p s 有更高的对映异构体分离 能力和预选择性 5 7 然而 印迹分子在色谱应用中存在严重的拖尾现象 并且 其柱效也比较低 这使m i p s 的应用收到了很大限制 鉴于c e c 的优点 近年 来 研究者把更多的精力放在了把m i p 应用于c e c 5 6 5 刀的研究上来 而之前人 们关注的是如何将m 口应用到液相色谱中 5 8 5 9 在过去的1 0 年中 大量关于c e c 的研究显示 这种技术作为分析分离的手 段具有良好的发展前景 c e c 被认为结合了c e 的高分离效率和h p l c 的高度 选择性两者的优点 许多研究表明 基于c e c 的m i p s 比基于h p l c 的m i p s 有更高的效率 除此之外 鉴于c e c 具有低消耗的特点 当印迹分子比较昂贵 时 使用这种方法只需要消耗极少量的模板分子或单体 m i p c e c 固定相类型 对m 口 c e c 的应用提出的第一个要求是 要有适用于分子印迹技术的毛细 管形式 这并不是一项简单的任务 我们不能直接将应用于h p l c 中的m i p s 作 为毛细管电色谱的固定相 在毛细管柱的应用中尚存在一些问题 比如如何将 不规则的m p 粒子填充到毛细管中 另外毛细管材质本身带来的一些问题 如 毛细管比较脆弱 易产生气泡等 这些都是c e c 中常见的问题 然而 近期一 系列的报道说明 人们在克服这些困难的过程中取得了重大进步 对c e c 来说 有以下几种不同的m i p 形式 1 填充柱 2 作为流动相颗粒添加剂 3 m i p 整体柱和 4 m i p 涂层柱 填充毛细管柱 l i n 等唧 采用传统方法制备印迹聚合物 经过研磨和筛分后 得到m i p 粒 子 随后通过匀浆法将m p 粒子填充进毛细管中 并用聚丙烯酰胺凝胶塞确保 固定相不流失 这种方法最大的局限性在于需要柱塞 尤其是使用聚丙烯酰胺 凝胶可能为以后的分析带来不确定的干扰 另外 m i p s 粒子外形的不规则性以 及在粉碎 筛分过程中造成的尺寸不均匀进一步降低了整个系统的效率 吸附m 口色谱柱是通过固定剂将m p 微粒固定在毛细管内或者在毛细管内 形成聚合物网络 从而避免了制作 使用柱塞 6 1 1 这种方法最明显的优点是消 除了柱塞存在的必要性 9 天津医科大学硕士学位论文 作为流动相颗粒添加剂 对基于m 口的c e c 分离来说 将m p 作为流动相添加剂是一种可行的方 案 这种方案最吸引人的特点是摆脱了极其耗时的毛细管填充过程 并且不需 要柱塞 具体方法是 m 口粒子被添加到电解液中 m p 粒子一电解液混合物被 填充到了开管毛细管中并得到了一种基本稳定的相 因此为了得到稳定的混悬 液 m m 粒子的量就非常关键 在电解液中加入过多的m 口粒子会导致沉降的 发生 而这种情况很可能使实际引入毛细管中的m 口粒子的量发生变化甚至可 能使毛细管发生堵塞 另外 这种填充方法降低了分析的灵敏度并且限制了聚 合物可以使用的浓度 为了得到一个m 口粒子在高浓度溶液中仍然稳定悬浮的 系统 通过沉淀聚合法合成了纳米级的m i p 粒子 6 2 捌1 图3 图4 口畔圈一 妇 嘁 图3 粒子填充技术方案 其中纳米级m i p 粒子作为添加剂 a 注入纳米m i p 粒子塞 b 进样 c 当电压稳定后 m i p 纳米粒子 不发生改变 m i p 纳米粒子向阳极移动 被分析物 相对发生变化 向阴极移动 e o f 也向阴极移动 d 被 分析物流过纳米粒子塞并被分离 e 被分析物先于m i p 塞到达检测器 1 0 天津医科大学硕士学位论文 毒 耋 图4 微乳聚合制备m i p 纳米粒子的c e c 分析 a r a c 一心得安 b s 一心得安的印迹效果和识别峰 纳米粒子水溶液 1 0m g m l 在o 5p s i 下进样1 0s 样品在6k v 电压下进样38 磷酸盐电解液佗o v v 乙腈 p h7 0 分离电 压1 6k v 柱温3 0o c 整体柱 顾名思意 整体柱是柱中连续的 多孔的柱状固定相 不像其他方法 这 种柱子的固定相是在毛细管中的原位进行聚合的 这样就避免了费力的填充过 程和塞子的制备 同样也省略了后来的粉碎和筛分的步骤 该技术优点如下 一 该柱制备方法简单 只需将单体 交联剂 致孔剂和引发剂等混合物装入 空色谱柱内 聚合完成后即可 二 由于可在聚合时引入各种所需的作用基团 因而制备具有灵活性 三 与常规装填的色谱柱相比 整体色谱柱最大的特点 是具有良好的多孔性和渗透性 具有灌注色谱的特点 整体柱中既有流动相的 流通孔 接近1 9 r a 又有便于溶质进行传质的中孔 几十个纳米 而且柱中的 微孔已经短到不对传质构成明显的阻力 流通孔内的线速度正比于柱子中流动 相的速度 这种结构可使分子在其内的传质 由通常的较慢的扩散传质 变成 较快的对流传质 因此 整体柱技术与分子印迹相结合 可改善m i p 的慢传质 问题 n i l s s o n 等人 6 5 首先报道了用于c e c 的m i p s 原位整体柱 尽管得到的整体 柱上r a c 苯丙氨酸苯胺高达1 5 0 0 0 0p l a t e s m 但无法对r a c 一苯丙氨酸实现对映异 构体拆分 这可能是由于像环己醇和1 十二醇这样的极性溶剂导致的 因为这 寒蠢耋 天津医科大学硕士学位论文 些溶剂会干扰模板分子和单体之间的氢键 l i n 及其合作者 6 6 6 7 通过使用亚硫酰 氯和格氏试剂处理过的乙烯基化的毛细管 并用这种毛细管制备了以卜苯丙氨 酸苯胺为模板的m i p c e c 柱 但这种整体柱仍然有柱效低 阻力大的缺点 因 此 要逐步增加电场进行电泳使电解液逐渐替换掉聚合液 这种柱在电色谱操 作中一旦形成气泡 那么将无法进行再生 因此这种方案在实际中很难应用 最成功的印迹电色谱整体柱是由s c h w e i t z 等人嘟 发展的 该柱有大的贯通 孔 因此允许在低压下进行冲洗 柱子的再生以及反应液和电解液之间的交换 更加容易 可有效地进行对映异构体的手性分离 分离度分别为r s 1 2 6 和 1 1 7 并且能进行外消旋化合物的定量分析 该法的成功吸引了很多研究者 目前印迹电色谱整体柱主要是在这种方法的基础上不断发展的 涂层柱 这种m 口柱是以原位合成方式在毛细管内壁上共价键结合一薄层m i p 6 0 6 1 l 这一方式的优点是毛细管柱的制备比较简单 具有较高的柱效 但同时也存在 样品容量较低的缺点 由此给检测带来一定的困难 另外 采用的毛细管柱 1 9 0 c m 较长 又由于通过内表面涂层引起e o f 的损失 而使迁移时间增长 优点是 由于柱内没有阻力 因此容易再生 不易堵塞 也无需担心c e c 运行中的气泡 问题 第一个做这方面工作的是b r f i g g e r m a n n 等人 6 9 他们通过共价键将m i p 涂布在经过甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷处理过内表面的毛细管中 在6 5 下反应4 8h 热引发聚合制备得到了1 0 0 阻涂层毛细管柱 通过调整交联剂和 制孔剂的浓度等聚合条件 可以控制m m 涂层的厚度 t a n 等人 7 0 摸索出了另 一种在2 5 岬毛细管中合成m 口涂层的方法 在处理过毛细管内表面后 将预 聚合混合物填充在毛细管内 在7 5 下进行聚合反应 然后将毛细管的一端连 接在一个真空泵上 使未反应的反应物抽出 使反应的聚合物成为薄膜 使用 这种方法制备的柱子 可以成功分离丹磺酰苯基丙氨酸的对映异构体 s c h w e i t z 等 7 l 近来报道了一种利用接枝的方法制备涂层m 口 该方法先将毛细管内壁衍 生化 室温下在缓冲液中使引发剂与内壁衍生化试剂共价结合 含孓萘心胺的 单体溶液通入毛细管 光引发聚合3h 后 即可在电泳仪上冲洗使用 该法制备 简单 可用以进行迅速的m p 筛分 他们发现分别用三种不同的溶剂甲苯 二 氯甲烷和乙腈 生成的聚合物膜的形态和表面都有很明显的区别 手性识别能 1 2 天津医科大学硕士学位论文 力差别较大 见图5 图5 用不同溶剂制备的m 口涂层分离r a c j 凸得安 a 甲苯 a 氯甲烷 c 乙腈 毛细管直径5 0 岫 长3 5c m 有效长度2 6 5c m 分离 1 5k v 温度 6 0 分离顺序 一i 得安 俾 心得安 c e c 操作电压1 5k v 压力1 2b a r 电解液组成为乙腈 乙酸盐 p h 3 0 2 m 8 0 2 0 紫外检测波长2 1 5n n l 研究目的 方法 电色谱作为一种新型高效的微分离技术 具有非常美好的发展前景 电色 谱核心部件是色谱柱的问题 毛细管涂层柱由于制备简易 坚固耐用不易损坏 理论塔板数高 不容易产生气泡和易再生的特点 使其成为非常有前途的新型 色谱固定相 分子印迹是合成具有预选择性固定相的新兴技术 它对于研究酶的结构 认识受体 抗体作用机理及在分析化学等方面有重要的意义 该技术用于色谱固 定相可进行手性分离 但其色谱行为较差 峰展宽和拖尾现象较严重 主要因 为h p l c m i p 的柱效太低的缘故 这不仅导致较长的分离时间 而且也给定性 和定量分析带来了困难 电色谱具有比h p l c 更高的效率 因此c e c 与m p 的 天津医科大学硕士学位论文 结合是c e c 的高效率及m m 的高选择性集成 更有助于充分发挥各自的特点 是当前的前沿课题之一 c e c m 口的研究正处在发展阶段 尚缺乏系统深入的研究 与其他成熟的 分离手段相比 其类型尚不够丰富 还不能满足实际工作中分离复杂体系的需 要 因此 结合国家自然科学基金资助项目 本课题在该方向进行了以下两方 面的研究工作 一 利用原位热引发聚合的方法 一步反应合成了正佐匹克隆印迹涂层柱 在毛细管电色谱分离模式下 系统考察了合成条件以及电色谱操作参数对分子 识别和手性分离的影响 实验中我们考察了一种由传统甲苯 异辛烷体系改良而 来的新致孔剂体系 甲苯 异辛烷 二甲基亚砜 较好的解决了极性分子难溶与 传统致孔剂体系的问题 并考察了这种新的致孔剂体系对分子印迹聚合物手性 识别能力的影响 另外我们初步考察了功能单体与印迹分子的比例 反应时间 溶剂类型等对手性分离的影响 并系统考察了各种电色谱条件 如p h 值 乙腈 含量 盐浓度 电压及温度等因素对分子识别和手性分离度的影响 在优化的 电色谱条件下 实现了佐匹克隆对映异构体的基线分离 r s 5 3 9 印迹分子的 柱效可达到2 1 4 0 0p l a t e s m 二 以具有交联剂功能的新型单体一单体为基础 在毛细管内采用原位热 引发方式 探索了一单体 两 萘普生印迹涂层柱的合成条件 并以电色谱模式表 征其手性分离性能 与以前的m a a e d m a 二单体印迹体系比较发现 两种体 系的电渗流产生机制以及电色谱条件对于两种体系的影响并不完全相同 新型 一单体涂层柱的分离时间与m a a e d m a 二单体体系相当 但选择性提高 分 离度也从过去的1 5 增加到5 6 6 而且还简化了实验的设计工作 显示了一单体 涂层柱的优越性 1 4 天津医科大学硕士学位论文一 萨佐匹克隆印迹涂层柱的制备以及电色谱研究 一 d 一佐匹克隆印迹涂层柱的制备以及电色谱研究 分子印迹电色谱涂层柱由于其独特的优点 是当前电色谱研究的前沿课题 之一 m 口涂层柱是以